CC BY
12
nal of General Physiology, 128 (3), 261-272. doi: 10.1085/ jgp.200609547
88. Sheikh, F., Ouyang, K., Campbell, S. G., Lyon, R. C., Chuang, J., Fitzsimons, D. et. al (2012). Mouse and computational models link Mlc2v dephosphorylation to altered myosin kinetics in early cardiac disease. Journal of Clinical Investigation, 122 (4), 1209-1221. doi: 10.1172/jci61134
89. Zhu, S.-G., Kukreja, R. C., Das, A., Chen, Q., Lesnef-sky, E. J., Xi, L. (2011). Dietary Nitrate Supplementation Protects Against Doxorubicin-Induced Cardiomyopathy by Improving Mitochondrial Function. Journal of the American College of Cardiology, 57 (21), 2181-2189. doi: 10.1016/j.jacc.2011.01.024
90. Xi, L., Zhu, S.-G., Das, A., Chen, Q., Durrant, D., Hobbs, D. C. et. al (2012). Dietary inorganic nitrate alleviates doxorubicin cardiotoxicity: Mechanisms and implications. Nitric Oxide, 26 (4), 274-284. doi: 10.1016/j.niox.2012.03.006
91. Lipshultz, S. E. (1996). Dexrazoxane for protection against cardiotoxic effects of anthracyclines in children. J Clin Oncol, 14 (2), 328-331.
92. Lipshultz, S. E., Rifai, N., Dalton, V. M., Levy, D. E., Silverman, L. B., Lipsitz, S. R. et. al (2004). The Effect of Dexra-zoxane on Myocardial Injury in Doxorubicin-Treated Children with Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine, 351 (2), 145-153. doi: 10.1056/nejmoa035153
93. Lipshultz, S. E., Scully, R. E., Lipsitz, S. R., Sallan, S. E., Silverman, L. B., Miller, T. L. et. al (2010). Assessment of dexrazoxane as a cardioprotectant in doxorubicin-treated children with high-risk acute lymphoblastic leukaemia: long-term follow-up of a prospective, randomised, multicentre trial. The Lancet Oncology, 11 (10), 950-961. doi: 10.1016/ s1470-2045(10)70204-7
94. Lyu, Y. L., Kerrigan, J. E., Lin, C.-P., Azarova, A. M., Tsai, Y.-C., Ban, Y., Liu, L. F. (2007). Topoisomerase II Mediated DNA Double-Strand Breaks: Implications in Doxorubicin Cardio-toxicity and Prevention by Dexrazoxane. Cancer Research, 67 (18), 8839-8846. doi: 10.1158/0008-5472.can-07-1649
95. US Food and Drug Administration. Available at: http://www.fda.gov/drugs/drugsafety/ucm263729.htm
Дата надходження рукопису 22.03.2016
Шженковська 1рина Володимирiвна, доктор медичних наук, професор, зашдувач кафедри, кафедра фармацевтично!, 6юлопчно! та токсиколопчно! х1ми, Нацюнальний медичний унiверситет iменi О. О. Бо-гомольця, бул. Т. Шевченка, 13, м. Ки!в, Украша, 01601
Нароха Вшлетта Петрiвна, асистент, кафедра фармацевтично^ 6юлопчно! та токсиколопчно! х1мп, Нацiональний медичний унiверситет iменi О. О. Богомольця, бул. Т. Шевченка, 13, м. Ки!в, Украша, 01601
Бакун Анастасiя Вггалп'вна, лаборант, кафедра фармацевтично!, бюлопчно! та токсиколопчно! х1мп, Нацюнальний медичний ушверситет iменi О. О. Богомольця, бул. Т. Шевченка, 13, м. Кш'в, Украша, 01601
УДК 579.61
DOI: 10.15587/2313-8416.2016.67577
ТЕХНОЛОГ1Я ОТРИМАННЯ БАКТЕР1АЛЬНОГО СИНБ1ОТИЧНОГО ПРЕПАРАТУ © О. С. Хижняк
Мета: з метою розширення спектру втчизняних синбютичних препаратгв, нами було розроблено тех-нологю отримання комплексного бактергального препарату та методики контролю його якостг. Методи: для створення препарату високог ефективностг проведено визначення симбютичного типу взаемодИ бактерш, що входять до його складу. Враховуючи 1ндив1дуальн1сть кожного штаму у вимогах до нутргентгв поживного середовища обрано оптимальний склад останнього, який дозволяе проводити одночасне глибинне культивування штамгв бактерш 1з збереженням морфологгчних ознак та активнос-т1 кожного штаму. Встановлення фгзико-технологгчних параметргв культивування враховуе експонен-цшну фазу росту бактерш i дозволяе пгдтримувати активт показники росту. Для пгдвищення показни-к1в росту бактерш внесено пребiотичний компонент, що мае однаково високий бiфiдо- i лактогенний ефекти.
Результати: розроблено технологт отримання комплексного пробютичного препарату та методи контролю якостi на препарат.
Висновки: результати проведених експериментiв стосовно контролю якостi розробленого препарату на до^дах in vitro та in vivo тдтверджують вiдповiднiсть отриманого препарату вимогам якостi та безпечностi
Ключовi слова: бiфiдобактерií, лактобацили, лактитол, консорцум, симбiоз, синбютик, сумiсне глибинне культивування, активнкть кислотоутворення, бактерiальний препарат
Aim. To increase the range of synbioltic drugs, technology for the complex bacterial drug production and methods for its quality control were developed.
