CC BY
44
82. Grudzenski S, Raths A, Conrad S, et al. Inducible response required for repair of low-dose radiation damage in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107 (32): 14205-1410.
83. Vasil'ev SA, Stepanova EYu, Kutenkov OP, et al. DNA double-strand breaks in human lymphocytes after single irradiation by low doses of pulsed x-rays: non-linear dose-response relationship. Radiats Biol Radioecol 2012; 52 (1): 3138. Russian (Васильев С. А., Степанова Е. Ю., Кутенков О. П. и др. Двунитевые разрывы ДНК в лимфоцитах человека после однократного воздействия импульсно-периодического рентгеновского излучения в малых дозах: нелинейная до-зовая зависимость. Радиационная биология. Радиоэкология 2012; 52 (1): 31-38).
84. Gaziev AI. Low efficiency of repair of critical DNA damage induced by low doses of radiation. Radiats Biol Radioecol 2011; 51 (5): 512-529. Russian (Газиев А. И. Низкая эффективность репарации критических повреждений ДНК, вызываемых малыми дозами радиации. Радиационная биология. Радиоэкология 2011; 51 (5): 512-529).
85. Beels L, Werbrouck J, Thierens H. Dose response and repair kinetics of gamma-H2AX foci induced by in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and gamma-radiation. Int J Radiat Biol 2010; 86 (9): 760-768.
86. Su Y, Meador JA, Geard CR, Balajee AS. Analysis of ionizing radiation-induced DNA damage and repair in three-dimensional human skin model system. Exp Dermatol 2010; 19 (8): e16-e22.
87. Martin CJ, Sutton DG, West CM, Wright EG. The radiobiology / radiation protection interface in healthcare. J Radiol Prot 2009; 29 (2A): A1-A20.
88. Preston RJ. Integrating basic radiobiological science and epidemiological studies: why and how. Health Phys 2015; 108 (2): 125-130.
89. Ronckers CM, Sigurdson AJ, Stovall M, et al. Thyroid cancer in childhood cancer survivors: a detailed evaluation of radiation dose response and its modifiers. Radiat Res 2006; 166 (4): 618-628.
90. Osipov AN, Grekhova A, Pustovalova M, et al. Activation of homologous recombination DNA repair in human skin fibroblasts continuously exposed to X-ray radiation. Oncotarget 2015; 6 (29): 26876-26885.
91. Osipov AN, Pustovalova M, Grekhova A, et al. Low doses of X-rays induce prolonged and ATM-independent persistence of yH2AX foci in human gingival mesenchymal stem cells. Oncotarget 2015; 6 (29): 27275-27287.
УДК 57.043,57.085.23,57.086.13,577.34 Оригинальная статья
ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИДИМЕТИЛСИЛОКСАНА НИЗКОЙ ВЯЗКОСТИ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ И РАДИАЦИОННОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ СОСУДИСТЫХ АЛЛОГРАФТОВ ЧЕЛОВЕКА
С. Е. Лаук-Дубицкий — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, биолог специализированной лаборатории цитологии, генетики и иммунологии; Т. А. Астрелина — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, руководитель Центра биомедицинских технологий, доктор медицинских наук; В. А. Брумберг — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, инженер специализированной лаборатории цитологии, генетики и иммунологии; А. А. Федюнин — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, врач-хирург хирургического отделения координации донорства органов и (или) тканей человека; О. Ю. Камышников — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Институт иммунологии» ФМБА России, научный сотрудник лаборатории лекарственно-диагностических форм; С. В. Вострухин — ФГБНУ «НИИ глазных болезней», врач-офтальмолог, аспирант отдела глаукомы; А. В. Гордеев — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, отдел №8, старший научный сотрудник; О. В. Паклина — ГБУ здравоохранения г. Москвы «Городская клиническая больница им. С. П. Боткина» Департамента здравоохранения г. Москвы, заведующая патологоанатомическим отделением, доктор медицинских наук; И. В. Кобзева — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заведующая криобанком Центра биомедицинских технологий, кандидат медицинских наук; В. А. Никитина — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, биолог криобанка Центра биомедицинских технологий, кандидат медицинских наук; Ю. Б. Сучкова — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, врач КДЛ специализированной лаборатории цитологии, генетики и иммунологии, кандидат медицинских наук; Д. Ю. Усупжанова — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, младший научный сотрудник лаборатории №9; В. А. Брунчуков — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, младший научный сотрудник лаборатории редактирования генома; Т. В. Карасева — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, начальник отдела экспертизы биомедицинских технологий; А. Ю. Бушманов — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, первый заместитель генерального директора, доктор медицинских наук, профессор; А. С. Самойлов — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, генеральный директор, доцент, доктор медицинских наук.
