CC BY
15
УДК 612.843.215 Оригинальная статья
cвETоиндyцировAннAЯ суммарная электрическая активность сетчатки при моделировании некоторых патологических процессов
IN VIVO и IN VITRO
Т. Р. Мухамадеев — ФГБОУ ВО «Башкирский ГМУ» Минздрава России, профессор кафедры офтальмологии с курсом ИДПО, доцент, доктор медицинских наук; Р. Р. Ахмадеев — ГАУЗ «Республиканский клинический психотерапевтический центр» Министерства здравоохранения Республики Башкортостан, нейрофизиолог, медицинский психолог отдела психологического сопровождения и профилактики, профессор, доктор медицинских наук.
light-induced total electrical activity of retina in models
OF PARTICULAR DISORDERS IN VIVO AND IN VITRO
T. R. Mukhamadeev — Bashkir State Medical University, Professor of Chair of Ophthalmology with Course of Institute of Postgraduate Additional Education, Associate Professor, DSc; R. R. Ahmadeev — Republican Clinical Psychotherapeutic Center, Neuro-physiologist, Medical Psychologist of Department of Psychological Support and Prevention, Professor, DSc.
Дата поступления — 15.11.2018 г. Дата принятия в печать — 06.12.2018 г.
Мухамадеев Т.Р., Ахмадеев Р.Р. Светоиндуцированная суммарная электрическая активность сетчатки при моделировании некоторых патологических процессов in vivo и in vitro. Саратовский научно-медицинский журнал 2018; 14 (4): 903-909.
Цель: провести электрофизиологическое исследование функционального состояния сетчатки на различных экспериментальных моделях при воздействии офтальмохирургических и типовых патологических факторов. Материал и методы. Регистрация электроретинограммы (ЭРГ) и суммарного рецепторного потенциала (СРП) в экспериментах in vivo и in vitro при действии различных патогенетических факторов. Результаты. При ви-треоретинальных вмешательствах, проведенных на кроликах, происходит некоторое снижение амплитуды ЭРГ в ранний послеоперационный период с последующим практически полным восстановлением электроретинограммы до исходных значений. При регистрации электрической активности изолированной сетчатки земноводных показано быстрое угнетение a-, b- и d-волн ЭРГ при аноксии и их восстановление при реоксигенации. СРП в ходе аноксии угнетается медленнее, чем ЭРГ но в ходе реоксигенации его восстановления не происходит. Препараты изолированной сетчатки с сохраненным пигментным эпителием были гораздо более устойчивыми к кислородной недостаточности. Результаты обсуждены с нейрофизиологических позиций и согласуются с парадигмой ремоделирования сетчатки в экспериментальной патологии при ведущей роли нейронных механизмов. Заключение. Для оценки воздействия типовых и специфических патогенетических факторов на общее функциональное состояние сетчатки наиболее адекватным и эффективным методологическим подходом является регистрация суммарной электрической активности сетчатки на моделях in vivo. Исследование более тонких изменений на рецепторном, нейрональном и межнейронном уровнях при воздействии различных экстремальных факторов на сетчатку целесообразнее проводить на моделях in vitro с регистрацией как суммарной, так и локальной активности.
Ключевые слова: электроретинограмма, витреоретинальные вмешательства, аноксия.
Mukhamadeev TR, Ahmadeev RR. Light-induced total electrical activity of retina in models of particular disorders in vivo and in vitro. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2018; 14 (4): 903-909.
Aim: to conduct an electrophysiological study of functional state of retina under the influence of ophthalmological surgical and typical pathogenic factors on various experimental models. Material and Methods. Experimental registration of electroretinogram (ERG) and total receptor potential (TRP) in vivo and in vitro under influence of various pathogenic factors. Results. It was shown that there is a slight decrease in the amplitude of the ERG in the early postoperative period after vitreoretinal surgery in rabbits followed by almost complete restoration of the electroretinogram to its original values. Registration of electrical activity of isolated retina of amphibians showed a rapid inhibition of a-, b- and d-waves of ERG during anoxia and their recovery during re-oxygenation. TRP inhibition during anoxia is developed more slowly than ERG inhibition, but its recovery does not occur during re-oxygenation. Preparations of isolated retinas with preserved pigment epithelium were much more resistant to oxygen deficiency. The results are discussed from a neurophysiological point of view and are consistent with the paradigm of retinal remodeling in experimental pathology with the leading role of neural mechanisms. Conclusion. The most adequate and effective methodological approach to assess the impact of typical and specific pathogenetic factors on the overall functional state of the retina is to register the total electrical activity of the retina in models in vivo. Studies of more subtle changes at the receptor, neuronal and interneuronal levels under the influence of various extreme factors on the retina are more expedient to carry out on in vitro models with registration of both total and local activity.
