CC BY
53
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
СВОБОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ И ИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ МЕТАБОЛИТЫ В ГИПОТАЛАМУСЕ КРЫС ПРИ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ДИНИЛОМ И ИХ КОРРЕЛЯЦИЯ С АМИНОКИСЛОТНЫМ СПЕКТРОМ
ПЛАЗМЫ КРОВИ
ШЕЙБАК В.М.*, ЛЯХ И.В.*, ДОРОШЕНКО Е.М.**,
СМИРНОВ В.Ю.**, МОГИЛЕВЕЦ О.Н.***
УО «Гродненский государственный медицинский университет», кафедра биологической химии, *
Центральная научно-исследовательская лаборатория,** кафедра фтизиопульмонологии и профпатологии***
Резюме. Однократное введение животным динила в дозах 5 или 500 мг/кг массы нарушает обмен нейроактивных аминокислот в гипоталамусе и изменяет их коррелятивные взаимосвязи с аминокислотами плазмы крови. Изменения сопровождаются ослаблением утилизации аминокислот и дисбалансом процессов возбуждения и торможения, причем для большинства нарушений характерна зависимость их выраженности от дозы введенного динила.
Ключевые слова: динил, гипоталамус, плазма, нейроактивные аминокислоты.
Abstract. Single administration of dinil to animals in doses of 5 mg or 500 mg / kg leads to disruption of neuroactive amino acids metabolism in the hypothalamus and changes their relationship with amino acid levels in blood plasma. These changes are accompanied by the decrease in utilization of amino acids and disbalance of excitation and inhibition processes, and there is correlation between the dose of injected dinil and the intensity of changes.
Йнные по воздействию динила (смесь 5% дифенила и 75% дифенилоксида) а человека немногочисленны и зача-отиворечивы. Кратковременное воздействие (минута и меньше) газообразного динила на человека в концентрации 35 мг/м3 перено-
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, г.Гродно, 230009, ул. Горького, 80, Гродненский государственный медицинский университет, кафедра биологической химии. E-mail: [email protected], моб.тел.: +375 (25) 950-59-62 - Лях И.В.
сится довольно легко [1], хотя более длительная ингаляция парами динила вызывает раздражение верхних дыхательных путей, а попадание на кожу или на роговицу глаза может вызвать эрозивное воспаление [2]. У лиц, длительно контактирующих с динилом на производстве (изготовление синтетических волокон), развивается астеновегетативный синдром, появляется альбуминурия, нарушается белоксинтезирующая и антитоксическая функции печени, выявляются дистрофические изменения в миокарде [3].
Данные о влиянии динила на ЦНС и, в частности на обмен нейроактивных аминокислот в гипоталамусе, немногочисленны. Гипоталамус, выполняя многообразные физиологические функции (от контроля потоотделения до регуляции сосудистого тонуса) [4], является очень чувствительным к внешним воздействиям отделом. Ранее нами было показано, что введение динила приводит к изменению содержания биогенных аминов в головном мозге и некоторых других тканях крыс [5, 6].
Целью данной работы явилось выявление возможного дозозависимого влияния ди-нила на уровни нейроактивных аминокислот в гипоталамусе.
Методы
Эксперименты выполнены на 24 белых крысах-самцах массой 180-220 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде. Опытным группам животных однократно внутрибрюшинно вводили динил в дозах 5 или 500 мг/кг массы в объеме 0,5 мл/кг. Контрольная группа животных получала эквиобъемные количества физиологического раствора. Животных дека-питировали через 24 ч. после введения дини-ла, забирали и помещали в жидкий азот образцы плазмы и гипоталамуса.
В хлорнокислых экстрактах из плазмы и мозга крыс определяли концентрации свободных аминокислот, используя хроматографическую систему Agilent 1100 (США). Прием и обработку данных проводили с помощью программы Agilent ChemStation A10.01 [7]. Статистическую обработку полученного материала проводили с помощью t-критерия Стьюдента в пакете прикладных программ Statistica 7.0.
Результаты и обсуждение
Проведенный нами анализ уровней свободных аминокислот и их производных в гипоталамусе выявил наличие дозозависимых изменений их физиологических концентраций в ответ на поступление в организм динила. Так, если при введении животным динила в дозе 5 мг/кг наблюдали изменения уровней цистеиновой кислоты, аспарагина, в-амино-
масляной кислоты, глутамина, лейцина, треонина, ГАМК, то после введения динила в дозе 500 мг/кг - цистеиновой кислоты, аспарагина, гистидина, 1 -метилгистидина, а-ами-ноадипиновой кислоты, этаноламина, лейцина, метионина, фенилаланина, пролина. Следует отметить, что в гипоталамусе этой группы животных увеличивалось общее содержание незаменимых аминокислот (табл. 1).
