CC BY
14
© З.В.Светлова, Н.Н.Смирнова, 2003
УДК [616.61-002.3-036-0S3.2:S77.11S+S47.96]:S43.872
З.В. Светлова, Н.Н. Смирнова
СВОБОД НОРАД И КАЛ ЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ ПИЕЛОНЕФРИТОМ В ФАЗЕ РЕМИССИИ С СОХРАННОЙ ФУНКЦИЕЙ ПОЧЕК
Z.V.Svetlova, N.N.Smirnova
FREE-RADICAL OXIDATION OF LIPIDS AND PROTEINS IN CHILDREN WITH CHRONIC PYELONEPHRITIS IN REMISSION WITH PRESERVED RENAL FUNCTION
Кафедра педиатрии Санкт-Петербургского государственного медицинского университа им. акад. И.П.Павлова, Россия.
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучение процессов свободно-радикального окисления липидов и белков в плазме крови детей схроническим пиелонефритом в стадии стойкой ремиссии при сохранной функции почек. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Обследовано 19 пациентов школьного возраста и 18 здоровых детей в качестве контрольной группы. Изучены традиционные показатели перекисного окисления белков, атакже спонтанное и Fe-стимулированное окисление белков плазмы крови. РЕЗУЛЬТАТЫ. Выявлены дефицит сульфгидрильных групп и снижение резервов окислительной модификации белков. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Показано, что даже при стойкой и длительной ремиссии пиелонефрита сохраняются дефекты антиокси-дантной защиты.
Ключевые слова: дети, пиелонефрит, липиды, белки, свободно-радикальное окисление. ABSTRACT
THE AIM of the work was to study plasma lipid and protein free-radical oxidation in children with chronic pyelonephritis at the stage of steadfast remission with preserved renal function. PATIENTS AND METHODS. 19 patients of school age and 18 healthy children were examined. Traditional indices of lipid peroxidation as well as spontaneous and Fe-stimulated protein oxidation in blood plasma were investigated. RESULTS. The deficiency of plasma thyol groups and reduced reserves of oxidative modification proteins were revealed. CONCLUSION. It has been shown that there exist antioxidative defense holes even in the steadfast and long-term remission of pyelonephritis in school age children.
Keywords: children, pyelonephritis, lipids, proteins, free-radical oxidation.
ВВЕДЕНИЕ
Пиелонефрит - наиболее частая форма патологии органов мочевой системы. В детском возрасте инфекция мочевых путей делит 1-2-е места по частоте с поражением респираторного тракта [1]. Известно, что рецидивы пиелонефрита возникают через 5, 8 и более лет после первого эпизода. Между тем сроки активного диспансерного наблюдения нередко ограничиваются 3-5 годами клини-ко-лабораторной ремиссии, после чего констатируется выздоровление от пиелонефрита. Уточнение критериев «стойкой ремиссии» и тем более «выздоровление» нам представляется возможным при сопоставлении общепринятых клини-ко-лабораторных показателей и оценки состояния клеточных мембран. Считается, что синдром эндогенной интоксикации при остром пиелонефрите является пусковым механизмом процессов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) и дисфункции иммунной системы [2]. Этот процесс имеет более выраженные последствия при наличии предшеству-
ющей функциональной или морфологической нестабильности цитомембран тубулярного эпителия, нарушения оттока мочи при наличии рефлюксов. Эти факторы создают благоприятные условия для адгезии бактерий на поверхности эпителия слизистой оболочки мочевых путей, увеличения проницаемости мембран для токсинов, иммунных комплексов, конечных продуктов ПОЛ [3, 4]. В то же время, токсичные продукты ПОЛ, повреждая мембранные структуры, ухудшают процессы обмена, способствуют хронизации, переходу в более тяжелые формы. Однако большинство работ посвящено изучению нарушений свободно-радикального окисления (СРО) при патологии почек на поздних этапах заболевания - при явлениях вторичного сморщивания и почечной недостаточности [5, 6, 7].
Целью нашей работы было выявление нарушения баланса между про- и антиоксидантными системами у детей с хроническим пиелонефритом в фазе ремиссии с сохранной функцией почек.
Примечание: дента).