Key words: electroretinogram, vitreoretinal surgery, anoxia.
Введение. В нейрофизиологических исследованиях сетчатки, проведенных многими авторами и коллективами на протяжении нескольких десятилетий достаточно четко прослеживаются два основных направления. Благодаря первому фундаментальному направлению стали известны основы восприятия, обработки и передачи зрительной информации. Второе направление имеет более прикладное значение и связано с электрофизиологической диагностикой патологии сетчатки с использованием различных
Ответственный автор — Мухамадеев Тимур Рафаэльевич Тел.: +7 (927) 2356040 E-mail: photobgmu@gmail.com
(общей, ганцфельд, ритмической, локальной и др.) методов электроретинографии (ЭРГ) и электрооку-лографии (ЭОГ).
Анализ публикаций, а также наш собственный опыт показывают, что в клинической электрорети-нографии существует достаточно проблем по некорректному использованию ЭРГ в диагностике глазных заболеваний. С одной стороны, в кабинеты ЭРГ часто направляются больные, не имеющие каких-либо показаний для этого достаточно трудоемкого и сложного метода диагностики. Противоположная ситуация — когда имеются прямые показания к электрофизиологической диагностике глазной патологии, но
она не выполняется. Во многом эти проблемы связаны со слабым знанием практическими офтальмологами механизмов генерации ЭРГ в норме и при различной патологии, а также основ нейрофизиологии сетчатки.
Цель: провести электрофизиологическое исследование функционального состояния сетчатки на различных экспериментальных моделях при воздействии офтальмохирургических и типовых патологических факторов.
Материал и методы. Проведенную нами многолетнюю комплексную работу мы условно подраздели на медико-технический и нейрофизиологический блоки и этапы, которые начаты еще в первой половине 1980-х годов на кафедрах нормальной физиологии и офтальмологии БГМУ и продолжаются в настоящее время. Нейрофизиологический этап начат несколько позднее, по мере решения медико-технических проблем. Следует отметить, что вначале нами проведены фундаментальные исследования по регистрации светоиндуцированной электрической активности и напряжения кислорода (рО2) сетчатки in vitro, а затем с учетом полученных данных уже проводятся исследования in vivo, продолжающиеся и в настоящее время.
Для оценки общего функционального состояния сетчатки при действии различных факторов во время витреоретинальных вмешательств эксперименты выполнены на 12 глазах 6 кроликов породы шиншилла. На одном из глаз каждого кролика проведена ви-трэктомия, в ходе которой в витреальную полость вводили 0,1 мл красителя, и после 10-секундной экспозиции он полностью удалялся с использованием рефлюксного инструмента. По окончании операции на область портов накладывали герметичные швы, субконъюнктивально вводили 0,1 мл р-р ванкоми-цина, в конъюнктивальную полость закапывали 1-2 капли 0,5% моксифлоксацина. После операции в течение 5 дней в конъюнктивальную полость животных закапывали антибактериальные и нестероидные противовоспалительные препараты. Операция и послеоперационный период у всех животных проходили без осложнений. Парный глаз оставался интакт-ным, и его показатели использовались в качестве контроля.
Регистрацию ЭРГ осуществляли до операции в интактном состоянии, и далее — на 5-е и 14-е сутки после операции. ЭРГ регистрировали портативной электрофизиологической установкой «Нейро-ЭРГ» («Нейрософт», Иваново, Россия), активный электрод закреплялся за нижнее веко, референтный и заземляющий электроды располагали на ушах. При анализе использовали усредненную запись ЭРГ, учитывая объем выборки для оценки выраженности и значимости изменений параметров ЭРГ до и после операции использовали непараметрические критерии Манна — Уитни и Вилкоксона.
Опыты второй серии исследований проведены для уточнения характера подавления и восстановления функциональной активности фоторецепторов и нейронов сетчатки при таком типовом патологическом процессе как аноксия и реоксигенация на модели сетчатки амфибий in vitro.
Перед опытом животные содержались в лабораторных условиях в течение 7-8 дней. Время от момента декапитации до помещения изолированной сетчатки в перфузируемую (80 мл/мин) аэрируемую термостатируемую (20±0,05°С) камеру не превышало 80-90 секунд. Для выделения суммарного рецеп-
торного потенциала использовался глутамат натрия (Глу), содержащийся в перфузирующем растворе в концентрации 9 мМ/л; перфузат того же состава без глутамата использовался при регистрации ЭРГ Для сохранности зрительных пигментов все манипуляции проводились при слабом темно-красном освещении.
Объектом исследования служили препараты глазного бокала, в котором связь сетчатки с пигментным эпителием сохранялась, и препараты изолированной от пигментного эпителия сетчатки.
