CC BY
28
ДИССЕРТАЦИОННЫЕ исследования
ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ СОСУДИСТЫХ БИОПРОТЕЗОВ
Светлана Кривенко,
замдиректора по научной работе Минского научно-практического центра хирургии, трансплантологии и гематологии, доктор медицинских наук, доцент; svtl_kr@tut.by
Аннотация. В статье представлены данные о новых технологиях получения и хранения сосудистых биопротезов, внедрение которых обеспечило высокое качество и биобезопасность сосудистых аллографтов при их практическом применении в трансплантологии, онкологии и хирургии.
Ключевые слова: биопротезы, сосудистые аллографты, деконтаминация, криоконсервирование.
Для цитирования: Кривенко С. Технология получения и хранения сосудистых биопрепаратов // Наука и инновации. 2020. №9. С. 78-81. https://doi.org/10.29235/1818-9857-2020-9-78-81
Протезирование сосудов - неотъемлемая часть современной высокотехнологической хирургии, включая трансплантацию органов. Наиболее часто данная задача решается путем использования синтетических протезов, однако при оперативных вмешательствах не всегда можно обеспечить адекватное протезирование либо шунтирование (диаметр сосуда менее 6 мм, необходимость сосудистой вставки с притоками различной величины, реконструкция сосудов в зоне инфекционного процесса), кроме того, повышается риск инфекционных осложнений в зоне операции.
Альтернативой является применение биологических сосудистых протезов с использованием собственных сосудов пациента (большая подкожная вена, нижняя брыжеечная либо гонадная вены, луче-
НАУЧНАЯ ПУБЛИКАЦИЯ
вая артерия) либо полученных от донора. Первый вариант также лимитирован вследствие параметрических характеристик аутологичных сосудов (длина, диаметр, клапанный аппарат вен).
Наиболее перспективным и качественным сосудистым пластическим материалом являются аллоген-ные сосуды, которые обладают высокой биологической совместимостью, низким риском инфицирования, обеспечивают оптимальные гемодинамические показатели (сохраняют свои исходные пластические и биомеханические характеристики - их прочность и упругость не отличаются от собственных сосудов пациента), исключают необходимость длительного приема антикоагулянтов, отлично моделируются и хорошо прошиваются, возможны для применения у детей, включая новорожденных [1, 2].
Использование в качестве источника сосудистых аллографтов доноров со смертью мозга позволяет получать сосуды не только различного типа (артерии, вены), но и диаметра и длины (микро-, магистральные сосуды). Перспективность данного вида биопротезов также подтверждена результатами исследований в области криоконсервации трупной сосудистой ткани, которые показали возможность хранения графтов от нескольких месяцев до нескольких лет [2].
В Минском научно-практическом центре хирургии, трансплантологии и гематологии ежегодно выполняется более 150 мультиорганных заборов, что позволяет при наличии эффективной технологии получать и хранить соответствующее количество сосудистых аллографтов различного типа с разными параметрическими характеристиками.
При решении вопроса о заготовке сосудов от донора с констатированной смертью мозга, помимо общих ограничений для выполнения муль-тиорганного забора, противопоказаниями являются:
■ макроскопические изменения артерий (атероматоз, кальцификация стенки, аортоартериит);
■ заболевания с поражением сосудов, соединительной ткани - аутоимунные и наследственные (болезнь Такаясу, Хортона, системные и вторичные васкулиты и др.);
■ длительный прием кортикостероидов;
■ возраст старше 50 лет.
ОПЕРАЦИЯ ПО ЗАБОРУ
Решение о заборе принимается врачом-трансплантологом после изучения анамнеза, комплексной оценки клинических, лабораторных и инструментальных обследований донора, визуальной (макро-
скопической) оценки стенки сосудистого аллографта с определением степени его атеросклеротического поражения. Забор производится с окружающими мягкими тканями и ветвями после эксплантации донорских органов.
Полученные аллографты упаковывают в герметичный стерильный пакет, содержащий 200 мл холодного (0-4 °С) консервирующего раствора для забора органов. Данный пакет помещают во второй стерильный пакет с холодной водой и ледяной крошкой, который погружают в третий стерильный целлофановый пакет с нанесенной маркировкой. Упакованные трансплантаты сосудов в переносном холодильнике транспортируются в операционную, располагающую возможностями для проведения операции препарирования сосудистых аллографтов ex situ (Back-table операция).