APPLICATION EVALUATION OF A POLYDIMETHYLSILOXANE LOW-VISCOSITY FOR CRYOPRESERVATION AND RADIATION STERILIZATION OF HUMAN CADAVERIC VASCULAR ALLOGRAFTS
S. E. Lauk-Dubitsky — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Specialized Laboratory Cytology, Genetics and Immunology, Biologist; T. A. Astrelina — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of the Center for Biomedical Technologies, Doctor of Medical Sciences; V. A. Brumberg — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, a Biologist at the Center for Biomedical Technologies; A. A. Fedyunin — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Surgical Department of Coordination of Organ Donation and (or) Human Tissue, Surgeon; O. Yu. Kamyshnikov — Institute of Immunology, Researcher of Laboratory of Drug and Diagnostic Forms; S. V. Vostrukhin — Research Institute of Eye Diseases, Ophthalmologist, Post-graduate Student of the Department of Glaucoma; O. V. Paklina — City Clinical Hospital n.a. S. P. Botkin, Head of the Pathology Department, Doctor of Medical Sciences; A. V. Gorde'yev — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan,
Department №8, Senior Researcher; I. V. Kobzeva — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of Cryobank of the Center for Biomedical Technologies, Candidate of Medical Sciences; V. А. Nikitina — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Kryobank of the Center for Biomedical Technologies, Biologist, Candidate of Medical Sciences; Yu. B. Such-kova — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Doctor CDL Center of Biomedical Technologies, Candidate of Medical Sciences; D. Yu. Usupzhanova — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Laboratory №9, Junior Researcher; V. A. Brunchukov — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Laboratory №9, Junior Researcher; T. V. Karaseva — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of the Review of Biomedical Technologies; А. Yu. Bushmanov — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Vice Director, Doctor of Medical Sciences, Professor, A. S. Samoilov — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, General Director, Assistant Professor, Doctor of Medical Sciences.
Дата поступления — 21.11.2016 г. Дата принятия в печать — 08.12.2016 г.
Лаук-Дубицкий С. Е., Астрелина Т. А., Брумберг В. А., Федюнин А. А., Камышников О. Ю., Вострухин С. В., Гордеев А. В., Пакпина О. В., Кобзева И. В., Никитина В. А., Сучкова Ю. Б., Усупжанова Д. Ю., Брунчуков В. А., Карасева Т. В., Бушманов А. Ю., Самойлов А. С. Оценка применения полидиметилсилоксана низкой вязкости для криоконсервации и радиационной стерилизации сосудистых аллографтов человека. Саратовский научно-медицинский журнал 2016; 12 (4): 662-670.
Цель: изучение потенциальных протекторных свойств полидиметилсилоксана низкой вязкости при криоконсервации и радиационной стерилизации сосудистых аллографтов человека маргинального происхождения для тканевой инженерии. Материал и методы. Проведена серия опытов, изучающих эндоцеллюлярные протекторные свойства полидиметилсилоксана (далее — ПДМС) при криоконсервации суспензии мезенхимальных стволовых клеток, с контролем и использованием рутинного протокола с 10% ДМСО; экзоцеллюлярные протекторные свойства ПДМС с циклической криоконсервацией сегментов одного сосуда — бедренной артерии человека; протекторные свойства ПДМС во время радиационной стерилизации трех криоконсервированных сегментов бедренной артерии маргинального происхождения длинной до 3 см по сравнению с группой контроля, для которой применялся модифицированный метод консервации кожных лоскутов в глицерине для последующей стерилизации. Использовались методы оценки динамической вязкости на экспериментальном измерительном стенде с предварительной проверкой его применимости, метод электронной сканирующей микроскопии, в т.ч. с лантаноидным окрашиванием клеток, а также гистологические исследования. Результаты. Опыты показали ярко выраженное экзоцеллюлярное протекторное действие ПДМС, подтвержденное электронной микроскопией и гистологическим исследованием, а также его опосредованное радиопротекторное действие, в частности из-за гляциофобности и более безопасной процедуры предварительной криоконсервации по тестам оценки динамической вязкости. Заключение. Использование ПДМс для криоконсервации и радиационной стерилизации показало свою целесообразность, однако требует дальнейшей модификации протоколов и дополнительных исследований.
