CC BY
386
ф
ТОМ 1 • НОМЕР 3 • ИЮЛЬ - СЕНТЯБРЬ 2008
КЛИНИЧЕСКАЯ
О Н КОгематология
СЕМИНАР ПО ГЕМАТОЛОГИИ
Свертывание крови: современные проблемы (часть 3)
М. А. Пантелеев, Е. И. Синауридзе, Ф. И. Атауллаханов Blood coagulation: current problems i
(part 3) ---------------------------------------
M. A. Panteleev, E. I. Sinauridze, F. I. Ataullakhanov Keywords:
hemostasis, thrombosis, blood coagulation, recombinant activated factor VII, hemodilution, contact activation of coagulation, thrombin inhibitors.
Ключевые слова
гемостаз, тромбоз, свертывание крови, рекомбинантный активированный фактор VII, гемодилюция, контактная активация свертывания, ингибиторы тромбина.
Ф
National Research Center for Hematology, Moscow Контакты: [email protected] Принято в печать: 20 августа 2008 г.
ВВЕДЕНИЕ
Свертывание крови представляет собой сложную систему реакций, активирующихся в плазме крови при повреждении стенки сосуда и ведущих к формированию фибринового сгустка, закрываю -щего место повреждения и препятствующего кровоизлиянию и потере крови.1,2 Задача, которую выполняет эта система, является жизненно важной и крайне сложной. С одной стороны, в норме кровь должна поддерживаться в жидком состоянии. Неконтролируемое формирование фибриновых сгустков легко может оказаться фатальным. С другой стороны, при появлении повреждения кровь должна максимально быстро и локализованно перейти в твердое состояние. Система свертывания должна уметь быстро распознать повреждение и сформировать адекватный сгусток, причем это необходимо уметь проделывать в сосудах разного размера, с различными скоростями потока крови и типами повреждений. При этом важно не допустить распространения активированных ферментов свертывания по кровотоку. По-видимому, именно эти требования обусловили высокую сложность данной системы, представляющей собой каскад ферментов, который содержит многочисленные положительные и отрицательные обратные связи и активно взаимодействует с клетками крови, эндотелия и субэндотелия.2,3
Несмотря на всю свою сложность или, возможно, благодаря ей, в медицинском смысле система свертывания является одной из самых уязвимых систем человеческого организма. По-видимому, это связано с самим принципом ее работы «на грани» между тромбозом и кровоточивостью. В норме эта система работает в строгом балансе: сгустки хорошо образуются, но только там и тогда, когда это нужно. Любое нарушение баланса свертывания достаточно тяжело исправить терапевтически. Например, простое назначение современных антикоагулянтов непременно ингибирует не только тромбоз, но и гемостаз. Возможно, именно из-за этого нарушения свертывания, особенно тромботические, сейчас являются одной из ведущих причин смерти в мире.4
На протяжении всего XX в. свертывание крови было предметом активного изучения. Несмотря на это, диагностика и терапия вынужденно происходили достаточно случайным образом, разработка методов и лекарственных средств была результатом нечаянных находок, а о полезности лекарства можно было судить только по практическим результатам его применения. Впрочем, такая ситуация была достаточно типична для всей истории медицины, и только в конце второго тысячелетия нашей эры ситуация постепенно начала меняться, в т. ч. и в вопросах свертывания крови.
Ф
Гематологический научный центр РАМН, Москва
259
Ф
М. А. Пантелеев и др.
Исследования свертывания на протяжении последних десятилетий привели к детальному описанию биохимического устройства этой системы,2,3 а также к значительному прогрессу в понимании ее регуляции.5-8 И, наконец, настало время начать применять это знание и понимание для решения конкретных практических задач, связанных с диагностикой и терапией нарушений свертывания крови.
В настоящее время разработка новых фармацевтических средств в области свертывания крови идет с такой скоростью, что объединить все стороны этого процесса в одном обзоре невозможно. Поэтому наше внимание в этой статье будет сосредоточено на нескольких важных и актуальных вопросах: 1) выявление механизма действия рекомбинантного активированного фактора VII (препарат Новосевен) и построение оптимальной терапевтической стратегии в зависимости от этого механизма; 2) механизмы нарушения свертывания при использовании больших объемов плазмозамещающих растворов в случае большой кровопотери и других патологий, а также возможные варианты их коррекции; 3) роль контактного пути в тромбозе и гемостазе.
ПРОБЛЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Рекомбинантный активированный фактор VII: возможные механизмы действия
Активированный фактор VII был впервые применен в клинике в начале 1980-х годов как средство для улучшения гемостаза у больных гемофилией, имевших ингибиторные антитела.9 Изначальное предположение о его возможной эффективности базировалось на следующем:9 1) это единственная сериновая протеаза, не инактивируемая антитромбином и потому теоретически способная достаточно долго циркулировать в кровотоке; 2) связавшись с тканевым фактором, он может активировать фактор X «в обход» внутренней теназы, отсутствующей при гемофилии и неспособной появиться при ингибиторной гемофилии; 3) он не имеет никакой активности в отсутствие тканевого фактора и потому не должен вызывать никаких побочных явлений, а только улучшать свертывание в присутствии тканевого фактора. Несмотря на то что практически все эти исходные предпосылки были позднее подвергнуты пересмотру (вплоть до опровержения), эксперимент оказался успешным.