ПОДГОТОВКА К ДЕКОНТАМИНАЦИИ
Препарирование сосудистых аллографтов ex situ выполняют в условиях операционной с использованием биокулярных луп (при необходимости микроскопа) и микрохирургического инструментария. Трансплантаты помещают в стерильную емкость с консервирующим раствором (НТК, «Кустодиол») или UW (University of Wisconsin) при t 0-4 °С. После их осмотра на предмет повреждений и атеросклеротического поражения удаляют окружающие ткани, измеряют длину и диаметр сосудистого аллографта, а также выполняют фотографию его для включения в базу данных и обеспечения визуализации (рис. 1).
Аллографт помещают в герметичный стерильный контейнер с холодным консервирующим (HTK, UW) раствором (при t 0-4 °С) и передают в лабораторию клеточных биотехнологий для дальнейшей обработки.
Рис. 1. Подготовленный к деконтаминации сосудистый трансплантат
ДИССЕРТАЦИОННЫЕ исследования
ДЕКОНТАМИНАЦИЯ
Сосудистые аллографты кладут в стерильный контейнер, содержащий 500 мл питательной среды RPMI-1640 и деконтаминирующие добавки (антибактериальные и противогрибковые лекарственные средства) в следующих количествах: 500 мг ванкомицина, 120 мг линкомицина гидрохлорида, 120 мг колистина сульфата, 150 мг ципрофлокса-цина гидрохлорида, 5 мг амфотерицина В. Трансплантат в контейнере с деконтаминирующим составом должен располагаться свободно и быть полностью погружен в раствор (рис. 2). Деконтаминация аллографта осуществляется в течение 24-48 часов при t 4 °С [3].
После окончания деконтаминации аллографт отмывают стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида, после чего помещают в стерильный пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой, содержащий культуральную среду RPMI-1640.
В зависимости от выбранного режима хранения сосудистый трансплантат помещают на влажное хранение при t 4 °С или криоконсервируют с последующим хранением в парах жидкого азота при t -150 °С.
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ
Контроль качества трансплантата сосуда включает гистологическую оценку состояния тканей биопротеза и контроль стерильности. Взятие биопсийного материала выполняют на этапе заготовки сосудистого трансплантата в ходе операции мультиорган-ного забора. Оформляется биопсийная карта с указанием типа сосуда (артерия, вена) и его анатомической локализации. Микробиологические иссле-
Рис.2. Деконтаминация сосудистых трансплантатов
дования раствора, консервирующего сосудистый трансплантат, на микробную и грибковую флору выполняются по окончании операции препарирования сосудистых аллографтов ex situ перед их криоконсервированием или на 7-е сутки влажного хранения (в зависимости от выбранного варианта хранения), при выдаче сосудистого трансплантата для клинического применения.
МАРКИРОВКА СОСУДИСТЫХ АЛЛОГРАФТОВ
Сведения о каждом заготовленном сосудистом аллографте заносятся в базу данных с заполнением паспорта биотрансплантата. Каждому трансплантату присваивается идентификационный номер, состоящий из буквенного обозначения (А - артерия или В - вена), типа консервации (2 - влажное хранение или 4 - криоконсервирование) и даты забора, например А.2.090316.
КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ
Сосудистый аллографт помещают в криопакет для тканей, содержащий специальный раствор для криоконсервирования, состоящий из 160 мл питательной среды К.РМ1-1640, 20 мл диметилсульфок-сида и 20 мл 10%-ного альбумина человеческого. Расположение аллографта в криопакете должно быть свободным, без перегибов и деформации, которые могут привести к образованию разрывов и трещин в процессе размораживания. Пакет запаивается двойным швом с помощью специального устройства для высокотемпературной пайки, после чего трансплантат готов к криоконсервированию (рис. 3).
Пакет выдерживается в течение 40 мин. при 1 4 °С для выравнивания онкотического и осмотического давления между раствором для криоконсервирова-ния и клетками аллографта, после чего помещается в камеру автоматического программного заморажи-вателя на 10 мин. при 1 4 °С.