Methods. For the high-effective remedy development, determination of type of bacteria symbiotic relationship in its composition was carried out. Considering the individuality of each strain in their requirements for nutrients in growth medium, its optimal composition was selected, which allows to carry out simultaneous deep cultivation of bacteria strains, maintaining both morphological features and activity of each strain. Determination of physical and technological cultivation parameters considers the bacteria exponential growth phase and allows maintaining active growth parameters. To improve the bacteria growth parameters, a prebiotic component, having equally high bifidobacteria and lactogenic effects, was included.
Results. Technology of the complex remedy production and its quality control methods were developed. Conclusion. The obtained results in relation to the developed remedy quality control in experiments in vitro and in vivo confirm the compliance of the obtained drug to quality and safety requirements
Keywords: bifidobacteria, lactobacillus, lactitol, consortium, symbiosis, synbiotic, simultaneous deep cultivation, acid production activity, bacterial drug
1. Вступ
Оргашзм людини та його природна мшрофло-ра - це едина еколопчна система, яка характеризу-еться здатшстю до саморегуляцп та пов'язана склад-ними мехашзмами безперервно! взаемоди окремих компоненпв всередиш системи, а також цшсно! сис-теми з навколишшм середовищем. З метою покра-щення стану мшрофлори людини та розширення спектру впчизняних лшарсько-профшактичних засоб1в бактер1ального походження необидно провести роз-робку нових форм та склад1в пробютичних препарапв.
Активна пропаганда здорового способу життя та ввдсутшсть часу для рацюнального харчування, застосування бюлопчно активних добавок (БАД) та неконтрольоване використання антибютишв е перед-умовою зростання попиту на пробютичш препарати лшувально-профшактично! до, або БАД на !х основа
2. Постановка проблеми в загальному ви-глядi, актуальнiсть теми та li зв'язок з важливими науковими чи практичними питаннями
Проведения маркетингового дослвдження ринку, анал1з лгтературних даних показав, що на сучас-ному етат розвитку вичизияного виробництва бак-тер1альних препарапв, препарати укра!нського виробництва займають незначну шшу серед велико! шль-косл закордонних продукпв лшувального чи профь лактичного призначення. Для створення пробютичних препарапв широко використовуються найпоши-рен1ш1 групи м1кроорган1зм1в - б1фвдобактери (рд Bifidumbacterium) та лактобацили (рад Lactobacillus), а особливо !х комбшаци отримаш змшуванням окремих штам1в, осшльки вони впливають на р1зн1 локуси слизово! кишечнику. Однак, для створення бактер1ального препарату недостатньо використання притаманних оргашзму бактерш, необхвдно встано-вити, що !х одночасне вщновлення у ентеральному середовищ1 не призведе до конкуренцп за поживш речовини, локуси адгези та не матиме негативного впливу одне на одного. Нами запропоновано застосо-вувати метод сумюного глибинного культивування, з метою проведення анал1зу м1жштамово! взаемоди (симбютичного ефекту) м1кроорган1зм1в в умовах in vitro [1], осшльки ефектившсть бактер1альних препарапв визначаеться не лише сукупшстю бюлопчних властивостей пробютичних штам1в, що входять до його складу, а й р1внем симбютично! взаемоди.
Кр1м того, слад зазначити, що потрапляючи до ентерального середовища бактер1ям для нормального функцюнування потр1бн1 поживш компоненти, що робить доцшьним внесення пребютичного компоненту. Створення синбютичного препарату з високою актившстю бактерш, що входять до його складу тд-вищить конкурентоспроможшсть вгтчизняного ринку пробютичних засоб1в профшактики i лшування за-хворювань шлунково-кишкового тракту (ШКТ) рiз-но! етюлогп.
Нами розроблено i запропоновано технологш отримання комплексного синбютичного препарату л^вально-профшактично! дИ" на основi пробютич-них штамiв бiфiдобактерiй Bifidumbacterium bifidum ЛВА-3 та лактобацил Lactobacillus plantarum 8R-A3 з додаваииям пребютичного компоненту лактитолу.
3. Аналiз останшх досл1джень i публiкацiй, в яких почато ршення вказано! проблеми i на якi посилаеться автор
При розробщ бактерiальних препаратiв авторами застосовуеться багато шлях1в для !х вдоскона-лення. Так, розробники одним iз шляхiв пiдвищения ефективностi обирають багатовидовий склад препарату, не враховуючи того, що рацюнальний шдхвд до створення ефективного бактерiального препарату повинен бути заснований на максимальнш спорвдне-ностi до бiоценозу людини, який включае i лактобацили також. Бактершш препарати отримують також шляхом окремого культивування та висушування кожного штаму, з подальшим змiшуваниям сухих бiомас бактерiй та допом1жних речовин [2]. Таке тех-нологiчне рiшения не дае можливосп отримания ефективного консорцiуму бактерш з високими показни-ками активност!, а лише мiстить рiзнi штами бага^а-льних культур, як1 притаманш органiзму людини.