Первые клинические исследования были проведены на белке, выделенном из человеческой плазмы. Появление рекомбинантного активированного фактора VII (эптаког а (активированный), Новосевен®) сделало этот метод несравненно безопаснее с точки зрения инфекций. Со временем этот препарат был лицензирован для лечения ингибиторных гемофилий во многих странах мира, включая США, Европу и Россию. Успешное улучшение гемостаза при гемофилии побудило врачей пытаться использовать активированный фактор VII при других нарушениях гемостаза, если иные методы оказывались бессильными. В течение последних 15 лет появились многочисленные работы, указывающие на возможность успешного применения Новосевена при дефиците факторов V, VII, XI, X, тромбоцитопении, тромбастении Гланцманна, синдроме Бернара—Сулье, болезни фон Вил-лебранда, разнообразных нарушениях гемостаза, связанных с травмами, ожогами, хирургическими вмешательствами, и во многих других случаях.10 Для многих видов нарушений имеется опыт применения только у отдельных пациентов, для других — проведены полноценные клинические испытания.
Несмотря на успешное внедрение препарата в клиническую практику, вопрос о точном механизме его действия продолжал оставаться открытым. Одно из самых простых 260
возражений против высказанных выше постулатов звучало следующим образом. Известно, что для получения клинического эффекта необходимы такие дозы Новосевена, которые приводят к плазменным концентрациям белка около 50 нмоль.11 Также известно, что равновесная константа связывания фактора VIIa с тканевым фактором (характеризующая концентрацию, при которой 50 % молекул фактора связаны с рецептором) составляет пикомоли, т. е. в тысячи раз меньше.12 Точные оценки количества «обнажающегося» при повреждении тканевого фактора тяжело привести, но есть все основания думать, что его слишком мало, чтобы насытить даже тот фактор VIIa, который присутствует в плазме изначально. Если считать, что Новосевен работает в комплексе с тканевым фактором, то как же объяснить огромную разницу между маленькой константой связывания и большой концентрацией, требуемой для клинического эффекта? Казалось бы, его воздействие должно достигать насыщения при пикомолярных концентрациях и не меняться при дальнейшем увеличении.
С самого начала было известно, что фактор VIIa способен сокращать время свертывания в тесте активированного частичного тромбопластинового времени. Этот тест делается без добавления тканевого фактора. К концу 1980-х годов было детально показано, что активированный фактор VII действительно может активировать свертывание и без тканевого фактора, если есть фосфолипиды.13 Несмотря на то что эффективность работы фактора VIIa в таких реакциях была заметно ниже, чем с тканевым фактором,13 общая скорость при большой концентрации фактора VIIa могла быть значительной. В норме роль такой реакции должна быть пренебрежимо мала, но при использовании Новосеве-на концентрация фактора VIIa увеличивается в сотни раз по сравнению с нормой. Такая реакция могла бы объяснить, почему для полезного действия Новосевена необходимы большие концентрации.
Однако с точки зрения объяснения клинического действия препарата Новосевен эти результаты не давали убедительной информации. Все эксперименты проводились в искусственных системах из очищенных белков, куда были добавлены высокие концентрации фосфолипидных везикул. Принципиально новые данные были получены несколько лет спустя, когда группа исследователей под руководством Гарольда Робертса обнаружила, что фактор VIIa способен связываться с мембранами моноцитов14 и активированных тромбоцитов15 и активировать фактор X без участия тканевого фактора. В результате этих исследований была выдвинута гипотеза: фактор VIIa связывается с активированными тромбоцитами, которые формируют агрегат как раз в месте повреждения, и активирует фактор X. Таким образом, Ново-севен может заменить факторы свертывания VIIIa и IXa, которые в норме обеспечивают активацию фактора X, но отсутствуют при ингибиторной гемофилии.