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 19 детей в возрасте от 5 до 15 лет (средний возраст 11,4 года) с диагнозом «хронический пиелонефрит в фазе стойкой клинико-лабо-раторной ремиссии с сохранной функцией почек». Все дети обследованы и пролечены в специализированном нефро-урологическом отделении. Диагностический комплекс включал подробный анамнез, физикальное обследование, серию анализов мочи, бактериологические посевы, клинический и биохимический анализ крови, ультразвуковое исследование почек, цистографию, цистоскопию, экскреторную урографию и динамическую ренос-цинтиграфию. Длительность
заболевания составляла от 1 до 15 лет. У 15 детей пиелонефрит был вторичным и развился на фоне пузырно-мо-четочникового рефлюкса или поясничной дистопии, удвоения, ротации, увеличения подвижности одной или обеих почек, дисметаболической не-фропатии, хронического цистита. У 4 пациентов не выявлено первичных изменений со стороны органов мочевой системы. Время, прошедшее с момента последнего обострения, составляло от 6 месяцев до 3 лет. На момент обследования не зафиксировано никаких воспалительных изменений со стороны других органов.
Контрольную группу составили 18 здоровых детей от 6 до 13 лет (средний возраст 10,4 года). Отбор производился по данным амбулаторной карты развития ребенка, объективному обследованию и результатам осмотров специалистами (отоларингологом, стоматологом, дерматологом и хирургом). Дети контрольной группы не имели хронических очагов инфекции и не переносили острых заболеваний минимум 6 месяцев до момента обследования.
Для изучения состояния системы ПОЛ использовались следующие методики. Определение содержания общих липидов плазмы крови проводилось по стандартным методикам с помощью набора реактивов фирмы «Синтакон». Определение концентрации малонового диальдегида в плазме крови в реакции с тиобарбитуровой кислотой по методу С.Г.Конюховой и соавт. [8]. Оценивали содержание малонового диальдегида в плазме крови, и в пересчете на количество общих липидов плазмы.
Таблица 1
Показатели перекисного окисления липидов и антиокси-и у здоровых детей (Х±т)
Показатель Здоровые Больные хро- Отличие в %
(п=17) ническим пиело- от здоровых
нефритом(п=19) детей
Общие липиды, г/л 4,14+0,20 4,85+0,23 117,50
Общий белок, мг/л 66,11+1,48 62,97+1,43 95,25
МДА, нмоль/л 8,27±0,34 11,31 ±0,64* 136,75
Токоферол, мкмоль/л 0,233±0,006 0,233±0,009 100,00
БН-группы, мкмоль/мл 0,468±0,011 0,425±0,019* 90,80
СОД-акт., у.е./мл 18,87+0,87 22,00+1,19* 116,59
СОД-акт., у.е./мг белка 0,28±0,01 0,35±0,02* 125,00
ЦП, ммольг'ч/л 20,20±0,93 19,32±1,04* 95,64
отмечены значения показателей с р<0,05 (критерий Стъю-
Таблица 2
Показатели окислительной модификации белков плазмы и у здоровых детей (Х±т)
Показатель, у.е./мг Здоровые Больные хро- Отличие в %
белка (п=17) ническим пиело- от здоровых
нефритом(п=19) детей
Спонтанное 270нм 0,062±0,009 0,097±0,012* 156,45
Ре-зависимое 270нм 0,201+0,014 0,144±0,023* 71,64
Спонтанное ЗбЗнм 0,174±0,008 0,130+0,011 109,19
Ре-зависимое ЗбЗнм 0,199+0,011 0,143±0,024* 71,86
Спонтанное 370нм 0,182±0,007 0,188±0,012 103,30
Ре-зависимое 370нм 0,196±0,013 0,152±0,022* 77,55
Примечание: дента).
отмечены значения показателей с р<0,05 (критерий Стъю-
Определение концентрации токоферолов в плазме крови методом Н.К. Рудаковой-Жилиной с соавт. [9] в реакции с 2,2'дипиридилом и хлорным железом. Определение содержания сульфгидриль-ных групп в плазме крови по методу, в основе которого лежит классическая реакция Эллмана, предложенному В.В.Соколовским с соавт. [10]. Суммарная супероксиддисмутазо(СОД)-подобная активность белков плазмы крови определялась спектрофотометрическим методом, основанном на определении степени торможения реакции окисления кверцетина [11]. Определение содержания общего белка плазмы крови по методу Лоури [12]. Определение Бе-оксидазной активности церу-лоплазмина по Ревину [13].