Анализ и интерпретация колебаний свободных аминокислот и их производных в ткани мозга всегда сопряжены с определенными трудностями, поскольку аминокислоты в мозге выполняют не только метаболическую, структурную, но и нейротрансмиттерную функции. Глутамин в мозге может накапливаться вследствие торможения как синтеза глутамата, так и активации глутаминсинтетазы в астроцитах или ингибирования глутаминазы нейронов [8]. Поэтому повышение содержания аспарагина и глутамина у животных, получавших динил в дозе 5 мг/кг массы, может свидетельствовать об увеличении связывания свободного аммиака, что также подтверждается снижением соотношения глутамат/глутамин в этой группе животных [9]. Увеличение концентрации метионина может указывать на активацию окислительно-восстановительных процессов и торможение образования S-аденозилметионина [10].
Снижение содержания основного тормозного нейромедиатора ГАМК у животных, получавших 5мг/кг динила, и отсутствие изменения его уровня у животных, получавших ди-нил в концентрации 500 мг/кг, может быть связано с уменьшением концентрации этанолами-на в этой группе животных, который способен оказывать активирующее влияние на ГАМК-трансаминазу, а также с увеличением содержания глутамина, который как предшественник вызывает ее усиленный синтез с дальнейшим конкурентным торможением глутаматдекарбок-силазы избытком этого нейромедиатора, что подтверждается положительной корреляционной связью между данными соединениями.
В то время как содержание заменимых аминокислот отражает существующий баланс между их синтезом de novo, использованием для энергетических нужд клетки и превращениями по пути трансаминирования, концент-
Таблица 1
Содержание нейроактивных аминокислот в гипоталамусе крыс (нмоль/г ткани) через 24 часа после однократного введения динила (представлены только достоверные изменения, M±m)
Аминокислота Контроль Динил 5 мг/кг Динил 500 мг/кг
Цистеиновая кислота 261±17 181±11* * 181±12* *
Аспарагин 126±5 143±5* 154±6**
Метилгистидин 5,15±0,41 4,79±0,6 7,5±0,39**
а-аминоадипиновая кислота 8,64±1,81 9,5±1,2 16±1,7*
Р-аминомасляная кислота 14±0,4 10,3±0,8** 13±0,4
Этаноламин 1963±79 1622±198 1599±18**
ГАМК 5561±183 5049±109* 5636±86
Г лутамин 3265±533 4920±153** 3990±254
Г истидин 123±8 137±6 163±16*
Лейцин 155±8 191±11* 196±12*
Лизин 238±25 326±42 394±36*
Метионин 26±2 30±2 37±2*
Фенилаланин 49±3 54±2 58±3*
Пролин 106±6 119±5 136±11*
Треонин 677±40 552±31* 595±12
Сумма незаменимых аминокислот 1325±177 1370±131 1685±287*
глутамат/глутамин 5,52±1 2,96±0,11* 3,46±0,43
Заме нимые/не заме нимые 20±1,7 20±2,06 17±0,98*
Примечание: в этой и других таблицах * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 по сравнению с контрольной группой животных.
рации незаменимых аминокислот в первую очередь будут определяться скоростью их деградации и использованием на процессы синтеза белка. Поскольку уменьшается соотношение заменимые/незаменимые аминокислоты (ЗАК/НАК), то накопление незаменимых аминокислот метионина, лейцина и фенилаланина при острой интоксикации динилом может свидетельствовать о торможении синтетических процессов так и недостаточной их утилизации в ЦТК. На снижение функциональной активности ЦТК также косвенно указывает накопление пролина и гистидина.
Анализируя вклад отдельных возбуждающих (ВАК) и тормозных (ТАК) аминокислот в соотношение процессов возбуждения и торможения по коэффициентам корреля-
ции, становится очевидным, что при введении динила в дозе 5 мг/кг основное значение среди тормозных нейромедиаторных аминокислот приобретет увеличение содержания ГАМК и глицина, а среди возбуждающих -глутамата и аспартата. У крыс, получавших динил в обеих концентрациях, заметно возрастает вклад глицина и глутамата в формирование индекса взаимоотношений нейро-трансмиттерных аминокислот (ТАК/ВАК). У животных, получавших динил в концентрации 500 мг/кг, снижались вклады глицина и аспартата в пулы тормозных и возбуждающих аминокислот, причем регулирующая нейро-трансмиттерная активность глицина была реализована за счет более высокой концентрации ГАМК (табл. 2).