Электрическую активность сетчатки и напряжение кислорода отводили платиновым (d=200 мкм) электродом полуоткрытого типа. Исследуемый сигнал подавался на вход многоканального усилителя УБФ4-03, запись проводили фотометрическим методом с экрана осциллографа С1-74. Одновременно измеряли рО2 полярографом Radelkis (Венгрия).
Световую стимуляцию осуществляли двухканаль-ным фотостимулятором, позволяющим регулировать интенсивность световых стимулов в пределах 5 логарифмических единиц интенсивности с шагом 0,2 лог ед.
После помещения препарата в экспериментальную камеру и подведения регистрирующих электродов, для оценки функционального состояния препарата подавались пробные световые стимулы, после чего препарат находился в течение 10-12 минут без каких-либо воздействий. Далее начиналась регистрация рО2; СРП или ЭРГ с интервалом в 20 секунд, длительность стимулов 3 секунды, интенсивность 2,5 лог ед. от насыщающей длины волн стимулирующего света 507 нм и 645 нм.
Аноксию моделировали путем подачи азота в камеру с изолированной сетчаткой и одновременным вытеснением кислорода из перфузирующего раствора. Реоксигенация достигалась возобновлением доступа атмосферного воздуха в окружающее сетчатку пространство и перфузирующий раствор.
Все опыты были максимально унифицированы. Учитывая большую вариабельность исходной амплитуды ответов, для статистической обработки данных мы проводили нормирование, приняв максимальную амплитуду ответов за 100% и в дальнейшем анализ амплитуды проводился в относительных единицах в процентах.
Эксперименты проводили с соблюдением общепринятых принципов гуманности и существующих нормативных документов и инструкций по работе с лабораторными животными МЗ РФ и РАМН, Хельсинкской декларации.
Результаты.
1. Показатели электроретинограммы при витреоретинальных вмешательствах in vivo.
В исходном состоянии до операции, а также в контроле ЭРГ кроликов имела классический вид с хорошо выраженными основными волнами (амплитудно-временные характеристики их представлены в таблице; примеры записи — на рис. 1).
Амплитуда ЭРГ кроликов в различные сроки эксперимента
Сроки а-волна (мкВ) b-волна (мкВ) Индекс b/a
До операции 22,6 93,7 4,1
5 дней после операции 8,9 63,6 7,1
14 дней после операции 15,3 77,8 5,1
Рис. 1. Примеры записи ЭРГ кролика до вмешательства, на 5 и 14-е сутки после операции.
На 5-е сутки после операции произошло угнетение ЭРГ относительно контрольных величин, причем амплитуда а-волны снизилась статистически значимо (р<0,05) и повышение Ь/а индекса ЭРГ произошло преимущественно за счет снижения амплитуды а-волны эРг. Подавление электроретинограммы в целом является показателем реакции сетчатки на экспериментальное воздействие. При электрофизиологическом исследовании реакции сетчатки на витреоретинальные вмешательства необходимо учитывать прежде всего множественный характер патогенетических факторов, способных в той или иной мере ухудшить функциональное состояние сетчатки. В первую очередь это нарушение гомеостаза глаза в ходе самой операции с изменением условий микроциркуляции крови, внутриглазных сред, изменение естественных условий освещения, побочные эффекты с микрохирургических инструментов, токсическое воздействие использованных препаратов, неизбежная травматизация сетчатки и околосетчаточных тканей и многие другие ятрогенные эффекты. Учитывая в наших экспериментах снижение преимуще-
ственно a-волны ЭРГ, можно полагать, что основные функциональные изменения при витреоретинальном вмешательстве с использованием витальных красителей коснулись в основном дистальных элементов сетчатки.
Далее, на 14-е сутки после операции у всех кроликов произошло восстановление a-волны ЭРГ и индекса b/a, которые приблизились к исходным (доопе-рационным) значениям.
Следует отметить, что в рассмотренных экспериментальном подходе и методе регистрации элек-троретинография использовалась как объективный показатель именно общего функционального состояния сетчатки лабораторных животных in vivo при оф-тальмохирургических вмешательствах. Несмотря на очевидную актуальность такого подхода, он не дает ответа на важные вопросы о локализации и степени повреждения нейрорецепторных элементов сетчатки при патологии и в ходе оперативного лечения, о ближайшем и отдаленном прогнозе после лечения и др. Для уточнения ответов на эти вопросы представим данные, полученные в экспериментах in vitro.
2. Суммарный рецепторный потенциал и электроретинограмма изолированной сетчатки при аноксии и реоксигенации. В контрольных опытах напряжение кислорода в сетчатке оставалось достаточно стабильным на уровне примерно 100 мм рт.ст. в течение всего опыта (70-90 мин). С момента подачи азота в камеру с изолированной сетчаткой и в перфузирующий раствор рО2 падало до нулевых значений в течение 120-140 секунд, и далее при возобновлении подачи атмосферного воздуха (реокси-генация) напряжение кислорода возвращалось к исходному уровню в течение 240-250 секунд.
