CC BY
11
СВОЙСТВА ЦИНКСОДЕРЖАЩИХ ГУМАТОВ ТОРФА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ МИНЕРАЛОБИОТИЧЕСКИХ АНТИОКСИДАНТОВ
Н.Б. Мельникова, О.А. Воробьева, Д.С. Малыгина, А.А. Балакирева, А.М. Хлюпина, Д.А. Пантелеев, А.Г. Соловьева
ФГБОУ ВО "Приволжский исследовательский медицинский университет " Минздрава России, Нижний Новгород
Abstract
Humic acids are effective antioxidants and detoxicants. They can be used as a platform for design of mineralobiotic complexes that make up the primary and secondary deficiency of biogenic metals, for example zinc ions.
Zinc humates obtained by treating sodium salts of humic acids with an aqueous solution of zinc sulfate are heterogenic complexes and can include nanoparticles of zinc oxide. Heterogenic matrix consists of zinc complexes with fulvic, hematomelanic and humic acids. The complexation is due to bonding of zinc with quinoid, carboxyl groups and phenolic hydroxyls. The surface concentration of zinc is equal to 360±50 mg/g.
It has been shown on the model of stomach medium (pH 2.0, HCl) and intestines medium (pH 9.0, NaOH) that both metal ions and humic acids are released from zinc humates in the case of oral administration. In vitro experiments on rat blood showed high antioxidant properties of the studied zinc humates.
Key words: humic acids, zinc ion, antioxidant activity, mineralobiotic complexes
В работе рассмотрены гумусовые кислоты, проявляющие антиоксидантные и детоксикационные свойства, как удобная платформа для создания минералобиотических комплексов, восполняющих первичный и вторичный недостаток ионов биогенного металла, на примере цинка.
Обработка натриевых солей гумусовых кислот (фулиевой, гематомелановой и гуминовой) водным раствором сульфата цинка приводит к сложным комплексам гетерогенной природы звеньев гумусовых кислот с цинком и может включать иммобилизованные наночастицы оксида цинка. Концентрация цинка в полученной матрице (гумат цинка) составляет от 360±50 мг/г.
Показано, что гуматы цинка в средах, имитирующих желудок (pH 2, HCl) и кишечник (pH 9, NaOH), высвобождают как ионы металлов, так и гумусовые кислоты, что предполагает их пероральный путь введения. В экспериментах in vitro на крови крыс были продемонстрированы высокие антиоксидантные свойства изучаемых гуматов цинка.
Ключевые слова: гумусовые кислоты, ион цинка, антиоксидантная активность, минералобиотические комплексы
Гумусовые кислоты (гуминовые, гематомелановые, фулиевые) привлекают внимание исследователей своими интересными фармакологическими свойствами, такими как высокая антиоксидантная активность [1, 26], способность выступать в качестве хелатирующего агента ионов тяжелых металлов, радионуклидов, пестицидов и других полюентов [10, 21, 22], а также способность противостоять вирусной инфекции [7]. Наиболее изучена биологическая активность гуматов в ветеринарии. Гуматы используются в качестве эффективных энтеросорбентов для выведения из организма токсинов микробного, грибкового происхождения, химических ядов, солей тяжелых металлов, радиотоксинов [4]; для стимуляции продуктивности животных [8, 14], выступая в качестве средств, способствующих повышению эффективности пищеварения; как иммуномодуляторы [24]; в качестве лекарственных средств, обладающих противоопухолевым, антимикробным, ранозаживляющим и другим действием [3, 2, 12].
Антиоксидантная активность является главным свойством гумусовых кислот (ГК), благодаря которому эти вещества эффективны при лечении онкологических и других заболеваний, в которых процессы ПОЛ являются ведущими [5, 20].
С другой стороны, ионы металлов в составе ГК могут дополнять их основные фармакологические свойства, увеличивая липофильность или гидрофильность соединения, регулируя биодоступность ГК и выполняя свою самостоятельную роль, при этом использовав ГК как вектор доставки нужного катиона [18].
Биологическое значение цинка для живых организмов как жизненно важного микроэлемента определяется тем, что он является структурным компонентом биологических мембран, клеточных рецепторов, протеинов и входит в состав или определяет функциональную активность более 200 энзиматических систем (инсулин, кортикотропин, соматоропин, гонадотропин, энолазы, гистидазы, депептидазы, амилазы, карбоангидраза, карбоксипептидазы поджелудочной железы, дегидрогеназы глютаминовой кислоты и др.) [15, 16, 11, 6, 23].