Ключевые слова: криоконсервация, радиационная стерилизация, тканевая инженерия.
Lauk-Dubitsky SE, Astrelina TA, Brumberg VA, Fedyunin AA, Kamyshnikov OYu, Vostrukhin SV, Gorde'yev AV, Paklina OV, Kobzeva IV, Nikitina VA, Suchkova YuB, Usupzhanova DYu, Brunchukov VA, Karaseva TV, Bushmanov AYu, Samoilov AS. Application evaluation of a polydimethylsiloxane low-viscosity for cryopreservation and radiation sterilization of human cadaveric vascular allografts. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2016; 12 (4): 662-670.
Aim: to investigate potential cryo- and radioprotective properties of a polydimethylsiloxane of low viscosity to provide safe and reliable cryopreservation and radiation sterilization of human cadaveric vascular allografts. Material and methods. A consecutive experimental set-up was carried out to establish polydimethylsiloxane (further — PDMS) protective endocellular properties. For this purpose a high-densitymesenchymal stem cells suspension was cryopreserved with 10% DMSO solution; PDMS exocellular protective properties were assessed by cyclic cryoconservation of 12 femoral artery segments, while PDMS potential radioprotectiveproperties were assessed by gamma irradiation — induced sterilization of 3 cryopreserved femoral artery segments with gross length about 3 cm, and for control grafts a slightly changed protocol with glycerin was used. In this study the dynamic viscosity of all cryopreserved vessels was analyzed with using specially designed experimental device, also electron scanning microscopy with lanthanide cells staining and routine hematoxylin — eosin cell staining were applied. Results. We have demonstrated a prominentexocellular protective effect of PDMS confirmed by a SEM and histological results, and also its mediated radioprotective effect, in particular because of its safer preliminary cryopreservation procedure. Conclusion. Use of PDMS for a cryopreservation and gamma sterilization showed its rationality, however requires further modification of protocols and additional researches.
Key words: cryopreservation, radiation sterilization, fabric engineering.
Введение. Радиационная стерилизация биомедицинских изделий (в частности, тканеинженерных аналогов кровеносных сосудов) в условиях низких температур является эффективной и надежной методикой, снижающей риски генерации свободных радикалов и широко применяющейся передовыми медицинскими компаниями, специализирующимися в области хранения и стерилизации тканеинженер-ных конструкций с обеспечением их доступности, Сгуо^е1пс. Радиационная стерилизация необходима для снижения риска контаминации на всех этапах производства [1, 2]. В связи с этим крайне важной представляется разработка модернизированного
Ответственный автор — Лаук-Дубицкий Станислав Евгеньевич Тел. (сот.): +79998200584 E-mail: [email protected]
протокола стерилизации с учетом большого количества образцов и способов нетоксичной химической протекции аллографтов, подвергаемых криогенному и радиационному воздействиям. В рамках создания протокола был выбран перспективный хладоноси-тель, разрешенный для использования в медицине (FDA) — низкомолекулярный полидиметилсилоксан (ПДМС) с концевыми триметилсилильными группами. ПДМС разной вязкости и модификаций широко используется в тканевой инженерии для покрытия скаффолдов природного и синтетического происхождения с целью улучшения адгезии клеток, в медицине и фармакологии («энтеросгель»), а также в ракетостроении и космонавтике для антикоррозийных покрытий и экранирования протонного, нейтронного и ультрафиолетового излучений [3]. Безопасность и биосовместимость ПДМС с клетками и тканями во
время заморозки отдельно продемонстрированы в наших исследованиях, в которых удалось добиться витрификации сосудистых аллографтов без использования токсичных криопротекторов и методов программного замораживания [4]. Поэтому основные свойства ПДМС [5, 6], такие как гидрофобность, гля-циофобность, антиоксидантная активность, особенно при высоких температурах, термическая стабильность, газопроницаемость, химическая инертность, низкая токсичность, высокое сопротивление сдвигу и разрыву, способность оставаться в жидком состоянии при сверхнизких температурах (до -1000С для ПДМС-1 при температуре стеклования -1280С и температуре вспышки 380С), являются крайне перспективными для потенциального использования его в качестве протекторного вещества во время криоконсервации. Помимо этого, полидиметилсилоксан выдерживает радиационную стерилизацию в дозах до 30 кГр без образования поперечных сшивок [7] и может быть использован для стерилизации аллографтов.
Материал и методы. Проведена серия опытов.