На рис. 2 показаны изменения ЭРГ и СРП при аноксии и реоксигенации.
Типичные примеры записи ЭРГ изолированной сетчатки лягушки представлены на рис. 2А: левые кривые контрольные опыты («нормоксия»), правые — при аноксии и реоксигенации. Несмотря на максимальную унификацию экспериментальных условий (время энуклеации, фоновое освещение, условия световой стимуляции; химический состав
А
Б
Рис. 2. А — типичные примеры записи ЭРГ изолированной сетчатки в контрольных опытах (левые кривые) и при аноксии (правые кривые); Б — типичные примеры записи СРП изолированной сетчатки в контрольных опытах (левые кривые) и при аноксии (правые кривые): N2 — начало аноксии; О2 — начало реоксигенации; калибровка — 100 мкВ, 1 сек; цифры между кривыми — время опыта; прямоугольники под записями — отметчики световых стимулов (длительность 3 сек, длина волны
645 нм, интенсивность 2,5-2,7 лог ед. от насыщающей)
перфузата, скорость протока и т.д.) амплитуда ЭРГ варьировалась в широких пределах от 80 до 700 микровольт, что объясняется особенностями функционального состояния переживающих органов.
В серии контрольных опытов стабильная ЭРГ отводилась в течение 60-80 минут, в отдельных случаях изолированная сетчатка работала в течение 4 и более часов. Стабильными были также электрические ответы сетчатки на доаноксическом отрезке опытов, что свидетельствует об удовлетворительном состоянии изолированного препарата. С момента подачи азота в камеру с изолированной сетчаткой (начало аноксии) происходило угнетение ЭРГ, и в течение 13-16 минут аноксии амплитуда электро-ретинограммы снижалась до минимальных значений 5-10 мкВ. При возобновлении доступа атмосферного воздуха происходило восстановление ЭРГ примерно до 40% от исходного уровня (рис. 2А и 5).
Динамика а-волны ЭРГ в ходе аноксии и реок-сигенации была сходной с Ь-волной: в контрольное время (10 мин) наблюдалось незначительное (на 8%) уменьшение амплитуды. Начало аноксии сопровождалось кратковременным увеличением амплитуды а-волны, далее следовала фаза быстрого угнетения и в последующем процесс несколько замедлялся. В момент прекращения аноксии происходило быстрое восстановление амплитуды а-волны, далее наступала фаза медленного восстановления. На протяжении 20-минутной аноксии амплитуда а-волны уменьшалась в среднем на 73% относительно доаноксиче-ского уровня, в постаноксической фазе реакция восстанавливалась примерно на 45% относительно исходного уровня.
На препаратах изолированной сетчатки с сохраненным пигментным эпителием («глазной бокал») ЭРГ сохранялась более длительное время, в отдельных опытах — в течение 15-20-минутной аноксии. Постаноксическая реоксигенация восстанавливала амплитуду ЭРГ более полноценно также на препарате глазного бокала по сравнению с изолированной от пигментного эпителия сетчаткой.
Добавление в перфузирующий раствор глутамата натрия в концентрации 9 мМ/л приводило к подавлению Ь-волны и генерации суммарного рецепторного потенциала. В контрольных опытах в динамике СРП наблюдалась определенная фазность: в течение первых 10 минут опыта наблюдалось увеличение амплитуды, далее в течение последующих 10 ми-
нут происходило снижение амплитуды примерно на 10%, затем ответы стабилизировалась на 10-15-й минуте с последующим снижением. Амплитуда СРП в разных контрольных опытах варьировалась в пределах от 100 до 500 мкВ, средние значения латентного периода составляли 11 мсек, время нарастания реакции 128 мсек.
При аноксии происходило снижение амплитуды примерно на 65% в течение первых 5 минут кислородной депривации, далее в течение 10 минут процесс замедлялся и в последующем периоде аноксии (10 минут) оставался достаточно стабильным. Суммарный изолированный рецепторный потенциал на красные стимулы на пике аноксии угнетался до минимальных абсолютных значений примерно 20 мкВ; латентный период при этом составлял в среднем 52 мсек, время нарастания реакции 127 мсек. В ходе реоксигенации происходило слабое (до 3%) увеличение амплитуды в течение первых 10 минут и далее продолжалось снижение СРП (рис. 2Б и 5).
