CC BY
34
М. Г. Гордиев, Д. Д Сакаева, В. В. Петкау, Р. Ф. Еникеев, О. И. Бровкина, Л. Х. Шигапова, М. О. Дружков, Е. И. Шагимарданова, Д. С. Ходырев, О. А. Гусев,
А. Г. Никитин, Р. Р. Фаисханова, А. Ф. Насретдинов, Ю. К. Моляка, Е. Г. Овчинникова, И. С. Шумская
Таргетное секвенирование нового поколения генов для выявления редких мутаций при наследственном раке молочной железы
DOI: 10.18027/2224-5057-2018-8-3s1-107-109
Цитирование: Гордиев М. Г., Сакаева Д. Д., Петкау В. В., Еникеев Р. Ф., Бровкина О. И., Шигапова Л. Х. и др. Таргетное секвенирование нового поколения генов для выявления редких мутаций при наследственном раке молочной железы // Злокачественные опухоли 2018; 3s1:107—109
Таргетное секвенирование нового поколения генов для выявления редких мутаций при наследственном раке молочной железы
М. Г. Гордиев1, Д. Д. Сакаева2, В. В. Петкау3, Р. Ф. Еникеев1, О. И. Бровкина4, Л. Х. Шигапова5, М. О. Дружков1, Е. И. Шагимарданова5, Д. С. Ходырев4, О. А. Гусев5, 6, А. Г. Никитин4, Р. Р. Фаисханова2, А. Ф. Насретдинов2, Ю. К. Моляка7, Е. Г. Овчинникова8, И. С. Шумская9
1 ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер Министерства Здравоохранения Республики Татарстан», Казань, Россия 2 ГБУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер», Уфа, Россия 3 ГБУЗ Свердловской Области «Свердловский областной онкологический диспансер», Екатеринбург, Россия 4 Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства, Москва, Россия 5 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия 6 RIKEN, Йокогама, Япония 7 ГБУЗ «Клинический онкологический диспансер № 1», Краснодар, Россия 8 ГБУЗ Нижегородской Области «Нижегородский областной клинический онкологический диспансер», Нижний Новгород, Россия 9 Медицинский Центр «МЕДИС», Нижний Новгород, Россия Для корреспонденции: marat7925@gmail.com
Введение
В настоящее время в мире известно более 3000 мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 [1]. Распространенность мутаций генов BRCA1 и BRCA2 значительно варьирует в зависимости от принадлежности к этническим группам и географическому региону. Особенность спектра мутаций в России заключается в преобладании пяти частых мутаций (с. 5266dupC, с. 181Т^, с. 66_67delAG, с. 4035_4035delA, с. 1961_196Ые1А), которые охватывают до 90% всего спектра. С наибольшей частотой у женщин, проживающих в достаточно отдаленных друг от друга регионах России, встречается одна из этих мутаций - с. 5266dupC в экзоне 20 гена BRCA1 (от 68 до 90 %) [2]. На основе этих данных разработаны и внедрены в клиническую практику коммерческие наборы на основе метода ПЦР для детекции наиболее частых мутаций генов BRCA1 и BRCA2. Однако на настоящий момент такой подход не является оптимальным, так как в этом случае не учитываются редкие мутации и этническая принадлежность пациента. Кроме того, не учитываются мутации в других генах, ответственных за развитие наследственного рака молочной железы. В данной работе мы проанализировали частоту мутаций генов BRCA1 и BRCA2, а также мутации в других генах репарации ДНК у пациенток с синдромом наследственного рака молочной железы (РМЖ) и дали характеристику некоторым редким мутациям из перечисленных генов.