Для изучения процессов окислительной модификации белков под действием активных форм кислорода использовали методику, предложенную Е.Е.Дубининой и соавт. [14]. Принцип метода основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием альдегидных и кетоновых производных 2,4-ди-
нитрофенилгидразона, регистрируемых при следующих длинах волн: 270нм, 363нм и 370нм. При введении в систему металла переменной валентности (Бе) происходит катализирование данной реакции и возрастает содержание образовавшихся 2,4-ди-нитрофенилгидразонов. Разницу между спонтанным и Бе-стимулированным перекисным окислением белков расценивали как резерв антиоксидантной защиты организма.
Все вышеуказанные показатели изучали в плазме крови, полученной путем венопункции из локтевой вены натощак.
Результаты обработаны статистически с использованием критерия Стъюдента. Различие считали достоверным при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно из табл. 1, в группе больных пиелонефритом уровень МДА в плазме крови достоверно выше такового у здоровых детей, что свидетельствует об усилении интенсивности ПОЛ. Анализ состояния антиоксидантной системы (АОС) показывает достоверное снижение содержания сульфгидрильных групп при нормальной концентрации токоферола в плазме. Величина СОД-подобной активности, как абсолютной, так и отнесенной на количество белка достоверно выше, чем у здоровых детей. Ферроксидазная активность церулоплазмина у больных пиелонефритом мало отличается от нормальных значений.
В условиях оксидативного стресса свободно-радикальные продукты наряду с окислительной деструкцией липидов поражают и белковые структуры. Учитывая большую и очень разнообразную функциональную нагрузку белков в тканях, их окислительная модификация может носить в отличие от пероксидации липидов более избирательный и специфический характер при различных патологических состояниях [15]. Результаты определения уровня продуктов спонтанной и Бе-стимулирован-ной окислительной модификации белков в плазме крови представлены в табл. 2. Уровень спонтанной модификации белков на 270нм у больных пиелонефритом достоверно превышает таковой у здоровых детей в среднем в 1,5 раза; на 363 и 370 нм увеличение не достоверно. В то же время уровень Бе-зависимой модификации белков на всех длинах волн при пиелонефрите в фазу ремиссии достоверно ниже, чем у здоровых детей, составляя в среднем 71,6-77,5% от нормы. Эти различия представлены на диаграммах (рис.1 и 2). У здоровых детей уровень продуктов металл-катализируемой ОМБ, регистрируемый во всех диапазонах длин волн, преобладает над уровнем спонтанной реак-
Рис.2. Соотношение уровня продуктов Ре-зависимой окислительной модификации белков у здоровых детей и больных пиелонефритом.
ции. У больных пиелонефритом показатели Бе-сти-мулированной ОМБ достоверно ниже, чем спонтанной во всем диапазоне определения. Таким образом, процессы ОМБ у больных детей исходно протекают на более высоком уровне, но резервы антиоксидантной защиты снижены.
ОБСУЖДЕНИЕ
У детей, больных пиелонефритом и находящихся в стадии стойкой и длительной клинико-лабора-торной ремиссии, определяются существенные дефекты в системе антиоксидантной защиты. Повышенный уровень МДА свидетельствует об усилении процессов ПОЛ. Высокая СОД-подобная активность белков плазмы крови очевидно является компенсаторной реакцией и выполняет антиок-сидантную функцию на первой - антикислородной ступени защиты. Антирадикальная ступень оценивалась по уровню токоферола и тиоловых групп. Примечательно, что в стадии ремиссии пиелонеф-
рита не отмечается снижения в плазме токоферола - одного из жирорастворимых антиоксидантов, встроенных непосредственно в липидный бислойный матрикс биомембраны. Вместе с тем отмечен достоверный дефицит тиоловых соединений, представляющих водорастворимый компонент антирадикальной защиты. Между тем хорошо известно, что в комплекс патогенетической и проти-ворецидивирующей терапии пиелонефрита часто включаются препараты токоферола, но не источники тиоловых соединений.