Забор сосудистого материала маргинального происхождения. Для трех опытов изъяты пять участков бедренных артерий у двух маргинальных доноров старшей возрастной группы в течение 5 часов после фиксации летального исхода. Длина участков сосудов варьировалась от 5 до 12 см; для опыта №2 длина участка 12 см, для опыта №3 длина 3 см, для опыта №4 длина 6 см. Критерием исключения из эксперимента было наличие бифуркаций, атероскле-ротических и иных повреждений сосудистой стенки, бляшек и кальцинации на более чем 40% внутренней площади сосуда. Изъятые участки помещались в стерильные контейнеры объемом 100 мл, содержащие раствор кустодиола (Dr. F. Koehler Chemie GmbH, Германия), охлажденный до температуры 40С, и транспортировались в лабораторию в течение двух часов. Все основные эксперименты с материалом проводились в течение суток.
Опыт №1 по тестированию ПДМС низкой вязкости в качестве проникающего криопро-тектора для мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Использована культура МСК перио-донтального происхождения, подготовленная для рутинного криоконсервирования. Клеточную суспензию МСК по 1х106/мл распределяли в криопробир-ки объемом 2 мл. В контрольную пробирку к МСК добавляли в конечной концентрации 10% ДМСО (Sigma Ald., США) и реополиглюкин («Биохимик», Россия) в соотношении 1:1 и перемешивали. В опытную пробирку с МСК добавляли ПДМС-1 («Спектро-пласт», Россия, вязкостью в 1 сантистокс) без перемешивания. Пробирки помещались в пары азота и через 3 минуты переносились в криоконтейнер с жидким азотом для транспортировки к месту проведения опыта. После размораживания в водяной бане пробирки с ПДМС центрифугировали и собирали МСК для проведения оценки жизнеспособности и их количества, пробирки МСК с ДМСО не отмывались. Для оценки метаболической активности МСК применялась методика лантаноидного контрастирования с последующей визуализацией на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) [8], модифицированная для суспензионных культур. Проведение контрастирования суспензии клеток осуществляли с использованием набора реактивов на основе хлорида неодима (BioREE, ООО «Глаукон», Россия) согласно рекомендованному производителем протоколу. Изучение контрастированных образцов осуществляли
на микроскопе EVO LS10 (Zeiss, Германия). Наблюдения проводились в режиме низкого вакуума (EP, 70 Па), при ускоряющем напряжении от 20 до 25 кВ и силе тока на образце 400-520 Па. Для оценки на момент контрастирования метаболической активности клеток использовали BSE-изображения, на которых яркость клеток зависит от количества захваченного иминеодима.
Опыт №2 по тестированию ПДМС низкой вязкости в качестве непроникающего крио-протектора для аллографта маргинального происхождения. Участок бедренной артерии длиной не менее 12 см был изъят для тестирования ПДМС в качестве непроникающего криопротектора при многократном замораживании (11 раз) и оценки его негативного влияния на внеклеточный матрикс. Предварительно пластиковую емкость для замораживания бедренной артерии объемом в 1 л, содержащую ПДМС-1, помещали в низкотемпературный холодильник на -800С с контролем температуры с помощью термопары KJT 8852 (Китай). Такая же емкость, но с ПдМС-5 с температурой 240С использовалась для размораживания бедренной артерии. На первом цикле тестирования участок артерии крепили на нетугой полой пластиковой подложке (диаметр которой меньше на 15% внутреннего диаметра бедренной артерии с целью минимизации рисков деформации интимы), помещали в емкость с охлажденным ПДМС-1 и выдерживали при -800С не более 3 минут После этого участок бедренной артерии помещали во вторую емкость с ПДМС-5 с температурой 240С и, интенсивно встряхивая, размораживали в течение 4 минут. По окончании процесса часть размороженного участка бедренной артерии отправляли на гистологическое исследование. На втором цикле тестирования оставшийся участок артерии заново замораживали по ранее описанной схеме и повторяли все шаги. Общее количество циклов было равно одиннадцати. Проводилось гистологическое исследование участков бедренной артерии на всех этапах опыта с окрашиванием гематоксилином и эозином с помощью микроскопа Axioscope Imager A1 (Zeiss, Австрия).