Материалы и методы
Методом секвенирования нового поколения (NGS) были проанализированы следующие гены: TP53, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM, APC, MUTYH, CDKN2A, CDK4, ATM, KIT, PDGFRA, CDH1, CTNNA1, PRSS1, SPINK1, CFTR, BRCA1, BRCA2, FANCI, FANCL, PALB2, RAD51B, RAD51C, RAD54L, RAD51D, CHEK1, CHEK2, CDK4, CDK12, FANCJ/BRIP1, PPP2R2A, BARD1, PARP1, NTHL1, POLE, POLD1 BMPR1A, SMAD4, MLH3, MSH6, PMS1, NBN, NF1, PPM1D, DICER1, PPM1D, RB1, HOXB13, BMPR1A, BLM, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCM, RHBDF2, HRAS, BAP1, EGFR SDHB, SDHC, SDHD, SFTPA1, HER2, SLX4, BAP1, MRE11, FAM175, CtIP, H2AX, RPA, NTHL1 RPS20, BUB1, BUB3, LRP6, STK11, AKT1, ATR, BABAM1, BAP1, BMPR1A, CTNNA1, FAM175A, MRE11A, NBN, PMS2, POLD1, POLE, PRSS1, RAD50, RET, TP53BP1, VHL, XRCC2 в 519 образцах крови от пациенток с наследственным РМЖ, проходивших обследование в различных учреждениях онкологического профиля РФ в 2014-2018 гг. и подписавших информированное согласие на проведение исследования. Критерии включения были следующими: молодой возраст возникновения РМЖ (до 40 лет), отягощенный семейный анамнез (наличие одного и более РМЖ или РЯ у родственниц первой или второй линии родства).
ДНК из лейкоцитов периферической крови выделяли с помощью набора DNeasy Blood & Tissue Kit («Qiagen»). Концентрация ДНК была измерена на спектрофотометре
XXII РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС
Морфологические исследования в онкологии
Таблица 1
Ген Координата Транскрипт: кДНК Белок Количество
BRCA1 chr17:41209079 NM_ _007300.3: c. 5329dup p. Gln1777Profs*74 40
BRCA1 chr17:41258504 NM_ _007300.3: c. 181T>G p. Cys61Gly 11
BRCA1 chr17:41215382 NM_ _007300.3: c. 5224C>T p. Gln1742* 8
BRCA2 chr13:32972745 NM_ _000059.3: c. 10095_10096insT p. Ser3366* 6
BRCA2 chr13:32906576 NM_ _000059.3: c. 965_966dup p. Val323Lysfs*2 5
BRCA2 chr13:32913562 NM_ _000059.3: c. 5070A>C p. Lys1690Asn 4
BRCA1 chr17:41209095 NM_ _007300.3: c. 5314C>T p. Arg1772* 4
BRCA1 chr17:41243844 NM_ _007300.3: c. 3700_3704del p. Val1234Glnfs*8 4
BRCA1 chr17:41245587 NM_ _007300.3: c. 1961del p. Lys654Serfs*47 3
BRCA1 chr17:41226348 NM_ _007300.3: c. 4738G>A p. Glu1580Lys 3
BRCA2 chr13:32950929 NM_ _000059.3: c. 8754+1G>A Splice site 3
BRCA1 chr17:41215969 NM_ _007300.3: c. 5138-1G>A Splice site 3
BRCA2 chr13:32900279 NM_ _000059.3: c. 468dup p. Lys157* 2
BRCA2 chr13:32907409 NM_ _000059.3: c. 1796_1800del p. Ser599* 2
BRCA2 chr13:32968950 NM_ _000059.3: c. 9381G>A p. Trp3127* 2
BRCA2 chr13:32911298 NM_ _000059.3: c. 2808_2811del p. Ala938Profs*21 2
BRCA1 chr17:41243513 NM_ _007300.3: c. 4035del p. Glu1346Lysfs*20 2
BRCA1 chr17:41234451 NM_ _007300.3: c. 4327C>T p. Arg1443* 2
BRCA2 chr13:32907434 NM_ _000059.3: c. 1819A>T p. Lys607* 2
BRCA1 chr17:41244145 NM_ _007300.3: c. 3403C>T p. Gln1135* 2
BRCA1 chr17:41245197 NM_ _007300.3: c. 2351C>A p. Ser784* 2
Таблица 2 NanoVue Plus («GE Healthcare») и составляла 30-50 нг/мкл.
Ген Частота встречаемости Подготовка библиотек для секвенирования осуществля-
в выборке лась с помощью NimblGen SepCapEZ Choice («Roche»).
BRCA1 19,80% Секвенирование проводилось на приборе Illumina MiSeq
BRCA2 8,50% («Illumina»). Картирование прочтений на референсную
ATM 3,11% последовательность генома человека (hg19) проводилось
CDKN2A 2,20% при помощи алгоритмов BWA-MEM, качество исходных
CDH1 2% данных, выравнивания, обогащения и покрытия целе-
CHEK2 2% вых регионов проверялось с помощью FastQC, BAMQC
POLE 1,90% и NGSrich.