Тому, вдосконалення технологи бактершних препаратiв для створения продукту максимально! ефективносп е важливим i необхвдним завданиям.
4. Видiлення не виршених рашше частин загально! проблеми, яким присвячена стаття
Для розробки ефективного лшарсько-профша-ктичного засобу необхвдно визначити штами бакте-рiй, що входять до його складу, довести симбютич-ний тип !х взаемоди; розробити поживне середовище, що ввдповщае всiм ростовим вимогам використаних
штам1в i довести можливють сумюного глибинного культивування бактерiй на розробленому поживному середовищi. Пiдтвердити ефективнiсть препарату на дослщах in vitro та розробити методики контролю.
5. Формування цшей (задач) статт
Для вирiшення зазначено! проблеми необх1дно провести дослщження за такими напрямками:
1) розробка складу поживного середовища для сумюного глибинного культивування пробiотичних штамiв бактерш;
2) визначення штамiв бактерiй для формування складу бага^ального препарату;
3) аналiз морфологiчних характеристик та бю-логiчних властивостей використаних шташв при сумь сному культивуваннi на запропонованому середовищi;
4) визначення оптимального складу пробюти-чних штамiв для сумюного культивування (ствввд-ношення та кшьшсть генерацiй);
5) дослвдження технолопчних параметрiв культивування (рН, час, температура, та ш.);
6) дослвдження та вибiр пребiотичного компоненту, його оптимально! концентрацп;
7) дослвдження in vitro та in vivo ефективносл отриманого комплексного синбiотичного препарату;
8) розробка та опрацювання методик контролю якосл препарату.
6. Виклад матерiалу дослщження (методiв та об'сктш) Í3 обгрунтуванням отриманих результат
Одним з основних факторiв, як1 визначають як1сть препаратiв, е стандартнiсть поживно! цiнностi !х виробничих середовищ культивування. Для культивування пробютичних шташв регламентоваш складнi поживнi середовища: гiдролiзати та екстрак-ти молока, казе!ну, печiнки, пекарських дрiжджiв та м'язiв. Результати лiтературних даних свiдчать, що вказаш середовища мiстять повний набiр iз 19 амшо-кислот. Вщповщно лiтературним даним [3-5], джере-лом амшокислот, факторiв росту, вiтамiнiв е дрiжджi; джерелом пептонiв, мiнеральних речовин е гiдролiзат казе!ну. В лггератур^ у якостi дрiжджового компоненту використовуеться дрiжджовий екстракт, дрiж-джова вода, автолiзат дрiжджiв або кислотний чи ферментативний гiдролiзат др1ждж1в. Казе!н у склад поживного середовища входить у виглядi гiдролiзатiв, отриманих кислотним чи ферментативним гiдролiзом.
Вмiст амшного азоту (Nm) у середовищi у рiз-них авторiв вiдрiзняеться i знаходиться у межах 90200 мг %, що сввдчить про нестандартшсть отриманих компонентiв; !х використання у складi поживного середовища у рiзних спiввiдношеннях; необхщ-нiсть розробки складу поживного середовища в кожному конкретному випадку [4]. Стандартизащя поживного середовища ввдповвдно ростовим вимогам бактерiй - завдання кожного дослiдника, особливо враховуючи той факт, що проведеш нами дослщжен-ня спрямованi на розробку технологи для культивування сумюно! культури (консорцiуму).
Нами запропоновано використовувати компо-ненти поживного середовища, що пройшли ультра-фiльтрацiйну обробку через мембрани (30-50 кДа).
Проведення вказаного процесу дозволить очистити поживне середовище ввд високомолекулярних пепти-дiв та бiлкiв. Ультрафiльтрацiя дозволяе роздшити сумiш речовин з рiзною молекулярною масою. Про-цес проводиться тд тиском через мембрани, що ма-ють певнi розмiри пор. Ми пропонуемо технолопч-ний процес проведення ультрафшьтраци дажджово-го компоненту i гiдролiзату казе!ну. Перевагами цьо-го методу е можливють фiльтрацi! промислових об'емiв компонентiв поживних середовищ. При про-веденнi процесу необхвдно контролювати швидк1сть фiльтрацi!, температуру - для збереження факторiв росту в дрiжджових компонентах, необхiдну концен-трацiю компонента.
Фшьтрацш дрiжджових компонентiв ми пропонуемо проводити при температурi (8-15) °С, необ-х1дну концентрацiю тдтримували протягом всього процесу ультрафiльтрацi!. Зниження температури нижче 8 °С приводить до зменшення швидкостi фшь-трацп, а температура вище 15 °С супроводжуеться iнтенсивним утворенням пограничного шару, що приводить до необхвдносп частого застосування «реверсу» i регенераци мембран. Беззаперечно, важли-вою е можливють додатково! стерилiзуючо! фшьтра-ци розчинiв через ультрафiльтрацiйнi мембрани, так як розмiр пор мембрани дозволяе ввдокремити мшро-бну контамiнацiю. Дал1 дрiжджовий компонент середовища проходить стерил1зуючу фiльтрацiю через мембрани з розмiром пор 0.45 та 0.22 мкм. При так1й обробцi, фактори росту поживного середовища не проходять теплову обробку. Необхвдно додати, що зазначеш мембрани мають мiнiмальну адсорбцшну активнiсть, досить легко регенеруються i можуть бути використанi багаторазово, а процес мае не знач-ну енергоемнiсть.