Опыт №3 по тестированию экспериментального испытательного стенда на натив-ных сосудах маргинального происхождения — измерение динамической вязкости. Участок бедренной артерии длиной 3 см помещали на подготовленный столик экспериментального стенда (ФБГНУ «НИИГБ», патент «Испытательный стенд для изучения вязкопластических свойств биологических тканей» RU106372 U1) и делали косой поперечный срез. Проводили оценку динамической вязкости слоев участка артерии посредством прокола его стенки с внутренней стороны и прохождения сквозь его ткани плунжера односторонне скошенной клиновидной формы диаметром 0,5652 мм с программируемой постоянной скоростью подачи (0,06 мм/мин.) и системой оценки усилия, передаваемого на испытуемый образец с регистрацией данных с частотой 5 значений в секунду с разрешением 0,02 гс. Получаемые данные разрушающего усилия клиновидного плунжера по мере его прохождения через структуры артерии (динамическая вязкость), и интегральное вязкое сопротивление суммы разрушенных слоев при заданной скорости вдавливания, близкое к величине предельной устойчивости образца, обрабатывались на ПК. Таким образом, целесообразность использования экспериментального испытательного стенда для тестирования биомеханических свойств
артерий, особенно длинной менее 6 см, оценивалась посредством сопоставления полученных графических данных от испытуемого участка бедренной артерии длинной 3 см с его анатомической структурой.
Опыт №4 по тестированию ПДМС в качестве радиопротектора при радиационной стерилизации аллографтов маргинального происхождения. Использовались 3 участка бедренной артерии длинной до 6 см от одного донора маргинального происхождения старшей возрастной группы. Каждый из них разрезался на два неравных сегмента с косым поперечным срезом. Меньшие сегменты, длиной до 1 см, тестировались на вязко-пластические свойства в нативном состоянии по ранее апробированной схеме (опыт №3) и составляли группу контроля. На оставшихся сегментах тестировали радиопротекторные свойства ПДСМ-25 низкой вязкости (который доступен стерилизации) в условиях радиационной стерилизации при сверхнизких температурах. Первый сегмент выдерживали в течение 1 часа при температуре +40С, после помещали в стерильную пластиковую емкость, содержащую предварительно охлажденный до -450С ПДМС-25, и переносили в холодильник -800С на 30 минут. Второй сегмент криоконсервировался по аналогичной схеме, однако после охлаждения до -450С он переносился в пустую стерильную емкость, и уже затем охлаждался до -80С0 в течение 30 минут, покрытый слоем ПДМС-25, однако фактическое время охлаждения обоих сегментов было значительно меньше, до 10 минут Третий сегмент криоконсервировали по модифицированному протоколу, используемому для криоконсервации и радиопротекции графтов кожи, описанному в статье Rooney P. с соавт. [9]. Сегмент помещался в стерильную емкость, содержащую радиопротекторный коктейль из глицерола и раствора Хенкса (1:1), и выдерживали 1 час при температуре +40С, после помещали в герметичном пенопластовом контейнере в холодильник(Sanyo, Япония) при температуре -450С на 1 час, затем емкость доставали из контейнера и переносили в другой холодильник при температуре -800С. По окончании криоконсервации все емкости с сегментами помещали в стерильный запаивающийся пакет. Пакет размещался в кри-оконтейнере на поверхности сухого льда так, чтобы три емкости располагались на одной прямой линии перпендикулярно развертке стерилизующего луча. Радиационная стерилизация проводилась с использованием радиационно-технологической установки
с ускорителем электронов УЭЛР-10-10-40 в дозах 30 кГр (энергия электронов 7,5 МэВ, ток пучка 700 мкА) с одной стороны криоконтейнера. После этого происходило размораживание сегментов в условиях ламинарного потока. Первый и второй сегменты поочередно доставались из емкостей и помещались в емкость со стерильным ПДМС-25 (вязкостью в 25 сантистокс) комнатной температуры и интенсивно встряхивались в течение 5 минут Третий сегмент размораживался в водяной бане с подогревом до +370С с интенсивным перемешиванием жидкости и фиксацией емкости с сегментом на дне емкости. Размороженные сегменты упаковывались в пронумерованные стерильные контейнеры, содержащие стерильный раствор кустодиола с добавлением 500 U/мл пенициллина — стрептомицина (500 mg/mL) и проводилось измерение динамической вязкости по ранее апробированной схеме. После этого все протестированные сегменты контрольной и опытной групп транспортировались в патанатомическую лабораторию для проведения гистологического исследования с окрашиванием гематоксилином и эозином с помощью прямого микроскопа DM-200 (Leica, Германия).