Биологическое действие препаратов цинка в значительной степени зависит от природы цинксодержащего соединения (оксидная, хелатная, растворимая форма препарата). Так, например, при лечении собак установлено, что цинк в хелатной форме активнее связывается в шерсти, чем в неорганической (оксидной), поэтому шерсть растет значительно быстрее. Растворимый сульфат цинка иногда плохо переносится животными (вызывает рвоту), и его надо давать с кормом, тогда как глюконат цинка обычно переносится лучше [25].
В настоящей работе изучены свойства гуматов цинка, полученных из гуматов, выделенных из торфа. В задачи исследования входило:
1. изучение свойств и элементного состава гуматов атомно адсорбционной спектроскопией (ААС), ИК-, УФ- спектральными и потенциометрическими методами анализа;
2. исследование свойств гуматов цинка в среде, имитирующей кислотность желудка и щелочность кишечника;
3. оценка антиоксидантной активности гуматов цинка.
Материалы и методы
Приборы. Электронные спектры поглощения были получены на приборе «Bioline Specord S-100» (Analytik Jena, Germany) в области 190-600 нм, толщина кварцевой кюветы 10 мм. Элементный анализ цинка проводили с использованием атомно-абсорбционного спектрофотометра (ААС) Shimadzu AA 7000 (Japan) с двух-лучевой оптической схемой и автоматическим дозатором проб, среда ацетилен-воздух. pH контролировали на электронном стационарном рН-метре «рН-150М» фирмы РУП (Гомельский завод измерительных приборов, Белоруссия). ИК-спектры снимали на инфракрасном спектрофотометре с преобразователем Фурье «IR Prestige-21» (Shimadzu, Japan) в области 4000-400 см-1 в виде смесей с KBr.
Гумусовые кислоты в виде порошков были предоставлены фирмой Beauty Land (г. Н. Новгород). Гуматы натрия в виде смеси солей гумусовой, фулиевой и гематомелановой кислот были получены растворением гумусовых кислот в водно-спиртово-щелочной среде при контроле pH (не выше 9.0). Гуматы цинка были получены добавлением водного раствора сульфата цинка и очисткой образующихся коричневых осадков.
Натрия гидроокись (чда, ГОСТ 4328-77, АО «Химреактив»), цинка сульфат (ч, ГОСТ 4174-77, АО «Химреактив»), этанол (95%; OOO «Гиппократ», Самара), вода очищенная (ФС 42-0324-09), полученная на установке системы очистки воды Elix 3 с картриджем Progard (Millipore, Франция).
Исследования in vitro. Для исследований использовали кровь, стабилизированную цитратом натрия (1:9). К цельной крови добавляли растворы, содержащие гуминовые кислоты, гуматы натрия и гуматы цинка в концентрациях 2, 5, 10 мкг / 1 мл. Эритроциты двукратно отмывали в 0.9% NaCl путем центрифугирования 10 мин при 1600g.
Интенсивность ПОЛ определяли по уровню содержания вторичного продукта СРО - малонового диальдегида (MDA) - в плазме и эритроцитах методом M. Uchiyama, M. Mihara [13]. Активность СОД (SOD, EC 1.15.1.1) определяли в гемолизате отмытых эритроцитов (1:10) по ингибированию образования продукта аутоокисления адреналина [19].
Статистическую обработку проводили в программе Statistica 7,0.
Результаты работы и их обсуждение
1. ИК-спектралъные свойства гуматов цинка
Изучаемые нами гумусовые кислоты торфа представляют собой гетерогенные структуры, в состав которых входят преимущественно фулиевая кислота (ФК) и менее полярная гуминовая кислота. Типичные модели фрагментов этих структур представлены на рисунке 1.
ноос.