Проте, ефективнiсть фракцiонування ультра-фiльтрацiею може знижуватися за рахунок впливу ряду факторiв: взаемодiя макромолекул з утворенням пограничного шару тдвищено! концентрацп на межi роздiлу м1ж мембраною та розчином, що фшьтрують; взаемодiя системи «мембрана - розчинена речовина». Утворення пограничного шару обумовлене концент-рацiйною поляризацiею, яка утворюеться за рахунок значно! втрати розчинника з розчину на межi його розд^ з мембраною. Внасл1док взаемодп системи «розчинена речовина - мембрана» цей пограничний шар, у випадку високо! концентрацi! дрiжджового компоненту, може бути незворотшм i утворити шар гелю, який змшюе поверхню мембрани. Завдяки тан-генцiальному потоку i його «змиваючш» сил1, моле-кули бiлка та iншi речовини, що оали на мембранi, можуть мати приблизно однакову орiентацiю. Саме тангенцiальний потж швелюе трансмембранний по-тiк молекул розчинено! речовини. Щд час роботи апарапв, максимальний робочий тиск не повинен перевищувати 0.2 мПа. Для попередження утворення пограничного шару i зниження швидкостi фiльтрацi!, пропонуемо ввдокремлювати дебрiс клiтин центри-фугуванням чи декантащею. Очищений таким чином гiдролiзат казе!ну стерил1зували в автоклавi.
Нами проведено дослвдження по визначенню оптимального складу поживного середовища. Стан-
дартизовано значения амшного азоту, вмiст основних ростових компонента - джерел азоту амшокислот, вiтамiнiв, факторiв росту - дрiжджового автолiзату iз значенням амшного азоту - 130±20 мг % та ферментативного гiдролiзату казешу iз значення амiнного азоту 600±40 мг %.
Продуктивнiсть поживних середовищ перевь ряли по активностi кислотоутворення бiфiдобактерiй, культивованих на експериментальних варiантах при температурi (38±0.5) °С протягом 72 годин [6]. Доведено можливкть культивування лактобацил на запро-
понованому вар1ант1 поживного середовища за умови внесения необхвдних м1кро- та макроелеменпв [6].
З метою визначення пробютичних штам1в бактерш для створення лжарсько-профшактичного засо-бу, було проведено глибинне культивування на роз-робленому казешово-дажджовому середовищ1 (КД) наступних штам1в бактерш: Bifidumbacterium bifidum ЛВА-3, Bifidumbacterium longum, Bifidobacterium ado-lescentis, Lactobacillus plantarum 8R-A3, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus. Значення показнишв активностт культури представленi в табл. 1.
Таблиця 1
Характеристика бiологiчноï активностi рiзних консорцiумiв бактерiй
№ зразку Штами Bifidumbacterium Штами Lactobacillus Актившсть кислото-утворення, 0Т
1 B. bifidum ЛВА-3 L.casei 318±44
2 B. longum L.casei 315±30
3 B.adolescentis L.casei 293±22
4 В. bifidum ЛВА-3 L.plantarum 8R-A3 383±45
5 В. longum L.plantarum 8R-A3 320±30
6 B.adolescentis L.plantarum 8R-A3 307±24
7 B. bifidum ЛВА-3 L.acidophilus 278±18
8 B. longum L.acidophilus 295±25
9 B.adolescentis L.acidophilus 248±20
*Примтка N=3
Як видно з табл. 1, найб№ш висок показники активносп культури спостерiгалися при сумiсному культивуваиш бiфiдобактерiй штаму B. bifidum ЛВА-3 з лактобацилами штамiв L.plantarum 8R-A3 та L. casei. На основi проведеного експеримеиту, для подальшо! роботи обираемо культури бiфiдобактерiй штаму Bifidumbacterium bifidum ЛВА-3 та лактобацил штаму Lactobacillus plantarum 8R-A3.
З технолопчно! точки зору важливим е те, що бактерп штаму B. bifidum ЛВА-3 е строгими анаеро-бами, ростуть при ввдсутносл кисню; бактерп штаму L.Plantarum 8Р-А3 - факультативний аиаероб, бакте-рi! ростуть в атмосферi вуглекислого газу, азоту, а також в присутносп кисию. Можливють продуктивного сумiсного культивування бiфiдобактерiй та лактоба-
цил зумовлена: по-перше, тим, що у процесi метаболз-му лактобацили поглинають кисень, розчинений у по-живному середовищi, створюючи тим самим сприятли-вi умови для росту бiфiдобактерiй; по-друге, у процеа метаболiзму бiфiдобактерiï синтезують вшьт амшокис-лоти, якi стимулюють рют лактобацил. Завдяки рiзному вiдношению до кисню, бактерп препарату можуть за-ймати рiзнi локуси у ентеральному середовищi. Врахо-вуючи зазначенi факти, робимо припущення про ефек-тивний симбiоз обраних штамiв. Для визначення оптимального рiвня генерацiй (досягнення експонен-цiйноï фази росту) обраних штамiв B. bifidum ЛВА-3 i L.Plantarum 8Р-А3 та ствввдношення поавного матерь алу у iнокулятi було проведено поав культур за насту-пною схемою (табл. 2).