Таким образом, в динамике а- и b-волн ЭРГ, с одной стороны, и СРП, с другой, в ходе аноксии и реоксигенации изолированной сетчатки обнаруживалось принципиальное различие. Суммарная светоиндуци-рованная электрическая активность изолированной сетчатки в контрольных опытах (как ЭРГ, так и СРП при «нормоксии») была достаточно стабильной в течение нескольких десятков минут Аноксия вызывала угнетение как а-, так и b-волн ЭРГ в течение примерно 13-16 минут, и возобновление подачи атмосферного кислорода («реоксигенация») приводило к восстановлению электроретинограммы примерно на 40-50% относительно исходного уровня. СРП подавлялся в ходе аноксии до минимальных значений более длительно (15-20 минут), но последующая реоксигенация его не восстанавливала.
Обсуждение. Из патофизиологии гипоксии хорошо известно, что время переживания нейронов при гипоксии и ишемии напрямую зависит от исходного уровня их окислительного метаболизма и кислородного обмена. В сетчатке интактного глаза распределение кислорода, его доставка и потребление хорошо объясняются трехслойной математической моделью (Linsenmeier R.A., Zhang H. F., 2017), в соответствии с которой максимальное значение рО2 (от 20 до 60 мм рт.ст.) наблюдается в области пигментного эпителия и наружных сегментов фоторецепторов (НСФ), минимальное (до 0 мм рт.ст.) на уровне внутренних
Наруж. Внутр. j
сегменты сегменты j Наружный
i фоторе- фоторе- 1 ядерный слой
Хцепторов цепторов |
Слой 1 Слой 2 I СлойЗ
1 i!i 1 1
20 40 60 80 Расстояние ог хориоидеи (мкм)
100
120
Рис. 3. А — напряжение кислорода в наружных слоях сетчатки (по Linsenmeier R.A., Zhang H. F., 2017 [1]); Б — динамика кислорода при аноксии и реоксигенации изолированной сетчатки; стрелками показаны моменты подачи и устранения из
препарата соответственно азота и кислорода
А Б
Рис. 4. Типичные примеры записи ЭРГ изолированной сетчатки в контрольных опытах (левые кривые) и при анок-сии (правые кривые); N2 — начало аноксии; О, — начало реоксигенации; калибровка 100 мкВ, 1 сек; цифры между кривыми — время опыта; прямоугольники под записями — отметчики световых стимулов (длительность 3 сек, интенсивность 2,5-2,7 лог. ед. от насыщающей).; А — примеры записи ЭРГ на красные (645 нм) и Б — зеленые (507 нм) световые стимулы
сегментов фоторецепторов (рис. 3А) [1]. Такое высокое содержание кислорода в области нейроэпите-лия обусловлено интенсивным потоком кислорода из хориоидеи к фоторецепторам через пигментный эпителий с одной стороны, и почти полным отсутствием митохондрий, а следовательно, и процессов окислительного метаболизма в области наружных сегментов палочек и колбочек. Практически нулевые значения напряжения кислорода в области внутренних сегментов фоторецепторов и наружной синапти-ческой области определяются максимально плотной упаковкой митохондрий в НСФ и наибольшей интенсивностью здесь окислительного метаболизма.
Различия в динамике СРП и ЭРГ при гипоксии и реоксигенации при первом приближении можно было бы объяснить гетерогенным распределением кислорода в сетчатке, даже изолированной. Но особенностью моделирования аноксии в наших экспериментах было то, что подачей чистого азота кислород был полностью вытеснен из сетчатки и достигал нуля в течение нескольких десятков секунд, то есть различие в представленной выше динамике ЭРГ и СРП при аноксии и реоксигенации нельзя объяснить особенностями кислородного снабжения отдельных структур сетчатки, фактор доставки кислорода исключен (рис. 3 Б).
Наиболее корректным объяснением особенностей подавления и восстановления ЭРГ и СРП в ходе аноксии и реоксигенации изолированной сетчатки мы полагаем участие сугубо нейрофизиологических процессов. В наиболее схематичном и упрощенном виде главными патогенетическими звеньями при гипоксии нейронов являются падение напряжения кислорода ниже критического уровня: блокада дыхательной цепи — разобщение окислительного фосфорилиро-вания — дефицит АТФ — угнетение Na+/K+ АТФ-азы плазматической мембраны — выравнивание ионных градиентов и деполяризация мембраны нейронов.