Эта гипотеза позволила убедительно объяснить клиническую эффективность Новосевена и объяснить, почему для достижения эффекта препарат нужно вводить в больших концентрациях: фактор VIIa плохо связывался с тромбоцитами, и константа связывания как раз имела порядок в десятки наномолей.15 Но всего лишь несколько лет спустя появились убедительные доказательства в пользу того, что зависящий от тканевого фактора механизм действия Ново-севена тоже рано «хоронить».16
Группа исследователей из университета Вермонта под руководством Кеннета Манна обратила внимание на то, что при активации свертывания происходит конкуренция между фактором VIIa и его неактивным предшественником — фактором VII. В норме концентрация предшественника
260 Клиническая онкогематология
Ф
Свертывание крови
составляет 10 нмоль, что в 100 раз больше, чем концентрация циркулирующего активного фактора. Только в процессе свертывания, по мере активации фактора VII это соотношение может постепенно меняться. Поскольку обе формы фактора связываются с тканевым фактором с одинаковым высоким сродством, то получается, что 99 % тканевого фактора при активации оккупированы неактивной формой фактора VII, т. е. предшественник фактора VII является мощным конкурентным ингибитором запуска свертывания. А добавление больших концентраций рекомбинантного фактора VIIa позволяет преодолеть это ингибирование. Эта гипотеза также успешно объясняла, почему Новосевен нужно использовать в таких больших концентрациях. Авторы смогли подкрепить свои предположения экспериментами, которые показывали, что фактор VII действительно сильно ингибирует свертывание, что это ингибирование особенно заметно в плазме больного гемофилией и что добавление фактора VIIa способно компенсировать ингибирование и улучшить свертывание.16
Появившись в 2000 г., эта работа положила начало активной дискуссии, в значительной степени продолжающейся до настоящего времени.17-23 Хотя существование обоих механизмов действия было несомненным, спор шел о том, какой из них играет большую роль в клиническом эффекте препарата. При этом вопрос не был чисто академическим, а имел большое практическое и коммерческое значение. Дело в том, что одновременно в клинической литературе активно обсуждалась возможность использования сверхвысоких доз Ново-севена для достижения большей эффективности,11 а эти два механизма предсказывали разные результаты такой стратегии. Первый, тромбоцитзависимый механизм15 предвещал, что сверхвысокие дозы препарата могут оказать эффект, т. к. скорость реакции на тромбоцитах зависит от концентрации фактора VIIa достаточно линейно. Напротив, конкурентный механизм16 предсказывал, что концентрацию фактора не имеет никакого смысла увеличивать дальше: при 50 нмоль Новосевен уже вытесняет практически весь неактивированный фактор VII из комплекса с тканевым фактором, а дальнейшее увеличение дозы — лишь напрасная нагрузка на организм и колоссальные расходы.
Для того чтобы сделать выбор между гипотезами, исследователи использовали преимущественно тест генерации тромбина в реконструированных системах очищенных белков с фосфолипидами (или тромбоцитами) либо в цельной крови. Результаты этих исследований были неоднозначными. Данные в реконструированной системе из белков и клеток показали, что фактор VIIa сам по себе может активи -ровать свертывание на активированных тромбоцитах и что генерация тромбина непрерывно растет при увеличении его концентрации.21 Это подтверждает справедливость гипотезы о неконкурентном, зависящем от тромбоцитов механизме. С другой стороны, генерация тромбина в реконструированной системе на фосфолипидах не могла быть запущена фактором VIIa без тканевого фактора; увеличение концентрации фактора VIIa выше уровня, необходимого для вытеснения зимогена фактора VII, не приводило ни к какому результату; добавление фактора VIIa без фосфолипидов в цельную кровь больного гемофилией также не вызывало эффекта.24 Это не согласуется с неконкурентной гипотезой.
Мы предположили, что разные результаты в этих системах были получены из-за того, что они различаются по количеству и/или локализации тканевого фактора. Для проверки этой гипотезы нами были проведены эксперименты по генерации тромбина и свертыванию в рекальцифицированной плазме с добавлением фактора VIIa.25 Они показали, что генерация тромбина растет с увеличением концентрации фак-
www.medprint.ru
тора VIIa в тех случаях, когда тканевого фактора мало; его повышение ведет к исчезновению зависимости. Одновременно пространственная локализация тканевого фактора в части реакционного объема приводит к увеличению эффекта. Результаты выглядят достаточно логично: слабая реакция активации фактора X фактором VIIa на фосфолипидах становится заметной тогда, когда тканевого фактора мало. Это позволяет предположить, что вклады двух путей в организме зависят от степени и локализации повреждения25 и что сверхвысокие дозы фактора VIIa могут приводить к увеличению прокоагулянтного ответа по сравнению со стандартной дозой.
ПРОБЛЕМА ГЕМОДИЛЮЦИИ
В условиях современной клиники переливание компонентов крови или плазмозамещающих растворов является широко распространенной практикой, в ряде случаев (массивная кровопотеря) — обязательной. Для этого используются различные кристаллоидные и коллоидные плазмозамещающие растворы (ПЗР), свежезамороженная плазма (СЗП), а также концентраты эритроцитов, тромбоцитов и т. д. Основные цели при переливании крови следующие.
1. Восполнение объема циркулирующей крови для поддер-
жания артериального давления, объема сердечного выброса, предупреждения коллапса сосудов, сохранения нормальных реологических характеристик крови и нормальной перфузии органов и тканей.
2. Поддержание нормального коллоидно-осмотического дав-
ления плазмы и ее кислотно-основного равновесия.
3. Поддержание кислородтранспортной функции крови и
функций системы гемостаза.