Таблиця 2
Сшввщношення посiвного матерiалу у шокуляп
№ зразку Бiфiдобактерiï Лактобацили Сшввщно-шення
Об'ем, мл К-сть бактерш КУО/мл № генерацп Об'ем, мл К-сть бактерш КУО/мл № генерацiï
1 2.5 107 2 2.5 107 5 1 : 1
2 1.25 107 2 3.75 107 5 1 : 3
3 3.75 107 2 1.25 107 5 3 : 1
4 - - 2.5 107 5 -
5 2.5 107 2 - - -
6 2.5 107 2 2.5 107 6 1 : 1
7 1.25 107 2 3.75 107 6 1 : 3
8 3.75 107 2 1.25 107 6 3 : 1
9 - - 2.5 107 6 -
10 2.5 107 2 - -
Для тдтвердження можливосп сумiсного культивування бiфiдобактерiй та лактобацил на визна-ченому поживному середовищi та симбютичного типу взаемодi! необхвдно доследити iнтенсивнiсть накопичення бiомаси: визначити кшьшсть живих бактерiй, активнiсть кислотоутворення, оптичну гус-тину зразк1в та провести мжроскошю отриманих зра-зкiв. Результати доследження, отриманi у трикратнiй повторносп мають висок1 показники i тдтверджують припущення симбiотичного типу взаемодi! [6].
Велике значення для продуктивного культивування та максимального накопичення бюмаси мае комплекс фiзичних i фiзико-хiмiчних факторiв (рь вень рН, температура, концентращя кисню). Вiдомо, що оптимальними умовами для росту i накопичення бюмаси бiфiдобактерiй е рН середовища (6.5±0.1), температура культивування (38±0.5) °С, а для лак-
Нами експериментально встановлено, що за-пропонований режим культивування i склад поживного середовища дозволяють одночасно в одному об'eмi культивувати бiфiдобактерiï та лактобацили 3i збереженням основних морфолопчних та бiологiчних показникiв. Змiна температури i корегування рН про-тягом двох дiб культивування дозволило зб№шити рiвень кислотоутворення на 5-7 %; шлькють живих бактерiй залишилась незмшною; морфологiчнi характеристики культур стабшьт та вiдповiдають вста-новленим характеристикам.
Для визначення пребютичного компоненту, що одночасно мае високу лактогенну i бiфiдогенну дш було проведено ряд експериментiв використову-ючи рiзнi джерела цукрiв - фруктозу, шулш, лакту-лозу i лактитол [7]. В результата проведених дослiдiв встановлено, що культивування штамiв бiфiдобакте-рiй B. bifidum ЛВА-3 та лактобацил L.Plantarum 8R-A3 в умовах in vitro, з додаванням у якостi пребютичного компоненту лактитолу, мае ведмшш показники росту i рiвень накопичення бюмаси, та по сво!м ос-новним показникам не поступаеться найбшьш поши-реному пребiотичному компоненту - лактулозг Та-кож доведена можливють використання лактитолу у якостi пребютичного компоненту при сумюному ку-льтивуванш штамiв бiфiдобактерiй B. bifidum ЛВА-3 та лактобацил L.Plantarum 8R-A3 в умовах in vitro, та встановлена його необхедна i достатня концентращя, що становить (1±0.1) %. Вибiр лактитолу в якостi пребiотичного компоненту засновано на рiвномiрнiй бiфiдо- i лактогеннш дiï [7].
Дослвдження умов сумюного культивування вказаних штамiв дозволяе запропонувати таку техно-логiю виготовлення препарату:
1) подготовка поживних середовищ, основних та допомiжних розчинiв;
тобацил - рН середовища (7.0±0.1), температура культивування (37±0.5) °С. Також след прийняти до уваги той факт, що бiфiдобактерi! у процесi росту видмють невелику кiлькiсть кисню, яка необхедна для росту лактобацил. Тому, для максимального накопичення бiомаси пiд час культивування комбшо-вано! бактерiально! культури на розробленому поживному середовищi нами запропоновано на першу добу росту створити умови, характерш для бiфi-добактерiй, а по досягненню ними експоненцiйно! фази росту (на другу добу), оптимальш параметри росту для лактобацил: рН середовища на початково-му етапi (6.5±0.1); впродовж культивування (48 годин) рН перевiряли i корегували 10 % розчином амiаку до рН (7.0±0.1). Температура культивування протягом першо! доби становила (38±0.5) °С, протя-гом друго! доби (37±0.5) °С (табл. 3).
2) отримання маточно! культури бiфедобaкте-рiй штаму B.bifidum ЛВА-3 II генераци та лактобацил штаму L.Plantarum 8Р-А3 V генераци;
3) виробничий поав вказаних культур на по-живне середовище для сумюного культивування у встановленому спiввiдношеннi;
4) сумюне глибинне культивування бiфедобaк-терш та лактобацил;
5) додавання середовища стабшзацп;
6) розлив;
7) контроль редкого синбiотичного консорциуму;
8) маркування;
9) контроль готового препарату перед випуском.