Для обсуждения наших данных необходимо напомнить особенности передачи сигналов в наружном синаптическом слое (НСС) сетчатки. У человека и у позвоночных животных (в том числе и экспериментальных) квантовая энергия света преобразуется фоторецепторами в рецепторный потенциал (в ходе этого преобразования происходит усиление сигнала с затратой большого количества энергии АТФ),
s? 100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
время опыта, минуты
«- контрольная ЭРГ Ь-волна ЭРГ * й-волна ЭРГ А суммарный рецепторный потенциал
Рис. 5. Динамика а-, Ь- и d-волн ЭРГ и СРП в контрольных опытах, при аноксии и реоксигенации
который со множеством палочек и колбочек в совокупности регистрируется как суммарный рецепторный потенциал. Далее фоторецепторный потенциал передается к нейронам сетчатки второго порядка — биполярам и горизонтальным клеткам посредством нейромедиаторов. Ранее с помощью гистологических (иммуноцитохимия) и авторадиографических методов было показано, что медиатором между фоторецепторами и биполярными клетками является L-глутамат, что впоследствии подтвердилось нейрохимическими и нейрофизиологическими исследованиями. Во внутренних сегментах фоторецепторов глутамат транспортируется и содержится в синапти-ческих пузырьках, на что также затрачивается энергия АТФ. Гиперполяризация мембраны фоторецепторов при их освещении снижает выделение глутамата и его диффузию через синаптическую щель, дальнейшая судьба зрительного сигнала зависит от взаимодействия нейромедиатора с глутаматергически-ми рецепторами дендритов биполярных клеток. Эти клетки, как и фоторецепторы, на изменение освещения реагируют градуальной трансформацией мембранного потенциала, что в предельно упрощенном и схематичном виде суммарно регистрируется как Ь- и, частично, с1-волна ЭРГ [2]. Функционально биполярные клетки подразделены на О^ и OFF-биполяры: в зависимости от освещения центра их рецептивного поля О^биполяры деполяризуются, а OFF-биполяры гиперполяризуются. Биполярные клетки также отличаются от типа палочковых и колбочковых входов [3]. Таким образом, передача такой базовой характеристики зрительного сигнала как пространственная контрастная чувствительность начинается с участием глутаматергических механизмов. Для обсуждения наших результатов это особенно актуально тем, что глутаматергические механизмы активно участвуют в реакции нейронов на кислородную де-привацию.
Далее, для проверки гипотезы о различной чувствительности палочковой и колбочковой систем на недостаток кислорода мы провели серию опытов по регистрации ЭРГ на дальние красные (645 нм) и зеленые (507 нм) световые стимулы в ходе гипоксии и реоксигенации изолированной сетчатки (рис. 4).
В ответ на оба типа световых стимулов динамика ЭРГ в целом была сходной, хотя в отдельных случаях можно было проследить более выраженные изменения С-волны ЭРГ в ходе кислородной депривации. Опыты с регистрацией СРП, а также Ь- и С-волн ЭРГ
на красные и зеленые стимулы при аноксии и реоксигенации, предпринятые нами для выявления различий в реакции палочковой и колбочковой систем на гипоксию, статистически значимых различий не дали. Тем не менее этот факт также позволяет провести определенное обсуждение и сделать некоторые выводы. Известно, что максимумы спектральной чувствительности сетчатки амфибий находятся в области 432 (зеленые палочки), 500 (типичные палочки) и 575 (колбочки) нанометров. Поэтому, в соответствии с методикой «электроретинографической колориметрии» [4], использованные нами длины световых волн вызывают преимущественно либо палочковые, либо колбочковые ответы. В соответствии с классическими патофизиологическими представлениями, к гипоксии особенно чувствительны мелкоклеточные высокочастотные нейроны с более скоростными временными характеристиками [5]. В сетчатке такими характеристиками обладает колбочковая система, поэтому можно было бы ожидать более выраженную динамику при аноксическом воздействии со стороны ЭРГ и СРП на стимулы 645 нм, но этого мы не наблюдали.
Кроме того, с учетом глутаматергической передачи сигналов фоторецепторов к ON- и OFF-биполярным клеткам при аноксической деполяризации фоторецепторов и нейронов сетчатки можно было бы ожидать значительное повышение амплитуды d-волны ЭРГ (суммарный ответ нейроглияльных элементов на выключение), но этого ни на красные, ни на зеленые стимулы мы не наблюдали.
Подавление b- и d-волн ЭРГ при аноксии и их восстановление при реоксигенации с учетом глутаматергической природы передачи сигналов в наружном синаптическом слое, по нашему мнению, наиболее корректно трактуется следующим образом. На уровне передачи зрительных сигналов в наружном синаптическом слое блокада аэробного метаболизма в результате аноксии способна запустить, как минимум, два патогенетических механизма. Во-первых, непосредственное угнетение активного транспорта ионов с последующим выравниванием ионных градиентов и подавлением электрической активности фоторецепторов и нейронов сетчатки, что и прекращает генерацию ЭРГ Во-вторых, депрессия АТф-зависимого транспорта глутамата в синаптические пузырьки и, как следствие, нарушение глутаматергической передачи зрительного сигнала в наружный синаптический слой с последующим торможением электрической активности биполяров, в результате чего и подавляются b- и d-волны ЭРГ Исследования на культуре клеток показали, что глутамат способен активировать глутаматные рецепторы в микроскопических дозах, поэтому концентрация глутамата, выделяемого фоторецепторами в синаптическую щель, на несколько порядков превышает концентрацию, необходимую для активации большинства постси-наптических рецепторов. Этот избыток глутамата инактивируется за счет нескольких, в том числе и нейроглияльных механизмов [6].