ноос
СООН u СН2ОН Н2 I
Vh"c
Vi 2 с—СООН
II Но о 2
СООН он
COOH COOH
-с—с-Н2 II о
Фулиевая кислота HC=O I
(CH - OH)4 C=O
-СНОН
\
СООН
R-CH i
C=O I
HN
O
OH
Гуминовая кислота Рис. 1. Модельные структуры фулиевой и гуминовой кислот
Традиционно для характеристики гумусовых кислот используют ИК-спектры [17, 9], отмечая полосы валентных колебаний карбонилов и С-О в фенолах. Для ИК-спектров фулиевых кислот характерны: отсутствие полос валентных колебаний C=O группы (амид I, амид II) 1550-1590 см-1; ослабление или практическое отсутствие полос валентных колебаний кето- и хиноидных структур 1700-1720 см-1; интенсивное проявление полос валентных колебаний СО в фенолах 1196 см-1 и полос валентных колебаний карбоксилат-аниона 1607 см-1. В отличие от этого, для гуминовых кислот хорошо представлены полосы валентных колебаний C=O группы (амид I, амид II) 1550-1590 см-1, а также валентные колебания C=O в хиноидных структурах.
На рисунке 2 представлен спектр исходной гумусововой кислоты, в состав которой входит гуминовая кислота (1718см-1, 1612 см-1) и фулиевые кислоты (1035 см-1, 1607 см-1).
105 %T 90
4"к—j 4
ч к ! 1
Ü w £ С
11
4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500
Рис. 2. ИК-спектр исходной гумусовой кислоты
75
60
45
В спектрах гумата цинка исчезли полосы валентных колебаний C=O групп 1700-1720 см-1, характерных для хиноидных структур и кето-групп. Этот факт, вероятно, свидетельствует об образовании комплексов хелатного типа с ионами цинка с участием преимущественно хиноидных структур гуминовой кислоты (рис. 3).
Рис. 3. ИК-спектры гумата цинка до и после длительной выдержки в воде
(десорбции)
Этот факт хелатообразования подтверждается изучением осадка гуматов металлов после 96-ти часовой выдержки гуматов в воде при перемешивании.
Для характеристики гуматов цинка нами были получены гуматы двухвалентных металлов (железа, марганца, кальция и меди) обработкой гуматов натрия водными растворами солей металлов - сульфатами железа, марганца и меди и ацетатом кальция. Из данных таблицы 1 следует, что ИК-спектры всех гуматов переходных металлов имеют общие спектральные характеристики. Хелатные комплексы имеют отчасти характер солевых комплексов, о чем свидетельствует существенное уширение полос поглощения после десорбции части ионов цинка в воду.
Таким образом, можно предположить, что изучаемый гумат цинка является комплексным соединением солевого характера.
Таблица 1. Данные ИК-спектров гуматов металлов
М-ГК Волновое число, см-
3500-3200 2950- 1700-1500 1400- 1100 1080-900 875 600-400
-ОН; -]]Н; 2850 С=0; амид I и 1300 С-О в кратные
межмолек. -СН3; II; ароматика; СН3; спиртах и связи
Н-связи -СН2 С00- -СН2 эфирах
^ГК 3400-3500 2920; 1710; 1370 - 1010 910; -
лит. 2860 1610 1450- 750
данные 1430 875
^ГК 3396; 3367 2920; 2850 1718; 1612 - 1265 1035 - -
Fe-ГК 3362; 2923; 1703; 1378 1178 1094; - 628,82
3357 2853 1612 1026 сульфаты
Mn-ГК 3337; 2928; 1714; 1398; 1265; 1032 - 599,89
из 3309; 2854 1614 1390; 1212; сульфаты,
спирта 3199 1374 1174 карбонаты
Zn-ГК 3420; 2923; 1597; 1398 1120; 1063; - 600,85
3400; 2852 1575 1063 905 сульфаты
3310
Ca-ГК 3378 2923; 2851 1577; 1573; 1556 1400 1076; 1051 871 621 сульфаты
Cu-ГК 3384; 2958; 1577; 1405; 1115 1061 875 605,67
3323; 2924; 1556 1400; сульфаты
3270 2853 1340
2. Изучение свойств гуматов цинка в среде, имитирующей кислотность желудка (pH около 1) и щелочность кишечника (pH около 9)
Моделирование поведения гумата цинка в желудке и кишечнике проводилось методом изучения десорбции ионов цинка в воде, 0,01М растворе соляной кислоты (pH около 1) и в 0,01М NaOH в течение 2 часов (рис. 4, табл. 3).