Показатели окислительной модификации белков в плазме крови свидетельствуют о повышении уровня спонтанной модификации и его снижении при стимуляции ионами железа. Исходно повышенный уровень окислительной модификации белков означает нестабильность белковой матрицы клеточной мембраны и не может не отражаться на активности мембранных ферментов и на трансмембранном транспорте. Окисленные белки расщепляются про-теолитическими ферментами более активно, чем нативные [16]. В норме накопление окисленных белков рассматривается как один из факторов регуляции синтеза и распада белков. Снижение резервов окислительной модификации белков, выявленное при металлостимуляции, - косвенное доказательство нарушения белкового обмена при пиелонефрите, сохраняющееся и в стадии полной клинико-лабораторной ремиссии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Общепринятые признаки клинико-лабораторной ремиссии пиелонефрита не являются доказательством полного выздоровления. Даже при стойкой и длительной ремиссии сохраняются дефекты ан-тиоксидантной защиты, создающие предпосылки для нестабильности клеточных мембран. Наиболее значим для профилактики рецидивов воспаления органов мочевой системы - длительно сохраняющийся дефицит тиоловых соединений, восполнение которого должно быть включено в проти-ворецидивные курсы при диспансерном наблюдении за детьми с хроническим пиелонефритом.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Неверов НИ, Козловская ЛВ, Карриева БИ. Свободно-радикальные процессы и перекисное окисление липи-дов при заболеваниях почек. Тер Арх 1992;11:42-44
2. Baund L, Ardaillov R. Reactive oxygen species: production and role in the kidney. Amer J Physiol 1986; 251(5): 765-776
3. Голод EA, Даренков АФ, Кирпатовский ВИ, Яненко ЕК Перекисное окисление липидов в ткани почек у больных с нефролитиазом и хроническим пиелонефритом. Урол и Нефрол 1995;5:8-10
4. Жмуров ВА, Крылов ВИ, Иванова ЕЕ. и др. Содержание в крови и в моче продуктов перекисного окисления и ферментативная активность мочи при остром и хроническом гломерулонефрите у детей. Урол и Нефрол 1983; 4:5660
5. Крылов ВИ, Петрушина АД, Морева ГВ. и др. Роль нарушений структуры клеточных мембран в формировании гормоно-резистентных вариантов заболеваний почек у детей. Вопр Мед Хим 1987; 4: 22-24
6. Багирова РД, Александрова НВ, Синяченко ОВ. и др. Исследование продуктов перекисного окисления и ренапь-ных функций при нефрогенной гипертензии. Врач Дело 1993; 2-3:81-85
7. Gwinner W, Grone HJ. Role of reactive oxygen species in glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant 1999; 14(6): 15951598
8. Конюхова СГ, Дубикайтис АЮ, Шабуневич ЛВ, Страшное ВИ, Белоцерковский MB. Роль активации перекисного окисления липидов в патогенезе экспериментального перитонита. Бюл Эксперим Биол и Мед 1989; 5: 557-559.
9. Рудакова-Жилина НК, Матюхова НП. Оценка антиок-сидантной системы организма. Лаб Дело 1982; 1: 19-22.
10. Соколовский ВВ, Кузьмина ВС, Москадынова ГА, Петрова НН. Спектрофотометрическое определение тио-лов в сыворотке крови. Клин Лаб Диагн 1997; 11: 20-21
11. Костюк ВА, Потапович АИ, Ковалева ЖВ. Простой и чувствительный метод определения активности супероксид-дисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина. Вопр Мед Хим 1990; 2: 88-91.
12. Lowry OU, Rosenbrough NJ, FarrAL, Randall RJ. Protein measurement with Folin phend reagent. J.Biol Chem 1951 ;193: 265-275.
13. Ravin HA. An improved colorimetric enzymatic assay of ceruloplasmin. J. Lab Clin Med 1961; 58: 151-168.
14. Дубинина EE, Бурмистров CO, Ходов ДА, Порото-вИГ. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. Вопр Мед Хим 1995; 41(1): 24-26.
15. Дубинина ЕЕ. Активные формы кислорода и их роль в развитии оксидативного стресса. Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. T.II - Труды Науч Конф посвящ 100-летию каф биох СПбГМУ им.акад. И.П.Павлова 15-17 октября 1998г./ И.Г.Щербак (ред) СПб: Изд-во СПбГМУ; 1998: 386-389
16. Мс Cord JM, Fridovich J. The biology and pathology of oxygen radicals. Ann Intern Med 1978; 89: 122-127
Поступила в редакцию 8.01.2003 г.