Для достижения первых двух целей обычно переливают различные ПЗР Обеспечение кислородтранспортной функции достигается переливанием эритроцитов, модифицированного гемоглобина или кислородпереносящих растворов типа перфторанов, а поддержание функций системы свертывания — переливанием СЗП, концентратов тромбоцитов или концентратов отдельных факторов свертывания.
Поскольку самой важной задачей врача при кровопотере является восполнение объема циркулирующей жидкости,26 препаратами первой линии среди инфузионных растворов являются искусственные ПЗР. Вопросами нормализации работы системы свертывания врач будет заниматься потом, когда основная задача будет решена. Важно отметить, что ни один из современных ПЗР не содержит компонентов системы свертывания крови, поэтому переливание больших объемов этих растворов неминуемо ведет к разбавлению плазмы и, следовательно, к изменениям в концентрациях факторов свертывания (гемодилюции). Это не может не сказаться на состоянии коагуляционной системы. Теоретически использование СЗП для восполнения объема крови могло бы поддержать эти концентрации на нормальном среднем уровне и заставить нас забыть о проблемах со свертыванием. Однако по массе причин, начиная с высокой опасности вирусного заражения или тяжелого иммунного ответа и заканчивая соображениями стоимости, использование СЗП рекомендуется лишь тогда, когда нельзя обойтись иными средствами.
Для полноты картины необходимо отметить, что ПЗР могут влиять на свертывание, не только разбавляя плазму, но и другими путями. Некоторые коллоиды прямо взаимодействуют с отдельными факторами свертывания или фибринолиза, снижая или повышая их активность,27-29 либо встраиваются в структуру образующихся сгустков, изменяя их качество и способность противостоять току крови в сосуде.30,31 Такие вещества могут существенно изменять гемостатический от-
261
М. А. Пантелеев и др.
вет организма.32 Несмотря на то что эти свойства ряда ПЗР очень важны для практической медицины, в данном обзоре мы, по возможности, не будем их касаться, т. к. эту проблему надо детально и тщательно рассматривать для каждого конкретного раствора. Здесь же мы сосредоточимся на общем для всех ПЗР эффекте гемодилюции.
Как ни странно, на настоящий момент не существует общепринятого мнения о том, насколько сильно переливание ПЗР влияет на систему свертывания. Что еще более удивительно, сам вопрос о том, в какую сторону направлено это влияние, также является неразрешенным.
Первой приходит мысль о том, что свертывание крови должно ухудшаться, т. к. разбавляются факторы свертывания. Но проблема заключается в том, что система свертывания представляет собой тонко сбалансированный механизм с десятками участников, среди которых на полных правах присутствуют как прокоагулянтные факторы (протромбин, фибриноген и десятки других), так и антикоагулянтные (антитромбин, протеин С и др.). Предсказать результаты одновременного разбавления всех этих факторов «на пальцах» невозможно. Баланс в таких системах может смещаться как в одну, так и другую сторону. Что если разбавление антитромбина (который ингибирует десяток ферментов) будет для свертывания более важным, нежели разбавление протромбина? Тогда разбавление плазмы может привести к усилению свертывания, т. к. ингибитора стало меньше.
Кроме того, разная степень разбавления вполне может вызывать разные эффекты (понятно, что достаточно сильное разбавление обязательно ухудшит гемостаз, т. к. просто не останется достаточного количества фибриногена для формирования сгустка).
Поскольку наглядные соображения не способны помочь с выявлением результата, можно попробовать обратиться к клиническому опыту. К сожалению, здесь ситуация тоже противоречива. Многие врачи не сомневаются, что следствием массивных инфузий ПЗР является ухудшение свертывания (коагулопатия) из-за снижения концентраций прокоагулянт-ных факторов вследствие гемодилюции. Действительно, при массивных инфузиях довольно часто наблюдаются микрососудистые и другие кровотечения.33,34 С другой стороны, авторы некоторых работ полагают, что причиной этих кровотечений является не простое разбавление, а истощение запаса прокоагулянтных факторов из-за сильной исходной активации коагуляции, как, например, в случае диссеминированного внутрисосудистого свертывания.35
Существуют клинические исследования, которые прямо показывают увеличение вероятности возникновения тромботических состояний при увеличении объема перелитых ПЗР36-38 Как правило, массивные переливания крови проводятся на фоне значительной травмы или операции, которые сами могут вести к повышенной активации свертывания. Наконец, если встать на ту точку зрения, что разбавление делает кровь более прокоагулянтной, то можно предположить, что эта прокоагулянтность и способствует развитию коагу-лопатии потребления.
Другим возможным способом докопаться до истины является использование различных моделей гемостаза и тромбоза. Однако здесь тоже возникает серьезная проблема, связанная с тем, что различные экспериментальные модели in vitro дают прямо противоположные результаты.