Для компенсации выделения латентного тепла при кристаллизации воды температуру в камере охлаждения снижают в течение 10 мин. до -40 °С с последующим поддержанием в течение 15 мин. Такой режим охлаждения обеспечивает устойчивое снижение температуры ткани аллографта со скоростью 1 °С в мин., избегая эффекта температурного колебания, приводящего к повреждению клеток. Для дальнейшего поддержания в камере постоянной скорости охлаждения 1 °С в мин. температуру в ней снижают со скоростью 1,2 °С в мин. до достижения -70 °С и затем со скоростью 2,02 °С в мин. -
до -100 °С [4]. После окончания цикла заморозки пакет с аллографтом помещают в карантинное крио-хранилище до получения результата бактериологического исследования, а затем в основное криохра-нилище на постоянное хранение в парах жидкого азота при t -150 °С.
ВЛАЖНОЕ ХРАНЕНИЕ
После деконтаминации и отмывки сосудистые аллографты помещают в стерильные пластиковые контейнеры, содержащие 400 мл культуральной среды КРМ1-1640. Трансплантаты сосудов должны быть полностью погружены в среду и свободно располагаться в промаркированном контейнере. Сосудистый аллографт хранится при 4 °С, оптимальный срок - до 60 дней.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Выдача сосудистого аллографта по требованию организаций здравоохранения, оказывающих медицинскую помощь пациентам, нуждающимся в протезировании/пластике сосудов, осуществляется в среде ЯРМ1-1640 в стерильном пластиковом контейнере с нанесенной маркировкой. Аллографт сопровождается паспортом сосудистого трансплантата. Информация о выданных материалах регистрируется в журнале движения трансплантатов и электронной базе банка сосудистых аллографтов.
По обращениям медицинских учреждений Минска, а также РНПЦ онкологии и медицинской радиологии, РНПЦ детской хирургии предоставляются сосудистые аллографты для проведения плановых оперативных вмешательств. В перспективе планируется расширение взаимодействия с другими отечественными организациями здравоохранения.
Таким образом, впервые в Беларуси разработаны и внедрены технологии получения аллографтов артериальных и венозных сосудов с различными параметрическими характеристиками (различного диаметра, длины) от трупных доноров и организован банк сосудистых аллографтов, что позволило:
■ оптимизировать оперативные вмешательства за счет доступности необходимого сосудистого протеза для специалистов хирургического профиля в любом регионе страны;
■ сделать ряд хирургических операций одноэтап-ными, сохранить трудоспособность и сократить сроки реабилитации пациентов, тем самым обеспечив повышение качества оказания медицинской помощи белорусским гражданам;
Рис.3. Сосудистый аллографт, подготовленный к криоконсервированию
■ сократить число осложнений, вызванных неэффективным протезированием из-за индивидуальных анатомических особенностей сосудов пациента и невозможностью подбора синтетического протеза;
■ уменьшить количество патологий, связанных с экстренной необходимостью протезирования сосудов в ходе оперативных вмешательств и снизить летальность (не менее 10% сосудистых аллографтов из фонда банка используются по неотложным показаниям).
■ Summary: Reconstruction of the vascular bed or shunting of a part of the vessel involved in the pathological process is impossible without the use of modern vascular plastic materials. Biological vascular prostheses have several advantages over synthetic analogues. At the same time, the use of allogeneic vascular prostheses provides more opportunities for surgical interventions. The article presents data on new technologies for the production and storage of vascular bioprostheses, the introduction of which ensured the high quality and biosafety of vascular allografts in their practical application in transplantology, oncology and surgery.
■ Keywords: bioprostheses, vascular allografts, decontamination, cryopreservation.
■ https://doi.org/10.29235/1818-9857-2020-9-78-81
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Standards for Tissue Banking / American Association ofTissue Banks. 13th edition. - 2012.
2. Jashari R. [et al.]. Banking of cryopreserved arterial allografts in Europe: 20 years of operation in the European Homograft Bank (EHB) in Brussels // Cell Tissue Bank. 2013. Dec; 14(4). P. 589-599. doi: 10.1007/s10561 -012-9359-4.
3. Гомон А.А. [и др.]. Выбор эффективного метода деконтаминации сосудистых аллографтов // Трансплантация и донорство органов: Мат-лы III росс. нац. конгресса. - М., 2017. С. 207.
4. Гомон А.А. [и др.]. Подбор оптимального режима криоконсервирования сосудистых аллографтов, полученных при мультиорганном заборе // Вестник Междунар. Казахско-Турецк. ун-та им. Х.А. Ясави. 2016. №4. С. 177-179.
Статья поступила в редакцию 10.06.2020 г.
ГЛКЕ^ http://innosfera.by/2020/09/bioprosthesis