Результаты. Результаты по тестированию ПДСМ низкой вязкости в качестве проникающего (эндоцеллюлярного) криопротектора (опыт №1). Жизнеспособность МСК с ПДМС составила 50%, тогда как жизнеспособность МСК с ДМСО — 90% (рис. 1). Как было видно по результатам сканирующей микроскопии, частицы ПДМС окружали клетки (рис. 2), в том числе адгезирующиеся (рис. 3), однако не встраивались в их мембраны, что было дополнительно подтверждено проведением химического картирования изолированной клетки в программном комплексе энергодисперсионной спектроскопии AZtec (Oxford instruments, Великобритания).
Результаты по тестированию ПДМС низкой вязкости в качестве непроникающего (экзоцел-люлярного) криопротектора (опыт №2). Рутинное гистологическое окрашивание гематоксилином-эозином сегментов бедренной артерии показало отсутствие закономерности между числом циклов замораживания, количеством клеток и целостностью экстрацеллюлярного матрикса, что свидетельствуют об отсутствии ярко выраженного эффекта холодо-вого цитолиза и повреждения слоев сосуда (каждый слой дифференцировался четко) в описанных нами условиях замораживания (рис. 4).
Рис. 1. Культура МСК после размораживания. Левое изображение — МСК с ДМСО; правое — МСК с ПМС
Рис. 2. Клетка после размораживания с ПМС. Левое изображение с фокусом на цитоплазму, правое с фокусом
на межклеточное пространство
Рис. 4. Гистологические препараты (окраш. гематоксилином; ув. Х50): А — первый цикл замораживания; Б — одиннадцатый цикл замораживания
Динамическая вязкость, 10л 12*с*кгс/мЗ / время/глубина
Рис. 5. Морфологические структуры нативного сосуда во время измерения их динамической вязкости
Рис. 6. Морфологические структуры образца №1 до обработки во время измерения их динамической вязкости (слева)
и интегрального усилия (справа)
Рис. 7. Морфологические структуры образца №1 после обработки во время измерения их динамической вязкости (слева)
и интегрального усилия (справа)
Результаты по тестированию экспериментального испытательного стенда на натив-ных сосудах маргинального происхождения — измерение динамической вязкости (опыт №3).
Полученные графические данные (рис. 5) можно интерпретировать следующим образом. Прокалывание и вхождение плунжера происходило со стороны тонкой прочной внутренней оболочки сосуда — ^егпаНатт (см. п. 1 на рис. 5), на графике наглядно видно начало передачи нагрузки; затем наблюдается плато, соответствующее средней, наиболее толстой, не очень однородной и прочной средней оболочке сосуда — tunicamedia (см. п. 2 на рис. 5), где находятся гладкомышечные клетки; дальнейшее движение плунжера приводило к разрыву tunicamedia, и он
переходил в следующую, более прочную, но тонкую структуру — externalamina (см. п. 3 на рис. 5); после ее разрыва (см. п. 4 на рис. 5) видно продолжительное движение плунжера в рыхлой полости и постепенный переход ко вкалыванию во внешнюю, совсем слабую, рыхлую и крайне неоднородную структуру — адвентицию (см. п. 5-7 на рис. 5).
Результаты по тестированию ПДМС низкой вязкости в качестве радиопротектора — (опыт №4). Динамическая вязкость и интегральное усилие первого сегмента до (рис. 6) и после (рис.7) криоконсервации и стерилизации отличаются в основном по пиковым значениям.
Гистологический анализ показал в первом сегменте заметные некротические поражения в интиме
Рис. 8. Гистологический препарат образца №1 после обработки (окраш. гематоксилином; ув. Х50)
Рис. 11. Гистологический препарат образца №2 после обработки (окраш. гематоксилином; ув. Х50)
и адвентиции (рис. 8), но, в отличие от других образцов, сохранена принципиальная опорная структура интимы — внутренняя ламина; ядра клеток, прилегающих к интиме, имеют морфологию практически интактных ядер.
Динамическая вязкость и интегральное усилие второго сегмента до (рис. 9) и после (рис. 10) криокон-сервации и стерилизации отличаются по основным пиковым и остальным значениям. Гистологический анализ (рис. 11) второго сегмента показал более выраженные, по сравнению с первым сегментом, очаги некротических поражений в слоях интимы и адвенти-
ции; общая структура волокнистого соединительнотканного матрикса в области оболочек сохранена.