Необратимое подавление СРП при аноксии изолированной сетчатки, по нашему мнению, является следствием потенциации эффектов аноксии, с одной стороны, и избыточного содержания в сетчатке глутамата — с другой. Цитотоксичность глутамата на нейроны реализуется через глутаматные рецепторы и носит выраженный дозозависимый характер. Так, Мироновой Е. В. (2007) показано, что концентрация глутамата около 1 мМ является пороговой для гибели
нейронов коры головного мозга и реализуется через NMDA рецепторы, а концентрация 3 мМ вовлекает и АМРА/КА рецепторы в индукцию некротических процессов. Воздействие глутамата в течение более 240 минут вызывает развитие апоптоза, что определяется типом активируемых рецепторов глутамата и приводит к значительному изменению функционального состояния дендритов [7]. Таким образом, медленное подавление СРП при аноксии и отсутствие восстановления при реоксигенации обусловлено наложением эффектов кислородной депривации сетчатки и цитотоксичным эффектом глутамата, реализованного через соответствующие постсинаптические рецепторы.
Сложнее трактуется динамика b- и d-волн ЭРГ в ходе аноксии и реоксигенации. Мы полагаем, что изменения этих волн электроретинограммы реализуются тоже за счет глутаматергического механизма фоторецепторов. В случае «чистой», без экзогенного глутамата, аноксии срабатывают защитные тормозные механизмы, вызывающие торможение генерации ЭРГ и ее восстановление при реоксигенации. Главными мишенями аноксии нейронов являются активные АТФ-зависимые транспортные механизмы. На уровне синаптической передачи в НСС от фоторецепторов к нейронам второго порядка основными потребителями окислительного метаболизма являются ионные насосы, осуществляющие активный транспорт ионов, и АТФ-азные механизмы транспорта глутамата в синаптические пузырьки. Мы полагаем, что наиболее чувствительным к недостатку кислорода является второй механизм и угнетение b- и d-волн ЭРГ происходит из-за подавления активного внутриклеточного транспорта глутамата в пресинап-тической области, что приводит к дефициту нейроме-диатора. Угнетение b- и d-волн ЭРГ при аноксии происходит из-за усиления тормозных процессов по типу пресинаптического торможения, что снижает аэробные потребности фоторецепторов и играет защитную роль. Реоксигенация восстанавливает механизмы активного транспорта глутамата во внутренних сегментах фоторецепторов, возобновляет синаптическую передачу и генерацию электроретинограммы. Считаем, что подтверждением этой схемы служит отсутствие достоверных различий между b- и d-волнами у палочковой и колбочковой ЭРГ В случае угнетения ЭРГ из-за простого подавления активного транспорта ионов в нейронах сетчатки, когда происходят процессы гипоксической деполяризации мембраны, можно было бы ожидать существенные различия в динамике активности ON- и OFF-биполяров, а следовательно, и соответствующих волн ЭРГ на красные и зеленые стимулы. В этой схеме нельзя также исключать роль обратных тормозных влияний на фоторецепторы со стороны горизонтальных клеток.
Разумеется, для подтверждения высказанных здесь положений необходимы специальные исследования с привлечением микроэлектродной техники и нейрохимических методов. Важно отметить, что представленные результаты полностью укладываются в концепцию R. E. Marc et al. (2003), согласно которой потеря нормальной входной сигнализации от фоторецепторов к палочковым и колбочковым биполярам с ON- и OFF-центрами, а также на горизонтальные клетки приводит к грубым нарушениям и утрате функций рецептивных полей [8]. На финальных стадиях ремоделирования нейросетчат-ки патологические процессы распространяются на проксимальные отделы сетчатки и внутренний си-
наптический слой, но эти процессы уже находятся за рамками настоящей статьи.
Практический аспект сведений, представленных в настоящей статье, мы видим в том, что для тонкой, практически дифференциальной диагностики патологии сетчатки необходим целый набор электрофизиологических методов, каждый из которых решает конкретные задачи. Актуальность и необходимость такого комплексного нейрофизиологического подхода в электрофизиологическом исследовании функционального состояния зрительной системы от ней-роэпителиальных элементов сетчатки до корковых представительств зрительного анализатора четко прослеживаются в публикациях М. В. Зуевой c соавт. [9, 10]. Для диагностики патологии нейроэпителия сетчатки мы полагаем целесообразным применять различные методы электроретинографии совместно с электроокулографией при различных режимах световой стимуляции, но это уже тема другого исследования.