APC 2% Поиск нуклеотидных вариаций выполнялся с помощью
FANCL 1,55% GATK HaplotypeCaller, Samtools, FreeBayes. Полученные
MLH1 1,55% VCF-файлы всех комбинаций алгоритмов выравнивания
MSH6 1,40% и поиска вариаций объединялись методом опорных век-
PALB2 1,40% торов, что увеличивало общие показатели чувствительно-
CDK11 1,40% сти и специфичности при выявлении мутаций.
TP53 1,16% Консенсусный VCF-файл обрабатывался с помо-
MLH3 1% щью программы SnpSift (глубина прочтения более 10)
MSH2 0,90% и аннотировался с помощью SnpEff (анализ всех транс-
STK11 0,90% криптов), ANNOVAR (анализ частот аллелей в ExAC, 1000G
FaNCD2 0,77% и ESP6500, алгоритмы проверки функциональной значи-
RAD51C 0,77% мости SIFT, PolyPhen2, MutationTaster, FATMM, CADD,
NF1 0,77% DANN, Eigen) и Alamut Batch (влияние на сплайсинг, базы
PM2 0,77% данных dbSNP, ClinVar, HGMD Professional).
NBN 0,54% Среднее покрытие составило 473x, доля корректно
POLD1 0,54% картированных прочтений - 99,6%, доля целевых регио-
RAD50 0,54% нов с покрытием выше 100x - 96,2%.
BUB1 0,54%
RET 0,54%
Отрицательные образцы 42,6%
М. Г. Гордиев, Д. Д Сакаева, В. В. Петкау, Р. Ф. Еникеев, О. И. Бровкина, Л. Х. Шигапова, М. О. Дружков, Е. И. Шагимарданова, Д. С. Ходырев, О. А. Гусев,
А. Г. Никитин, Р. Р. Фаисханова, А. Ф. Насретдинов, Ю. К. Моляка, Е. Г. Овчинникова, И. С. Шумская
Таргетное секвенирование нового поколения генов для выявления редких мутаций при наследственном раке молочной железы
Результаты и обсуждение
В результате секвенирования 519 образцов крови пациенток с наследственным РМЖ было выявлено 196 патогенных и 102 предположительно патогенных мутаций. Мутации в генах BRCA1-2, встречаемость в выборке которых больше двух, представлены в табл. 1. Самой частой мутацией, как и ожидалось, оказалась NM_007300.3: с. 5329dup (21% всех мутаций в BRCA1-2). Суммарная доля мутаций, считающихся частыми и представленных в коммерческих наборах на основе ПЦР, составила 30%. Таким образом, даже если анализировать мутации только в генах BRCA1-2, для большинства пациенток (70%) из выборки результаты анализа ПЦР методом будут неинформативными.
34% мутаций в генах BRCA1-2 в выборке имели редкие мутации, встречаемость которых в выборке не более одного раза. Это сравнительно большое количество носительниц мутаций, которое можно выявить только методом NGS.
Если говорить о мутациях в других генах, участвующих в системе репарации ДНК, то частота мутаций в этих генах представлена в табл. 2.
На сегодня идет поиск корреляций и взаимосвязи между мутационным статусом в генах репараций ДНК и особенностями возраста манифистации, анамнестическими особенностями и рецепторным статусом в выборке наследственного РМЖ.
Выводы
В результате NGS анализа образцов от 519 пациентов было выявлено 196 патогенных и 102 предположительно патогенных мутаций в генах репараций ДНК. Большинство из этих мутаций не входит в ПЦР-панель коммерческих наборов для выявления наследственных мутаций РМЖ. С появлением все большего массива данных о встречаемости и представленности наследственных мутаций в РМЖ возрастает необходимость использования NGS для секвенирования большой панели генов, формирующих наследственный синдром РМЖ.
Литература • References
1. NHGRI: Breast Cancer Information Core. [Online]. Available: https://research.nhgri.nih.gov/bic/. [Accessed: 25-Jul-2016].
2. Имянитов Е. Н., Наследственный рак молочной железы. Практическая онкология. 2010. Т. 11. № 4. С. 258-266.
3. Хасанова А. И., Гордиев М. Г., Ратнер Е. Ю., Жаворонков В. В., Хасанов Р. Ш., Никитин А. Г., BRCA-ассоциированный рак молочной железы у представительниц татарской национальности на примере клинического случая. Приволжский онкологический вестник. 2016. Т. 24. № 2. С. 104-108.