Динамическая вязкость и интегральное усилие третьего сегмента до (рис. 12) и после (рис.13) кри-оконсервации и стерилизации значительно отличаются по всем значениям. Гистологический анализ (рис. 14) третьего сегмента выявил, что его экстра-целлюлярный матрикс значительно поврежден, видны обширные некротические очаги в области интимы, медии и адвентиции, вплоть до отслаивания отдельных оболочек (интима). Ядра клеток сохранены, но имеют пикнотическую морфологию; структурные компоненты внеклеточного матрикса (коллагены,
Рис. 9. Морфологические структуры образца №2 до обработки во время измерения их динамической вязкости (слева)
и интегрального усилия (справ)
Рис. 10. Морфологические структуры образца №2 после обработки во время измерения их динамической вязкости (слева)
и интегрального усилия (справа)
Рис. 12. Морфологические структуры образца №3 до обработки во время измерения их динамической вязкости (слева)
и интегрального усилия (справа)
Рис. 13. Морфологические структуры образца №3 после обработки во время измерения их динамической вязкости (слева)
и интегрального усилия (справа)
■f li ШуШ
• ♦ 1 Л -, X
/ , ♦, vy J У <•
, V ' Í' о / ' -, "' ' Ik '',-
",:'■■• геЯк ' ïfflpîtW х50
Рис. 14. Гистологический препарат образца №3 после обработки (окраш. гематоксилином; ув. Х50)
эластин) денатурированы. Основные повреждения сосуда, вероятно, вызваны формирующимися кристаллами льда.
Обсуждение. По предварительным результатам тестирования ПДМС-1 в качестве криопротектора (в опытах №1 и №2) можно сделать вывод, что характер его криопротекторного действия связан в первую очередь с непроникающим внутрь клеток гляциофоб-ным воздействием на формирующиеся кристаллы льда — уменьшением их длины и приданием аморфности, что позволяет представить его в качестве перспективного нерпоникающего (экзоцеллюлярно-го) криопротектора. Однако сама процедура крио-консервации суспензии клеток в ПДМС-1 проходила
впервые и не была отработана до этого, что могло привести к потере клеточного материала ввиду ограниченного по глубине действия ПДМС на суспензию клеток. Поэтому требуются дополнительные исследования с формированием монослоя МСК и прямым контактом с ПДМС (с возможной модификацией для улучшения адгезии к его поверхности), также необходимо проведение опыта по использованию ПДМС в составе криопротекторных коктейлей для криокон-сервации клеточных культур.
Графические данные тестирования динамической вязкости нативных сосудов в экспериментальном испытательном стенде (в опыте №3) согласуются с анатомической структурой слоев сосуда, что дает все основания рекомендовать используемый испытательный стенд для тестирования динамической вязкости сосудистых аллографтов и, после проверки, иных типов биологического материала для тканевой инженерии. Основные преимущества стенда: возможность загрузки минимального объема биоматериала (в 10 раз меньшего) в сравнении с разрывными машинами Instron; получение более детализированных данных о характере изменений внутренних структур; скорость и удобство измерительного процесса (от 10 минут на один тест).
Во время тестирования ПДМС-1 в качестве радиопротектора (опыт №4) продемонстрировано, что проведение биомеханических тестов на экспериментальном испытательном стенде позволяет получать данные, согласующиеся с анатомической структурой слоев сосудов и характером повреждающего действия пучка электронов во время стери-
лизации. Ухудшение свойств сосудов выявлено во всех образцах после их стерилизации в присутствии радиопротекторов, однако ПДМС-1 показал себя как опосредованный радиопротектор за счет своей гля-цифобности, а также безопасности, скорости и равномерности процесса охлаждения аллографтов и их разморозки. Более того, так как существуют данные об использовании ПДМС и его соединений с целью экранирования протонного и нейтронного излучений, это может служить основанием для тестирования подобных свойств ПДМС во время стерилизации тормозным рентгеновским излучением. Протекторный эффект ПДМС-1 во время радиационной стерилизации частично схож с действием глицерола, однако во время облучения при комнатной температуре (в дозах 60 кГр и выше) в ПДМС могут образовываться индуцированные облучением и поперечным сшиванием молекул свободные радикалы (а также низшие алканы), поэтому крайне важно его предварительное охлаждение до -800С и ниже, а также предпочтительное использование криоконсервации биологических образцов на подложке с покрытием ПДМС вместо помещения в его объем, что и было нами продемонстрировано. Размораживание стерилизованных образцов желательно проводить в стерильном объеме ПДМС-25, что может оказывать необходимый положительный эффект и выполнять опосредованную антиоксидантную функцию.