При изучении формирования взаимоотношений между различными по функциям ней-ротрансмиттерными аминокислотами по соответствующим корреляционным индексам обращает внимание тот факт, что при введении ди-нила в концентрации 5 мг/кг наблюдалось исчезновение большинства положительных корреляционных взаимодействий (Asp-Glu, Asp-Ser, Asp-PEA, Asp-Phe, Glu-Gly, Glu-PEA, Glu-Tyr, Glu-Phe, Ser-PEA, Ser-GABA, Ser-GABA, Ser-Tyr, Ser-Phe, Gly-PEA, PEA-GABA, PEA-Tyr, PEA-Phe, GABA-Tyr), тогда как при введении дозы 500мг/кг наблюдалось не только исчезновение старых, но и появление новых корреля-
ционных связей в парах аминокислот, в половине из которых присутствует глутамин (Ии-Ии, Ип-ТЬг, Ип-Таи, Ип-Туг, Ип-РЬе, ТЬг-Туг, ТИг-РЬе, Туг-РЬе, Ии-ТЬг, Авр-БА) (табл. 3).
В обеих группах введение динила приводило к исчезновению отрицательного взаимодействия между уровнями фосфоэтаноламина в плазме и концентрацией этаноламина в гипоталамусе, подобная ситуация наблюдалась и в паре треонин-этаноламин что, видимо, явилось следствием снижения концентраций этанолами-на и треонина в гипоталамусе. Восстановление потерянной в гипоталамусе положительной связи между уровнем глутамата в плазме и аспар-
Таблица 2
Коэффициенты корреляции уровней отдельных возбуждающих и тормозных нейро-трансмиттерных аминокислот с их суммарными показателями в гипоталамусе крыс
ТАК ВАК ТАК/ВАК
Asp Glu Gly GABA Asp Glu Gly GABA Asp Glu Gly GABA
Контроль 0,72 0,85* 0,81* 0,98* 0,96* 1* 0,85* 0,76* -0,54 -0,39 -0,21 0,24
Динил 5мг/кг 0,46 -0,02 0,77* 0,94* 0,82* 0,99* -0,43 0,33 -0,28 -0,76* 0,85* 0,44
Динил 500мг/кг 0,46 0,54 0,37 0,93* -0,05 0,99* 0,91* 0,29 0,15 -0,98* -0,95* -0,07
Таблица 3
Коэффициенты корреляции уровней отдельных нейротрансмиттерных аминокислот и их производных в гипоталамусе крыс (представлены только достоверные изменения)
Показатель Контроль Динил 5 мг/кг Динил 500 мг/кг Показатель Контроль Динил 5 мг/кг Динил 500 мг/кг
Asp-Glu 0,97* 0,73 -0,16 Ser-Phe 0,85* -0,48 0,53
Asp-Ser 0,87* 0,55 0,73 Gln-Thr 0,14 -0,38 0,99*
Asp-PEA 0,87* -0,29 -0,88 Gln-Tau 0,19 -0,32 0,88*
Asp-EA 0,22 0,53 -0,89* Gln-GABA -0,12 0,86* 0,05
Asp-Phe 0,87* 0,16 0,02 Gln-Tyr -0,27 0,6 0,98*
Glu-Ser 0,91* 0,92* 0,31 Gln-Phe -0,06 0,55 0,92*
Glu-Gln -0,41 0,13 0,97* Gly-PEA 0,87* 0,4 -0,35
Glu-Gly 0,87* -0,51 0,89* Gly-Tau 0,54 -0,88* 0,85
Glu-PEA 0,94* -0,14 -0,08 Gly-Phe 0,81 0,94* 0,96*
Glu-Thr 0,7 0,02 0,99* PEA-GABA 0,9* 0,05 -0,38
Glu-Tyr 0,81* 0,26 1* PEA-Tyr 0,86* -0,32 0,003
Glu-EA 0,21 0,9* -0,16 PEA-Phe 0,86* 0,2 -0,2
Glu-Phe 0,83* -0,37 0,97* Thr-Tyr 0,71 -0,43 0,99*
Ser-PEA 0,97* -0,39 -0,6 Thr-Phe 0,50 -0,63 0,96*
Ser-GABA 0,95* 0,12 0,18 GABA-Tyr 0,87* 0,67 0,24
Ser-Tyr 0,86* 0,3 0,24 Tyr-Phe 0,54 0,66 0,95*
Ser-EA 0,47 0,87* -0,69
Таблица 4
Коэффициенты корреляции между уровнями свободных аминокислот в плазме крови и в гипоталамусе крыс (представлены только достоверные изменения)
Показатель Контроль Динил 5 мг/кг Динил 500 мг/кг
PEA-EA * o' - -0,62 -0,14
Thr-EA -0,92* -0,4 0,45
Glu-Asp -0,08 -0,13 0,82*
PEA-Gln 0,72 -0,34 0,77*
Gln-Tau -0,48 -0,87* -0,27
PEA-Tau 0,45 0,85* -0,43
Asp-PEA -0,60 0,08 -0,87*