Первые исследования нарушений в системе свертывания при переливании ПЗР с помощью классических клот-тинговых тестов, таких как тест протромбинового времени или активированного частичного тромбопластинового времени, привели к заключению, что ПЗР вызывают коагуло-патию разбавления: время свертывания при переливании 262
всегда удлинялось.34,35 Во многих работах для анализа эффективности свертывания при разбавлении плазмы ПЗР разных типов была использована тромбоэластография. При этом выводы авторов о том, как одинаковые растворы влияют на свертывание, иногда оказываются прямо противоположными. Так, в одной работе39 ПЗР снижали скорость образования и силу сгустка. Другие авторы40 также говорят об ингибировании свертывания при добавлении любого ПЗР (даже простого физиологического раствора) к цельной крови. Они регистрируют снижение количества образующегося тромбина при запуске свертывания в образцах крови, разбавленной различными ПЗР, измеряя концентрацию образовавшегося тромбин-антитромбинового комплекса. Данный результат, однако, нельзя считать однозначным, т. к. разбавление крови любым ПЗР снижает концентрацию антитромбина III в ней, а это, безусловно, должно приводить к уменьшению количества образовавшегося комплекса тромбин— антитромбин III.
С другой стороны, эксперименты с использованием тромбоэластографии часто показывают, что разбавление плазмы может не только не привести к замедлению свертывания, но даже, наоборот, стать причиной гиперкоагуляции. Целый ряд работ in vitro и in vivo демонстрирует укорочение времени реакции (г) и коагуляции (k), что говорит об ускорении активации свертывания, а также увеличении скорости свертывания (угла а) при тромбоэластографических исследованиях плазм, разбавленных различными ПЗР41-46
Некоторые работы исследовали степень изменений свертывания при одинаковых разбавлениях in vitro и in vivo. В результате был сделан вывод, что влияние ПЗР для двух этих постановок экспериментов различно.47,48 При этом большая степень разбавления, которая вызывала in vitro замедление свертывания, in vivo приводила к гиперкоагуляции. Это можно объяснить тем, что в организме снижение концентраций некоторых факторов и ингибиторов свертывания при гемодилюции не пропорционально степени разбавления. Существуют депо, например, в печени, откуда недостающий фактор может быстро выходить в кровоток, если его концентрация резко снизилась. Поэтому реальная степень разбавления в организме оказывается меньше, чем ожидаемая (или получаемая in vitro при строго дозированном разбавлении).
Разбавление кристаллоидами in vivo в ходе операций на сердце с использованием экстракорпорального кровообращения (сердечно-легочного шунтирования), а также исследование образцов от этих же пациентов при разбавлении раствором Рингера in vitro показало сокращение активированного времени свертывания и укорочение временных параметров тромбоэластограммы.49 Ускорение свертывания также было обнаружено при тестировании различных образцов разбавленной плазмы на прибора SONOCLOT.50
Существующие противоречия хорошо иллюстрируют проблему выбора адекватного теста для исследования свертывания in vitro. В настоящее время адекватность классических клоттинговых тестов для характеристики состояния системы свертывания часто подвергается сомнению.51-53 Мы полагаем, эти тесты неадекватно реагируют и на гемодилю-цию. В них используется исключительно сильная активация, далекая от физиологических условий; кроме того, сама методика этих тестов подразумевает 2—4-кратное разбавление плазмы. Эти тесты рассчитаны на определение концентраций факторов свертывания и практически не чувствуют изменений в концентрациях ингибиторов. Стоит ли удивляться, что они не способны почувствовать гиперкоагуляцию при гемодилюции?
Чтобы проверить справедливость этих предположений, в нашей лаборатории были выполнены исследования свер-
262 Клиническая онкогематология
Ф
Свертывание крови
тывания при разбавлении плазмы ПЗР как in vitro, так и in vivo, с использование новых методов анализа системы свертывания: теста генерации тромбина и измерения скорости роста сгустка в пространстве.54-57 В отличие от стандартных тестов измерения времени свертывания данные методы используют гораздо более слабую исходную активацию, близкую к существующей в организме. Это делает их чувствительными как к состоянию гипо-, так и гиперкоагуляции в исследуемых образцах плазмы.