380
370
360
350
Ъ 340 €
и 330 320 310 300
ЧР
гз
га
I-
га
г
т га
Р
ш
г
к ^
о с!
101 99 97 95 93 91 89 87 85
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Время, ч
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Время, ч
Рис. 4. Динамика десорбции ионов цинка из гумата в воду во времени: а) С = ^т) б) а = Ят), где сг ^
Сш
, степень десорбции или доля оставшихся ионов металла в гумате
Из данных рисунка 4 следует, что десорбция во времени крайне мала (до 15%), что может быть объяснено прочностью связывания ионов цинка с матрицей ГК.
Проверка этого предположения проведена сопоставлением результатов анализа ААС и титриметрическим определением ионов цинка трилонометрически. В таблице 2 продемонстрированы различия этих анализов. Полученные данные свидетельствуют о том, что часть ионов цинка иммобилизована в матрицу ГК в виде наночастиц оксида цинка или гидроксидов цинка, не способных вступать в реакцию с трилоном Б, образующим комплексы включения с ионом цинка состава 1:1.
Таблица 2. Сопоставление данных анализа цинка в воде методами ААС и
титримет рии
т,ч Сzn титр, мг/г СznААc, мг/г
1 1,5 3,9
3 1,4 5,0
6 2,2 5,4
24 2,2 9,8
48 2,5 14,8
72 3,0 15,3
96 2,8 15,3
В кислой среде при pH 1-2 образующиеся кластеры и наночастицы оксида цинка способны растворяться, высвобождая цинк более полно из матрицы гуматов, чем в воде. В щелочных средах при pH около 9 солевые комплексы гуматов цинка дополнительно образуют оксиды и гидроксиды цинка. Данные таблицы 3 подтверждают эти предположения.
Таблица 3. Десорбция ионов цинка из гумата в различных средах
Концентрация, мг/г Суточная доза, мг
H2O96ч 0,01М ЖЬч 0.01М NaOH2ч
15.3 49.5 1.9 15
Из данных таблицы 3 также следует, что ионы цинка переходят из гуматов в раствор, при этом концентрация ионов металлов достаточно велика цинка - 13% от исходного. Следовательно, при пероральном применении гумат цинка способен восполнять дефицит ионов цинка.
Для установления роли гумусовых кислот как векторов доставки катионов цинка нами исследованы 2% растворов гуматов цинка в 0,01М соляной кислоте методом электронной спектроскопии. В качестве контроля был использован раствор сульфата цинка в концентрированной соляной кислоте.
Электронные спектры гумусовых кислот аналогичны спектрам гумата цинка, в них отсутствует поглощение в видимой части спектра, характерное для сложных хлоридных комплексов цинка, в отличие от спектров гумата меди, которые характеризуются поглощением в области 600 нм (рис. 5).
Можно предположить, что в раствор соляной кислоты из гумата цинка переходят как катионы, так и анионная часть гумусовых кислот.
нм.
Рис. 5. Электронные спектры гумата цинка и ZnSO4 в растворах соляной кислоты. 1 - раствор ZnSO4; 2 - Zn-гумат в 0,01 М HCl (20 г/л), разбавление в 8 раз; 3 - Zn-гумат в конц. HCl (5.68 г/л), разбавление в 50 раз; из 1 г Zn-гумата в 22 мл HCl
3. Биологическая активность гуматов цинка
Влияние гумусовых кислот и их солей на неферментную антиоксидантную активность в СРО-процессах в плазме крови неоднозначно и незначительно (табл. 4). Концентрация малонового диальдегида (МДА) в плазме крови снижалась на 2-12%.
В эритроцитах наблюдалось существенное снижение уровня МДА (табл. 4), что характеризует сильное влияние как гумусовых кислот на процессы СРО.
Ионизованные гумусовые кислоты Na-ГК и Zn-ГК оказывают больший эффект по сравнению с неионизованными формами. Концентрация МДА статистически значимо снижалась под действием ионизованных и неионизованных гумусовых кислот от 30 до 60% (табл. 4). Снижение интенсивности липопероксидации в эритроцитах по показателю МДА наиболее эффективно в солях гумусовых кислот.