тата в гипоталамусе, при введении динила в дозе 500 мг/кг, может быть проявлением ухода от де-гидрогеназного пути окисления глутамата в сторону переаминирования глутамата с образованием аспартата, регуляция трансаминазного пути с помощью глутамата плазмы в данном случае может указывать на нарушение функционирования ЦТК в гипоталамусе. Появление положительной корреляции в паре фосфоэтано-ламин-глутамин и отрицательной в паре глутамин-таурин, может свидетельствовать об усилении прохождения глутамина из плазмы в гипоталамус, поскольку повышенная концентрация глутамина в гипоталамусе, при введении динила, указывает на ослабления участия в этом процессе глутаминазы, которая отвечает за превращение глутамина крови во внутриклеточный глутамат (табл. 4).
Заключение
Таким образом, острая интоксикация ди-нилом сопровождается нарушением обмена ней-роактивных аминокислот в гипоталамусе, что влечет за собой последующие изменения нейроэндокринной регуляции на уровне всего организма. Качественный и количественный состав выявленных изменений доказывает наличие дозозависимости при введении динила. Нарушение коррелятивных взаимоотношений между концентрациями свободных аминокислот и их производных в плазме крови и гипоталамусе сопровождается тенденцией к накоплению отдельных нейроактивных аминокислот и формированием аминокислотного дисбаланса.
Литература
1. Hefner, R.E. Repeated inhalation toxicity of diphenyl oxide in experimental animals / R.E. Hefner / Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1975. - Vol. 33. - P. 78-86.
2. Heat Transfer Fluid (Diphenyl Oxide): Safety Data Sheet: [Enacted by The Dow Chemical Company 26 February 2007]. - 2007. - P. 1-2.
3. Heat Transfer Fluid (Diphenyl Oxide) : Product Technical Data Manual: [Enacted by The Dow Chemical Company July y.1998]. - 1998. - P. 28.
4. Физиология человека / под ред. В.М. Покровского, Г.Ф. Коротько. - М.: Медицина, 1997. - Т. 1. - Гл. 5.
5. Лях, И.В. Влияние хронического и острого воздействия динилом на уровень биогенных аминов в мозге крыс / И.В. Лях // Наука -2010: сборник науч. ст.: в 2 ч. - 2010. - Ч. 2. - C. 17-19
6. Метаболические изменения во внутренних органах животных при острой интоксикации динилом / В.М. Шейбак [и др.] // Актуальные проблемы медицины: материалы ежегодной итог, конф., 22 дек. 2010г. - 2010. - С. 83-85.
7. Дорошенко, Е.М. Методологические аспекты и трудности анализа свободных (физиологических) аминокислот и родственных соединений в биологических жидкостях и тканях / Е.М. Дорошенко // Аналитика РБ-2010: сб. тез. Респ. науч. конф. по аналитической химии с междунар. участием. - 2010. - С. 126.
8. Givan, J.A. Glutamine metabolism in Mammalian Tissues / J.A Givan, P.M. Bradford, A.I. Verholen // Abstracts. 48th meeting of the Society for Biological Chemistry. G^tingen, Sept. 29-30. - 1983. - Vol. 364, № 9. - P. 1237-1256.
9. Lubec, C. Amino Acids (Chemistry, Biology, Medicine) / C. Lubec; ed. C. Lubec, J.A. Rosental. - N.Y.: Escom, 1990. - 1196 p.
10. Cooper, A.J.L. Biochemistry of sulfurcontaining amino acids / A.J.L. Cooper // Ann. Rev. Biochem. - 1983. -Vol. 52. - P. 187-222.
Поступила 10.01.2012 г.
Принята в печать 02.03.2012 г.