В опытах in vitro было показано,58 что умеренное разбавление плазмы любым из исследованных кристаллоидных и коллоидных ПЗР приводит к увеличению количества тромбина, генерируемого в образце разбавленной плазмы при активации свертывания. Зависимость величины эндогенного тромбинового потенциала от степени разбавления плазмы имеет колоколообразную форму: при слишком сильном разбавлении продукция тромбина уменьшается. Влияние гемодилюции на пространственную динамику свертывания оказалось более сложным. Несмотря на увеличение количества образующегося тромбина, скорости роста сгустка в пространстве в присутствии разных коллоидов вели себя по-разному: увеличивались, практически не изменялись, а для реополиглюкина даже снижались при разбавлении.58
В других работах влияние гемодилюции на свертывание было изучено in vivo.59-61 Были исследованы две группы пациентов. Первая группа — здоровые добровольцы, не имевшие кровопотери, которым был перелит только гидрок-сиэтилкрахмал 130/0,4 (волювен) или раствор модифицированного желатина (гелофузин). Вторая группа — здоровые доноры костного мозга, которые в ходе операции имели кровопотерю от 1 до 2 л. Согласно протоколу, все они получали инфузии кристаллоидных ПЗР, а также инфузию одного из вышеупомянутых коллоидных ПЗР Рассчитанная степень гемодилюции в 1-й группе составляла 1,17 ± 0,01 раза; во 2-й группе она варьировала от 1,3 до 2,7 раза (в среднем 1,78 ± 0,4 раза). Состояние гемостаза пациентов оценивали, измеряя скорость роста сгустка в пространстве, эндогенный тромбиновый потенциал и параметры тромбоэластогра-фии до, а также через 2, 24 и 48 ч после инфузии коллоидного ПЗР Для обеих групп пациентов скорость пространственного роста сгустка через 2 ч после гемодилюции была повышена. Затем она постепенно снижалась, достигая в большинстве случаев исходного уровня через 48 ч после инфузии ПЗР Эндогенный тромбиновый потенциал, а также данные тромбоэластографии качественно изменялись аналогичным образом. Гиперкоагуляционное влияние гелофузина на параметры тромбоэластографии и скорость роста сгустка в пространстве оказалось выше, чем у гидроксиэтилкрахмала.
Учитывая, что практически при любом восполнении кровопотери в первую очередь всегда переливают кристал-лоидные растворы, а также то, что именно эти растворы вызывают наиболее сильную гиперкоагуляцию, которая может вызвать гиперкоагуляционный синдром, а затем и диссеминированное внутрисосудистое свертывание или тромбоз, было предложено ввести в состав стандартного кристалло-идного ПЗР ингибитор тромбина.62 Это должно предупредить появление гиперкоагуляции при разбавлении плазмы в результате массивного переливания такого раствора. Гипотеза была проверена экспериментально. В качестве ингибитора тромбина был использован либо его природный ингибитор антитромбин III,62 либо самостоятельно разработанные авторами новые синтетические низкомолекулярные ингибиторы тромбина.58 Было показано, что введение в ПЗР любого из испытанных ингибиторов приводит к частичной коррекции гиперкоагуляционных нарушений как в тестах генерации тромбина, так и при измерении пространственной динами-
www.medprint.ru
ки свертывания. То, что коррекция оказывается не совсем полной, связано, по-видимому, с тем, что при гемодилюции происходит разбавление не только плазменных ингибиторов тромбина, но и других ингибиторов системы свертывания, присутствующих в плазме.
Подводя итог, можно сказать, что ответ системы свертывания на разбавление искусственными ПЗР, который мы получим, будет зависеть от многих факторов: степени разбавления плазмы; природы ПЗР; времени после гемодилюции, в котором мы будем измерять свертывание; метода анализа гемостатического статуса и т. д. В каждой из опубликованных в литературе работ эти условия были различны. Именно это приводит к тому, что полученные разными исследователями результаты противоречат друг другу. Наши исследования показали, что при не очень большой (до 2—2,5 раза) степени разбавления крови ПЗР вызывает скорее гиперкоагуляционный, чем замедляющий свертывание ответ. Можно предположить, что добавление ингибиторов свертывания в ПЗР может быть хорошим способом предотвратить этот эффект.
ЗАГАДКА КОНТАКТНОГО ПУТИ
В первой части данного обзора63 мы отмечали, что существует два пути запуска системы свертывания: внешний (путь тканевого фактора) и внутренний (путь контактной активации свертывания). Контактный путь достаточно неспецифичен и активируется при контакте плазмы крови практически с любой чужеродной поверхностью. Детали этой реакции изучены не слишком хорошо, но основным событием в ней, по-видимому, является связывания фактора XII с чужеродной поверхностью, которое ведет к его аутоактивации. В ней задействованы еще два белка, которые также принято относить к контактной системе свертывания, — калликре-ин и высокомолекулярный кининоген. Активированный фактор XII дальше активирует фактор XI, запуская каскад свертывания.
Открытие факторов и механизмов запуска контактного пути в середине XX в.64 вызвало недоумение в среде исследователей. Пациенты с дефицитом контактных факторов (которые относятся к категории редчайших) совершенно не страдали от кровотечений.64 Кроме того, в организме так и не удалось выявить достаточно специфический и мощный активатор контактного пути. Логичным заключением было то, что этот путь не играет никакой роли в физиологическом свертывании крови и может быть существенным только in vitro, а также при использовании имплантируемых приборов или экстракорпорального кровообращения. В результате интерес к контактному пути был в значительной степени утерян, хотя некоторые исследователи предполагали, что он мог играть важную роль в других физиологических системах.65
В последние годы ситуация с контактным путем была серьезно пересмотрена благодаря активному внедрению новых экспериментальных моделей гемостаза и тромбоза, основанных на изучении свертывания in vivo у мышей, у которых проведено нокаутирование определенных генов.66 В 2006 г. группа исследователей из Германии создала линию мышей с дефицитом фактора XII67 и провела на них серию исследований, используя модели артериального ранения и острого артериального тромбоза.67,68 В полном соответствии с клиническими данными 50-летней давности они не обнаружили никакой разницы в уровне кровотечений между нормальными и дефицитными мышами.67,68 Однако степень артериальных окклюзий у дефицитных мышей была драматически понижена.68 Это позволило авторам предположить, что контактная активация играет колоссальную роль в тромбозе и что фактор XIIa может быть идеальной мишенью для анти-
263
М. А. Пантелеев и др.