Таблица 4. Характеристика свободно-радикального окисления (СРО)
гумусовых кислот
Матрица МДА*(плазма) МДА(эритроциты)
2 мкг 2 мкг 5 мкг 10 мкг
% от контроля s2 % от контроля s2 % от контроля s2 % от контроля s2
ГК 98,1 0,01 36,2 3,48 67,7 0,04 34,9 0,01
Ш-ГК 85,6 0,02 54,6 0,02 34,7 0,02 19 0,04
Zn-ГК 120,5 0,01 61,6 0,01 39,3 0,02 32,1 0,02
Контроль 100,0 0,02 100,0 0,20 100,0 0,02 100,0 0,25
МДА* - малоновый альдегид как основной продукт СРО
В эритроцитах отмечали повышение активности супероксидисмутазы (СОД), по сравнению с контролем, при добавлении к 1 мл крови 5 мкг всех исследуемых растворов гумусовых кислот (табл. 5).
Таблица 5. Влияние дозы на ферментную антиоксидантную активность в
Доза ГК Ш-ГК Zn-ГК
% s2 % s2 % s2
2 мкг 112,4 3,28 136,0 16,97 109,6 6,81
5 мкг 136,1 1,68 181,6 9,58 134,9 8,69
10 мкг 182,7 15,06 105,9 8,33 142,8 3,49
Влияние гумусовых кислот и их солей при всех дозах на активность СОД более значительное по сравнению с контролем.
Повышение антиоксидантных резервов эритроцитов, вероятно, способствовало обрыву цепных реакций ПОЛ, о чем свидетельствовало как снижение концентрации МДА, так и повышение активности СОД. При этом, превалирование ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной системы защиты над процессами липопероксидации может свидетельствовать об ингибировании системы биологического окисления под влиянием гумусовых кислот.
Заключение
Все изученные образцы гуматов цинка представляют собой сложные комплексы, которые содержат прочно связанный ион цинка в матрице гумусовых кислот. Наиболее вероятно, что в комплексах гуминовой кислоты ион цинка связан с хиноидными структурами гуминовой кислоты по типу хелата.
Для восполнения дефицита цинка возможно использование гуматов цинка при пероральном приеме, поскольку в желудке возможно их высвобождение. Практическое отсутствие десорбции ионов цинка в воде и незначительное высвобождение цинка из слабощелочных растворов при pH 9, предполагающее иммобилизацию бактерицидных наночастиц оксида цинка, а также антиоксидантная активность гуматов цинка позволяют предложить их в качестве компонента для лечения кожных заболеваний.
Список литературы
1. Aeschbacher M., Graf C., Schwarzenbach R. P., Sander M. Antioxidant Properties of Humic Substances // Environmental Science & Technology. 2012. Vol. 46, № 9. P. 4916-4925.
2. Asli A., Becer E., Okcanoglu T.B., Güvenir M., Süer K., Vatansever S. The Cytotoxic Effects of Humic Acid on Human Breast Cancer Cells // Proceedings. 2018. Vol. 2, № 25. P.1565.
3. Aydin S.K., Dalgic S., Karaman M., Kirlangic O.F., Yildirim H. Effects of Fulvic Acid on Different Cancer Cell Lines // Proceedings. 2017. № 1. P. 1031.
4. Cwiel^g-Piasecka I., Medynska-Juraszek A., Jerzykiewicz M., D^bicka M., Bekier J., Jamroz E., Kawalko D. Humic Acid and Biochar as Specific Sorbents of Pesticides // Journal of Soils and Sediments. 2018. Vol. 18, №8. P. 2692-2702.
5. Efimova I.V., Khil'ko S.L., Smirnova O.V. Antioxidant Activity of Humic Acids in Radical-Chain Oxidation Processes // Russian Journal of Applied Chemistry. 2012. Vol. 85, № 9. P.1351-1354.
6. Fukada T., Yamasaki S., Nishida K., Murakami M., Hirano T. Zinc Homeostasis and Signaling in Health and Diseases: Zinc Signaling // JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry . 2011. Vol. 16, № 7. P.1123-1134.
7. Helbig B., Klöcking R., Wutzler P. Anti-Herpes Simplex Virus Type 1 Activity of Humic Acid-Like Polymers and Their O-Diphenolic Starting Compounds // Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 1997. Vol. 8, №3, P. 265-273.
8. Islam K.M.S., Schumacher A., Gropp J.M. Humic Acid Substances in Animal Agriculture // Pakistan Journal of Nutrition. 2005. Vol. 4, №3. P.126-134.