Ведповедно розробленiй технологи, отримано
препарат наступного складу: не менше 1011 бiфiдоба-ктерiй штаму Bifidobacterium bifidum ЛВА-3, не менше 1010 лактобацил штаму Lactobacillus plantarum 8Р-А3, лактитол 1±0.1 %.
Поав кожно! генераци контролюють на чистоту шляхом виаву 1 мл культури на пробiрки 3i ско-шеним поживним агаром з 9 % натрш хлориду та середовища Сабуро. На пробiркaх не повинно бути росту сторонньо! мiкрофлори та грибiв.
У контрольнiй пробi редкого препарату визна-чають: стерильнiсть (ведсутнють росту сторонньо! мiкрофлори i грибiв на агарових середовищах); рН; каламутнють мжробно! зaвисi (40-80 од. мутносп по ОСО).
Препарат до та тсля розливу педлягае контролю за вама зазначеними фiзичними та бюлопчними показниками - мiкробiологiчнa чистота [8], бактерюс-копiчний контроль (ведповедно технологи забарвлення мазк1в за Грамом), кедькють живих бaктерiй кожного штаму, активнють кислотоутворення [8], антагонюти-чна aктивнiсть [9], специфiчнa нешкiдливiсть [8], адгезивна активнють [10-12], безпечнють [13].
Таблиця 3
Оптимальнi умови росту бiфiдобактерiй та лактобацил при окремому i глибинному культивуваннi
Фактори Bifidumbacterium bifidum ЛВА-3 Lactobacillus plantarum 8R-A3 Сумiсна бактерiальна культура
1-ша доба 2-га доба
рН 6.5±0.1 7.0±0.1 6.5±0.1 7.0±0.1
Температура, oC 38±0.5 37±0.5 38±0.5 37±0.5
Проведено дослщження стаб№носп рщко! форми, яка визначена на рiвнi 4-5 мюящв. Тривале збереження рвдко! форми бактерiального синбютич-ного консорцiуму, за межами визначеного термшу придатносп, призводить до поступових втрат актив-ностi i, як наслвдок, лiкарського потенцiалу рвдко! форми препарату. Таким чином, наш подальшi досль джения спрямоваш на розробку технологi! лiофiлiзацi! з метою стабшзацп бактерiального препарату. Люфь лiзоваиий препарат дозволив нам розробити нову кап-сульну форму баш^ального консорцiуму [14].
7. Висновки з проведеного дослщження та перспективи подальшого розвитку вказаного на-прямку
Проведено дослщження по визначенню оптимального складу та технологи одержания поживного середовища для сумюного глибинного культивування вщбраних штамiв бактерiй.
Дослвджено основнi показники росту комбша-цiй рiзних штамiв пробiотичних бактерiй, обрано штами для створения пробiотичного препарату.
Визначено техиолопчш умови культивування (к1льк1сть генерацiй, сшввщношення бактерiй у шо-кулятi, температура, рН, тривалють культивування).
Експериментально обгрунтовано вибiр лакти-толу, як пребютичного компоненту, що мае бiфiдо-та лактогенну дш.
Розроблено технологiю отримания синбютич-ного препарату. Дослiджено стабшьшсть та визначено методи контролю якосп готово! лiкарсько! форми.
Л^ература
1. Глушанова, Н. А. Взаимоотношения пробиотиче-ских и индигенных лактобацилл в условиях совместного культививрования in vitro [Текст] / Н. А. Глушанова, Б. А. Шендеров // Журнал микроб., эпидемиол., и иммунобиол. -2005. - № 2. - С. 56-61.
2. Пат. РФ 2257408. «Лечебно-профилактический биопрепарат на основе сухой биомассы бифидо- и лакто-бактерий, биологически активная добавка к пище на основе сухой биомассы бифидо- и лактобактерий, сухая биомасса бифидо- и лактобактерий и способ ее получения» [Текст]. - 2003136785/13; заявл. 22.12.2003 г.; опубл. 27.07.2005 г.
3. Зубарева, И. М. Разработка глубинных питательных сред в производстве биоспорина [Текст] / И. М. Зубарева, И. С. Федорова, А. В. Зубова // Вопросы химии и химической технологии. - 2004. - № 1. - С. 85-88.
4. Краснопольский, Ю. М. Пробиотики в составе биологических диетических добавок [Текст] / Ю. М. Краснопольский // БАД-эксперт. - 2009. - № 1. - С. 18-22.
5. Семченко, А. В. Совершенствование способа получения пробиотических препаратов [Текст] / А. В. Семченко, А. В. Казьянин, Е. В. Орлова, В. А. Несчисляев // Фундаментальные исследования. - 2007. - № 12. - С. 350-351.
6. Хижняк, О. С. Бютехнолопчш аспекти отримання комплексного препарату, який мютить рiзнi штами пробютичних культур [Текст] / О. С. Хижняк, Ю. М. Краснополь-ський // Вюник Нацюнального техшчного уншерситету «Харювськпй полгтехшчний шститут». Технолопя органь чних i неоргашчних речовин i екологш. - Харкв: НТУ «ХП1». - 2013. - № 4. - С. 113-120.
7. Хижняк, О. С. Визначення пробютичних властиво-стей замшника цукру лактитолу в умовах in vitro [Текст] / О. С. Хижняк // Вюник НТУ "ХП1". Серш: Новi ршення в
сучасних технологах. - Х.: НТУ "ХПГ, 2014. - № 26 (1069). -С. 140-148.