тромботической терапии: его ингибирование будет подавлять тромбоз, абсолютно не влияя на гемостаз.69 В настоящее время это предположение стало предметом активного изучения и исследования.70,71 Несмотря на то что фактор XII не играет явной роли в гемостазе, прежние соображения о важности контактной системы для других задач (например, иммунной реакции организма) по-прежнему остаются справедливыми и тщательное изучение данного вопроса необходимо для реализации ингибирования фактора XIIa в клинической практике.
Интересно отметить, что данный прорыв целиком и полностью связан с использованием новых экспериментальных моделей. Доказать важность контактной активации в тромбозе, используя модели in vitro, было невозможно: любой известный материал вызывал контактную активацию, и потому любой эффект мог оказаться ложным результатом — артефактом. Исследования свертывания на мышах in vivo проводились давно, но опять-таки попытки «выключить» контактный путь in vivo без использования генетических методов не дают гарантии: любой ингибитор контактного пути
имеет неспецифическую активность против других ферментов. И только использование технологий нокаутирования в сочетании с экспериментами in vivo смогло дать достаточно убедительные доказательства в пользу гипотезы о роли контактной активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Список актуальных практических проблем свертывания крови не исчерпывается несколькими направлениями, составившими основу этого обзора. Тем не менее эти несколько важных и интересных вопросов, касающихся разных разделов свертывания, позволяют составить некоторое представление о процессах и изменениях в этой области в настоящий момент. Можно видеть, что, несмотря на остающиеся проблемы, знание и понимание процессов, происходящих при свертывании крови, сейчас достигли значительной величины, способной привести к качественным улучшениям в терапии нарушений свертывания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека. Т. 2. — М.: Мир, 1996.
2. Бутенас С., Манн К. Г. Свертывание крови. Биохимия 2002; 67(1): 5-15.
3. Schenone M., Furie B. C., Furie B. The blood coagulation cascade. Curr. Opin. Hematol. 2004; 11(4): 272-7.
4. Chakrabarti R., Das S. K. Advances in antithrombotic agents. Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 2007; 5(3): 175-85.
5. Brodsky S. V. Coagulation, fibrinolysis and angiogenesis: new insights from knockout mice. Exp. Nephrol. 2002; 10(5-6): 299-306.
6. Davidson C. J., Tuddenham E. G., McVey J. H. 450 million years of hemostasis. J. Thromb. Hae-most. 2003; 1(7): 1487-94.
7. Hoffman M., Monroe D. M. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 2007; 21(1): 1-11.
8. Panteleev M. A., Ovanesov M. V., Kireev D. A. et al. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein C pathways, respectively. Biophys. J. 2006; 90(5): 1489-500.
9. HednerU.,KisielW. Use of human factor Vila in the treatment of two hemophilia A patients with high-titer inhibitors. J. Clin. Invest. 1983; 71(6): 1836-41.
10. RobertsH. R. Recombinant factor Vila: a general hemostatic agent? Yes. J. Thromb. Haemost. 2004; 2(10): 1691-4.
11. HednerU. Recombinant factor Vila (NovoSev-en) as a hemostatic agent. Dis. Mon. 2003; 49(1): 39-48.
12. Waxman E., Ross J. B., Laue T. M. et al. Tissue factor and its extracellular soluble domain: the relationship between intermolecular association with factor Viia and enzymatic activity of the complex. Biochemistry 1992; 31(16): 3998-4003.
13. Komiyama Y., Pedersen A. H., Kisiel W. Proteolytic activation of human factors IX and X by recombinant human factor Viia: effects of calcium, phospholipids, and tissue factor. Biochemistry 1990; 29(40): 9418-25.
14. Hoffman M., Monroe D. M., Roberts H. R. Human monocytes support factor X activation by factor Viia, independent of tissue factor: implications for the therapeutic mechanism of high-dose factor Viia in hemophilia. Blood 1994; 83(1): 38-42.
15. Monroe D. M., Hoffman M., Oliver J. A., Roberts H. R. Platelet activity of high-dose factor Viia is independent of tissue factor. Br. J. Haematol. 1997; 99(3): 542-7.
16. van’t Veer C., Golden N. J., Mann K. G. Inhibition of thrombin generation by the zymogen factor
VII: implications for the treatment of hemophilia A by factor Vila. Blood 2000; 95(4): 1330-5.
17. van’t Veer C., MannK. G. The regulation of the factor Vii-dependent coagulation pathway: rationale for the effectiveness of recombinant factor Viia in refractory bleeding disorders. Semin. Thromb. He-most. 2000; 26(4): 367-72.