9. Ismail T., Ayyildiz H.F., Topkafa M., Arslan F., Ta§ A., Sherazi S.T.H., Kara H. Chemical and Spectroscopic Characterization of Humic Acid Isolated from Ilgin Lignite, Turkey // International Journal of Scientific and Technological Research. 2015. №1. P. 176-183.
10. Kerndorff H., Schnitzer M. Sorption of Metals on Humic Acid // Geochimica et Cosmochimica Acta. 1980. Vol. 44, № 11. P. 1701-1708.
11. Kimura E. Roles of Zinc(II) Ion in Zinc Enzymes // Pure and Applied Chemistry. 1993. Vol. 65, № 3. P. 355-359.
12. Maguey-Gonzalez J.A, Michel M.A, Baxter M.F.A, Solis-Cruz B., Hernandez-Patlan D., Merino-Guzman R., Hernandez-Velasco X., Latorre J. D, Hargis B.M, Tellez G., Gomez-Rosales S. Effects of Humic Acids on Recovery of Salmonella Enterica Serovar Enteritidis // Annals of animal science. 2018. № 18. P. 387-399.
13. Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Analytical Biochemistry. 1978. Vol.86. P. 271-278.
14. Nagaraju R., Reddy B.S.V., Gloridoss R., Suresh B.N., Ramesh C. Effect of Dietary Supplementation of Humic Acids on Performance of Broilers // Indian Journal of Animal Sciences. 2014. Vol. 84, № 4. P. 447-452.
15. O'Dell B. L. Role of Zinc in Plasma Membrane Function // The Journal of Nutrition. 2000. Vol. 130, № 5. P. 1432-1436.
16. Riordan J.F. The Role of Metals in Enzyme Activity // Ann Clin Lab Sci.1977. Vol.7, №2, P.119-129.
17. Sakellariadou F. Spectroscopic Studies of Humic Acids from Subsurface Sediment Samples Collected across the Aegean Sea // Mediterranean Marine Science. 2006. Vol. 7, № 2. P. 11-18.
18. Shungui Zh., Chen Sh., YuanY., Lu Q. Influence of Humic Acid Complexation with Metal Ions on Extracellular Electron Transfer Activity // Scientific Reports. 2015. Vol. 5, № 1. P. 1-9.
19. Sirota T.V. A new approach to the investigation of adrenaline autooxidation and its application for determination of superoxide dismutase activity // Biomeditsinskaya Khimiya. 1999. Vol. 45, №2. P. 263-272.
20. Smirnova O., Efimova I., Khil'ko I. Antioxidant and Pro-oxidant Activity of Ascorbic and Humic Acids in Radical-Chain Oxidation Processes // Russian Journal of Applied Chemistry. 2012. Vol. 85, № 2. P. 253-256.
21. Spark K.M., Wells J.D., Johnson B.B. The Interaction of a Humic Acid with Heavy Metals // Soil Research. 1997. Vol. 35. № 1. P. 89-101.
22. Sugeng W., Eko H., Taufiq A. Aluminum Detoxification by Humic Substance Extracted from Compost of Organic Wastes // Jurnal Tanah Tropika. 2010. Vol. 15, №1. P 19-24.
23. Taiho K., Tsuji T., Hashimoto A., Itsumura N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiological Reviews. 2015. Vol. 95, № 3. P. 749-784.
24. Vetvicka V., Baigorri R., Zamarreno A.M., Garcia-Mina J.M., Yvin J.-C. Glucan and Humic Acid: Synergistic Effects on the Immune System // Journal of Medicinal Food. 2010. Vol. 13, № 4. P. 863-869.
25. White S.D., Bourdeau P., Rosychuk R., Cohen B., Bonenberger T., Fieseler K.V., Ihrke P. Zinc-responsive dermatosis in dogs: 41 cases and literature review. Veterinary dermatology. 2001. № 12. P.101-109.
26. Zykova M., Schepetkin I., Belousov M., Krivoshchekov S., Logvinova L., Bratishko K., Yusubov M., Romanenko S., Quinn M. Physicochemical Characterization and Antioxidant Activity of Humic Acids Isolated from Peat of Various Origins // Molecules. 2018. Vol. 23, № 4. P. 753.