8. Краснопольский, Ю. М. Фармацевтическая биотехнология. Технология производства иммунобиологических препаратов [Текст]: учеб. пособие / Ю. М. Краснопольский, М. И. Борщевская. - Харьков: НТУ «ХПИ», 2009. - 352 с.
9. Ашмарин, В. П. Статистичш методи в мжробю-лопчних дослвдженнях [Текст] / В. П. Ашмарин, А. А. Во-робйов. - Л.: Медгиз, 1962. - 85 с.
10. Пименов, Е. В. Оценка адгезивных свойств спор вакцинных штаммов Bacillus Anthracis на эритроцитах млекопитающих с помощью фотоколориметрии [Текст] / Е. В. Пименов, В. А. Оборин, А. Г. Ивонин // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 110. - С. 41-43.
11. Махрова, Т. В. Влияние метаболитов стафилококков на адгезивные реакции в системе «Candida albicans - бук-кальные эпителиоциты» [Текст] / Т. В. Махрова, М. И. Заславская, А. Н. Маянский // ЖМЭИ. - 2004. - № 5. - С. 4-7.
12. Хижняк, О. С. Вивчення адгезивних властивос-тей бiфiдобактерiй та лактобацил при сумюному культиву-ванш [Текст] / О. С. Хижняк // Фармаком. - 2015. - № 1. -С. 71-74.
13. Анисимов, Т. И. Руководящий документ по стандартизации. рД 42-28-8-89 / Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов [Текст] / Т. И. Анисимов, С. Н. Буковская и др. - М., 1989. - 31 с.
14. Хижняк, О. С. Розробка складу капсульно! маси профшактичного засобу на осиж пробютичних бактерш [Текст] / О. С. Хижняк // Фармаком. - 2015. - № 3-4. -С. 43-48.
References
1. Glushanova, N. A., Shenderov, B. A. (2005). Vzai-mootnosheniya probioticheskikh i indigennykh laktobacill v usloviyakh sovmestnogo kultivirovaniya in vitro [The relationship of probiotic lactobacilli and indigenous bacteria in the condition of cocultivation in vitro]. Zhurnal mikrob., epidemiol., i immunobiol., 2, 56-61.
2. Patent RF 2257408. Lechebno-profilakticheskiy bio-preparat na osnove sukhoy biomassy bifido- i laktobakteriy, biologicheski aktivnaya dobavka k pishche na osnove sukhoy biomassy bifido- i laktobakteriy, sukhaya biomassa bifido- i laktobakteriy i sposob ee polucheniya [Therapeutic and prophylactic biological drug on the basis of the dry biomass of bifidobacteria and lactobacilli, biology active food supplement based on dry biomass of bifidobacteria and lactobacilli, dry biomass of bifidobacteria and lactobacilli and method there of this production] (2003). 2003136785/13; zajavl. 22.12.2003 g.; opubl. 27.07.2005 g.
3. Zubareva, I. M., Fedorova, I. S., Zubova, A. V. (2004). Razrabotka glubinnykh pitatel'nykh sred v proizvodstve biosporina [Development of the deep culture media in the production of biosporin]. Voprosy khimii i khimicheskoy techno-logii, 1, 85-88.
4. Krasnopol'skiy, Yu. M. (2009). Probiotiki v sostave biologicheskikh dieticheskikh dobavok [Probiotics in the consist of biological dietary supplements]. BAD-ekspert, 1, 18-22.
5. Semchenko, A. V., Kaz'janin, A. V., Orlova, E. V., Neschisljaev, V. A. (2007). Sovershenstvovanie sposoba polu-cheniya probioticheskikh preparatov [Improving the process for the preparation of probiotic drugs]. Fundamental'nye issledo-vaniya, 12, 350-351.
6. Khyzhnyak, O. S., Krasnopol's'kyy, Yu. M. (2013). Biotekhnolohichni aspekty otrymannya kompleksnoho prepara-tu, yakyy mistyt' rizni shtamy probiotychnykh kul'tur [Biotech-nological aspects of obtaining the complex drug, which consist of different strains of probiotic culture]. Visnyk NTU «KhPI». Kharkiv, 4, 113-120.
7. Khyzhnyak, O. S. (2014). Vyznachennya prebi-otychnykh vlastyvostey zaminnyka tsukru laktytolu v umovakh in vitro [Determination of prebiotic properties of sugar substituée lactitol in vitro]. Visnyk NTU "HPI". Serija: Novi rishenn-ja v suchasnyh tehnologijah. Kharkiv: NTU "HPI", 26 (1069), 140-148.
8. Krasnopol's'kyy, Yu. M., Borshchevskaya, M. I. (2009). Farmatsevticheskaya biotekhnologiya. Tekhnologiya proizvodstva immunobiologicheskikh preparatov [Pharmaceutical biotechnology]. Khar'kov: NTU «KhPI», 352.
9. Ashmaryn, V. P., Vorobjov, A. A. (1962). Statystychni metody v mikrobiolohichnykh doslidzhennyakh [Statistical methods in microbiological studies]. Lviv: Medhyz, 85.