Заключение. Эксперименты с электроретино-графией кроликов in vivo показали снижение электрической активности сетчатки в первые дни после экспериментальной витрэктомии с последующим восстановлением к 14-м суткам наблюдения. Такая экспериментальная модель и метод регистрации общей ЭРГ прежде всего дают представление об общем функциональном состоянии сетчатки при разнообразных патогенетических воздействиях, связанных, в частности, с витреоретинальными вмешательствами в эксперименте.
Более изощренный патофизиологический подход с регистрацией электроретинограммы и суммарного рецепторного потенциала на изолированной сетчатке земноводных позволил выделить более «чистые» нейрофизиологические компоненты в реакции ее нейрорецепторных элементов на депривацию кислорода. Показаны быстрое угнетение a-, b- и d-волн ЭРГ при аноксии и их восстановление при реоксигенации. СРП в ходе аноксии угнетается медленнее, чем ЭРГ, но в ходе реоксигенации его восстановления не происходит. Различная динамика СРП и ЭРГ и отсутствие явных различий в динамике ON- и OFF-реакций палочковой и колбочковой систем объясняются нейронным торможением передачи в НСС сетчатки. Разумеется, эта трактовка имеет определенные ограничения, связанные с особенностями любых переживающих изолированных препаратов, а также метаболическими отличиями лабораторных животных.
Конфликт интересов не заявляется.
Авторский вклад: концепция и дизайн исследования, получение и обработка данных, анализ и интерпретация результатов, написание статьи, утверждение рукописи для публикации — Т. Р Мухамадеев, Р Р. Ахмадеев.
References (Литература)
1. Linsenmeier RA, Zhang HF. Retinal Oxygen: from animals to humans. Progress in Retinal and Eye Research 2017.
2. Byzov AL. Physiology of Retina: neuromediators and electrogenesis. In: Clinical physiology of Vision: Digest. Shamshinova AM, ed. Moscow, 2006; p. 50-64. Russian (Бы-зов А. Л. Физиология сетчатки: нейромедиаторы и электроге-нез. В кн: Клиническая физиология зрения: очерки / под ред. А. М. Шамшиновой. М., 2006; c. 50-64).
3. Maksimova EM. Vertebrate Retina: Cellular Interaction Mechanisms. In: Clinical physiology of Vision: Digest. Shamshinova AM, ed. Moscow, 2006; p. 77-108. Russian (Максимова Е. М. Сетчатка позвоночных животных: механизмы клеточного взаимодействия. В кн: Клиническая физиология зрения: очерки / под ред. А. М. Шамшиновой. М., 2006; c. 77-108).
4. Chernorizov AM. Neural mechanisms of color vision: DSc diss. Moscow, 1999; 227 p. Russian (Черноризов А. М. Нейронные механизмы цветового зрения: дис. ... д-ра психол. наук. М., 1999; 227 с.).
5. Samoilov MO. Reaction of brain neurons to hypoxia. Moscow: Nauka, 1985; 226 p. Russian (Самойлов М. О. Реакция нейронов мозга на гипоксию. М.: Наука, 1985; 226 с.).
6. Connaughton V. Glutamate and Glutamate Receptors in the Vertebrate Retina. In: Kolb H, Fernandez E, Nelson R. The Organization of the Retina and Visual System [Internet]. Salt Lake City, 2005.
7. Mironova EV. Mechanisms of glutamate toxic action in the neurons of cerebral cortex: PhD diss. St.Petersburg, 2007; 112 p. Russian (Миронова Е. В. Механизмы токсического действия глутамата в нейронах коры головного мозга: дис. . канд. биол. наук. СПб., 2007; 112 с.).
8. Marc RE, Jones BW, Watt CB, Strettoi E. Neural remodeling in retinal degeneration. Progress in Retinal and Eye Research 2003; 22: 607-55.
9. Zueva MV. Ganglion cells physiology and neurodegenerative diseases of the retina: the pathogenetic aspect. Russian Ophthalmological Journal, 2014; 3: 102-7. Russian (Зуева М. В. Особенности физиологии ганглиозных клеток в аспектах патогенеза нейродегенеративных заболеваний сетчатки. Российский офтальмологический журнал 2014; 3: 102-7).
10. Zueva MV, Tsapenko IV. Structural and functional organization of Muller cells: role in retinal development and pathology. In: Clinical physiology of Vision: Digest. Shamshinova AM, ed. Moscow, 2006; p. 128-91. Russian (Зуева М. В., Ца-пенко И. В. Структурно-функциональная организация клеток Мюллера: роль в развитии и патологии сетчатки. В кн.: Клиническая физиология зрения: очерки / под ред. А. М. Шамши-новой. М., 2006; с. 128-91).