Итак, полученные данные полностью согласуются с ранее проведенными опытами по влиянию кри-оконсервации в ПДМС на биомеханические свойства сосудистых аллографтов человека, что позволяет рекомендовать его использование к дальнейшему доклиническому исследованию.
Заключение. В результате проведенных опытов ПДМС показал себя как перспективный непроникающий криопротектор, его воздействие на клетки ограничивалось на мембране и межклеточном веществе, в частности за счет формирования аморфного межклеточного льда. Что же касается его опосредовано-го радиопротекторного действия, то проведенные исследования показали эффективность и безопасность применения ПДМС как протектора для радиационной стерилизации криоконсерванных сосудистых аллографтов в объеме ПДМС-1 низкой вязкости. Остаются нерешенные вопросы по выбору степени вязкости растворов. Однако даже на этом этапе использование ПДМС-1 как радио- и криопротектора является более предпочтительным, чем аналогичного по свойствам глицерола, и не несет рисков в случае проведения дальнейшей обработки сосудов — их децеллюляризации и ревитализации. С точки же зрения экономической эффективности и удобства использование ПДМС также целесообразно.
Конфликт интересов отсутствует.
Благодарности. Процедуры забора аллографтов санкционировала и полностью обеспечила Оксана Владимировна Паклина — заведующая патологоа-натомическим отделением городской клинической больницы имени С. П. Боткина.
Авторский вклад: концепция и дизайн исследования — С. Е. Лаук-Дубицкий; получение данных — С. Е. Лаук-Дубицкий, В. А. Брумберг, А. А. Федюнин, О. Ю. Камышников, С. В. Вострухин, А. В. Гордеев; обработка данных — И. В. Кобзева, Ю. Б. Сучкова, Д. Ю. Усупжанова, В. А. Брунчуков, Т. В. Карасева, О. В. Паклина; анализ и интерпретация результатов — С. Е. Лаук-Дубицкий, В. А. Брумберг, Т. А. Астрелина; написание статьи — С. Е. Лаук-Дубицкий; утверждение рукописи для публикации — Т. А. Астрелина, А. Ю. Бушманов, А. С. Самойлов.
References (Литература)
1. Shangina OR. Morfologicheskie osnovi radiazionnoy ustoichivosti soedinitelnotkannikh transplantov: DSc abstract. Saransk, 2007; 25 p. Russian (Шангина О. Р. Морфологические основы радиационной устойчивости соединительнотканных трансплантатов: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Саранск, 2007; 25 с.).
2. Shangina OR. Vliyanie radiazionnoy sterilizazii na strukturu biomaterialov: PhD abstract. Ufa, 1999; 30 p. Russian (Шангина О. Р. Влияние радиационной стерилизации на структуру биоматериалов Аллоплант: экспериментально-морфологическое исследование: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Уфа, 1999; 30 с.).
3. Li Z, Nambiar S, Zheng W, Yeow JTW. PDMS/single-walled carbon nanotube composite for proton radiation shielding in space applications. Materials Letters 2013; (108): 79-83.
4. Lauk-Dubitskiy SE,Astrelina TA, et al.Anovel comprehensive approach for human vascular allografts cryopreservation and radiation sterilization for the tissue engineering industry. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2015; 11 (4): 624-632. Russian (Лаук-Дубицкий С. Е., Астрелина Т. А. и др. Новый метод комплексной криоконсервации и радиационной стерилизации сосудистых аллотрансплантатов человека для тканевой инженерии. Саратовский научно-медицинский журнал 2015; 11 (4): 624-632).
5. Mata A, Fleischman AJ, Roy S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/ nanosystems. Biomed Microdevices 2005; 7 (4): 281-293.
6. Li H, Li X, Luoa C, et al. Icephobicity of polydimethylsiloxane-b-poly (fluorinated acrylate). Thin Solid Films 2014; (573): 67-73.
7. Palsule AS, Clarson SJ, et al. Gamma Irradiation of Silicones. Organometallic Polymers 2008; (18): 207.
8. Novikov IA, Subbot AM, Fedorov AA. Supravital lanthanoid staining for scanning electron microscopy of biological objects. Genes and cells 2015; (10) 2: 90-96. Russian (Новиков ИА, Суббот АМ, Федоров АА. Суправитальное контрастирование лантаноидами для визуализации структуры биологических образцов на сканирующем электронном микроскопе. Гены и клетки 2015; (10) 2: 90-96).
9. Rooney P, Eagle M, Hogg P, Lomas R, et al. Sterilization of skin allograft with gamma irradiation. Burns, 2008; 34 p.