10. Pimenov, E. V., Oboryn, V. A., Yvonyn, A. G. (2011). Otsenka adgezivnykh svoystv spor vaktsinnykh shtam-mov Bacillus Anthracis na eritrotsitakh mlekopitayushchikh s pomoshch'yu fotokolorimetrii [Evaluation of adhesive properties of spore vaccine strains of Bacillus Anthracis on erythro-cytes of mammals using photocolorimetry]. Problemy osobo opasnykh infektsiy, 110, 41-43.
11. Makhrova, T. V., Zaslavskaja, M. Y., Majanskyj, A. N. (2004). Vliyanie metabolitov stafilokokkov na adgezivnye reaktsii v sisteme «Candida albicans - bukkal'nye epiteli-otsity» [Influence of staphylococcal metabolites on reaction adhesive system "Candida albicans - buccal epithelial cells]. ZhMEI, 5, 4-7.
12. Khyzhnyak, O. S. (2015). Vyvchennya adhezyv-nykh vlastyvostey bifidobakteriy ta laktobatsyl pry sumisnomu kul'tyvuvanni [Study of adhesive properties of bifidobacteria and lactobacilli in the joint cultivation]. Farmakom, 1, 71-74.
13. Anisimov, T. I., Bukovskaja, S. N. et. al (1989). Rukovodjashhij dokument po standartizacii. rD 42-28-8-89 / Doklinicheskie ispytanija novyh medicinskih immunobiolog-icheskih preparatov [Guidance document on standardization. 42-28-8-89 pA / Pre-clinical testing of new medical immunobi-ological preparations]. Moscow, 31.
14. Khyzhnyak, O. S. (2015). Rozrobka skladu kap-sul'noyi masy profilaktychnoho zasobu na osnovi probiotych-nykh bakteriy [Development of the capsule mass of drug based on probiotic bacteria]. Farmakom, 3-4, 43-48.
Рекомендовано до публгкацИ' д-р фарм. наук, професор Краснопольский Ю. М.
Дата надходження рукопису 11.03.2016
Хижняк Оксана Сергй'вна, астрант, кафедра бютехнологп i аналiтичноï х1мп, Нацюнальний техшчний ушверситет «Харк1вський Полггехшчний 1нститут», вул. Кирпичова, 21, м. Харшв, Украша, 61002 E-mail: [email protected]
UDC 547,792:547,856
DOI: 10.15587/2313-8416.2016.67685
PRIMARY ANTIMICROBIAL SCREENING OF NOVEL [1,2,4]TRIAZOLO[4,3-a]QUINAZOLIN-5(4#)-ONE DERIVATIVES
© S. Danylchenko, O. Drushlyak, S. Kovalenko, S. Kovalenko, A. Elliott, J. Zuegg
Aim. The aim of the given study was to conduct primary antimicrobial screening of novel [1,2,4]triazolo [4,3-a]quinazolin-5(4H)-one derivatives.
Methods. The set of 169 novel [1,2,4]triazolo[4,3-a]quinazolin-5(4H)-one derivatives has been tested for activity against 5 bacteria: Escherihia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeru-ginosa and Staphylococcus aureus, and 2 fungi: Candida albicans and Cryptococcus neoformans. Primary antimicrobial screening has been conducted by whole cell growth inhibition assays, using the provided samples at a single concentration. Samples were tested in water - 0.3 % DMSO solutions with final sample concentrations 32 ng/ml (70-80 yMol).
Results. [1,2,4]Triazolo[4,3-a]quinazolin-5(4H)-ones 5{1}, 7{1}, 7{2}, 7{3} showed more than 80 % inhibition of Acinetobacter baumannii growth and compounds 7{4} showed more than 80 % inhibition of growth fungi Cryptococcus neoformans.
Conclusions. For the first time conducted antimicrobial screening of novel [1,2,4]triazolo[4,3-a]quinazolin-5(4H)-ones showed that compounds, which had no amide group exhibited no antimicrobial activity, but several [1,2,4]triazolo[4,3-a]quinazolin-5(4H)-one derivatives containing amide group attached by carbon or sulfur-carbon chain possess antimicrobial activity against Acinetobacter baumannii or fungi Cryptococcus neoformans Keywords: [1,2,4]triazolo[4,3-a]quinazolin-5(4H)-one, antimicrobial activity Escherihia coli, Klebsiella pneu-moniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Cryp-tococcus neoformans
Мета. У даному до^дженш було поставлено за мету провести первинний с^тнг на aHmuMiKpo6Hy активтсть нових похiдних [1,2,4]триазоло[4,3-a]хiназолiн-5(4H)-ону.
Методи. Масив 169 нових похiдних [1,2,4]триазоло[4,3-a]хiназолiн-5(4H)-ону було тестовано на актив-нкть проти 5 видiв бактерш: Escherihia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa та Staphylococcus aureus, та 2 видiв грибiв: Candida albicans та Cryptococcus neoformans. Первинний скрттг на антимiкробну активтсть було проведено тестуванням усього масиву на подав-лення росту клтин, за умов однаковоi концентрацп сполук. Зразки сполук було тестовано у водних з 0.3 % ДМСО розчинах при остаточнт концентрацп сполук 32 цг/мл (70-80 цМол).