18. Butenas S., BrummelK. E., Branda R. F. et al. Mechanism of factor Viia-dependent coagulation in hemophilia blood. Blood 2002; 99(3): 923-30.
19. Butenas S., Brummel K. E., Bouchard B. A., Mann K. G. How factor Viia works in hemophilia. J. Thromb. Haemost. 2003; 1(6): 1158-60.
20. Gabriel D. A., Li X., Monroe D. M. III, Roberts H. R. Recombinant human factor Vila (rFVIIa) can activate factor FIX on activated platelets. J. Thromb. Haemost. 2004; 2(10): 1816-22.
21. Monroe D. M., Roberts H. R. Mechanism of action of high-dose factor VIIa: points of agreement and disagreement. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003; 23(1): 8-9.
22. Allen G. A., Hoffman M., Roberts H. R., Monroe D. M. Manipulation of prothrombin concentration improves response to high-dose factor VIIa in a cell-based model of haemophilia. Br. J. Haematol. 2006; 134(3): 314-9.
23. Kjalke M., Kjellev S., Rojkjaer R. Preferential localization of recombinant factor VIIa to platelets activated with a combination of thrombin and a glycoprotein VI receptor agonist. J. Thromb. Haemost. 2007; 5(4): 774-80.
24. Butenas S., Brummel K. E., Paradis S. G., MannK. G. Influence of factor Vila and phospholipids on coagulation in “acquired” hemophilia. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003; 23(1): 123-9.
25. Ovanesov M. V., Panteleev M. A., Sinau-ridze E. I. et al. Mechanisms of action of recombinant activated factor VII in the context of tissue factor concentration and distribution. Blood Coagul. Fibrinolysis 2008; in press.
26. Phillips G. R. III, Kauder D. R., Schwab C. W. Massive blood loss in trauma patients. The benefits and dangers of transfusion therapy. Postgrad. Med. 1994; 95(4): 61-72.
27. Flordal P. A., Svensson J., Ljungstrom K. G. Effects of desmopressin and dextran on coagulation and fibrinolysis in healthy volunteers. Thromb. Res. 1991; 62(5): 355-64.
28. Strauss R. G., Stump D. C., Henriksen R. A., Saunders R. Effects of hydroxyethyl starch on fibrinogen, fibrin clot formation, and fibrinolysis. Transfusion 1985; 25(3): 230-4.
29. Strauss R. G., PennellB. J., Stump D. C. A randomized, blinded trial comparing the hemostatic effects of pentastarch versus hetastarch. Transfusion 2002; 42(1): 27-36.
30. Brodin B., Hesselvik F., von Schenck H. Decrease of plasma fibronectin concentration following infusion of a gelatin-based plasma substitute in man. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1984; 44(6): 529-33.
31. Mardel S. N., Saunders F. M., Allen H. et al. Reduced quality of clot formation with gelatin-based plasma substitutes. Br. J. Anaesth. 1998; 80(2): 204-7.
32. Буланов А. Ю., Шулутко Е. М., Синаурид-зе Е. И. и др. Гемодилюция и гемодилюционная коагулопатия. Тер. арх. 2006; (7): 90-4.
33. Hardy J. F., De M. P., Samama M. Massive transfusion and coagulopathy: pathophysiology and implications for clinical management. Can. J. Anaesth. 2004; 51(4): 293-310.
34. Ciavarella D., Reed R. L., Counts R. B. et al. Clotting factor levels and the risk of diffuse microvascular bleeding in the massively transfused patient. Br. J. Haematol. 1987; 67(3): 365-8.
35. Hewson J. R., Neame P. B., Kumar N. et al. Coagulopathy related to dilution and hypotension during massive transfusion. Crit. Care Med. 1985; 13(5): 387-91.
36. Janvrin S. B., Davies G., Greenhalgh R. M. Postoperative deep vein thrombosis caused by intravenous fluids during surgery. Br. J. Surg. 1980; 67(10): 690-3.
37. Tuman K. J., Spiess B. D., McCarthy R. J., Ivankovich A. D. Effects of progressive blood loss on coagulation as measured by thrombelastogra-phy. Anesth. Analg. 1987; 66(9): 856-63.
38. Ng K. F., Lo J. W. The development of hypercoagulability state, as measured by thrombelastog-raphy, associated with intraoperative surgical blood loss. Anaesth. Intensive Care 1996; 24(1): 20-5.
39. Nielsen V. G. Colloids decrease clot propagation and strength: role of factor XIII-fibrin polymer and thrombin-fibrinogen interactions. Acta Anaes-thesiol. Scand. 2005; 49(8): 1163-71.
40. Brummel-Ziedins K., Whelihan M. F., Zie-dins E. G., Mann K. G. The resuscitative fluid you choose may potentiate bleeding. J. Trauma 2006; 61(6): 1350-8.
41. Tocantins L. M., Carroll R. T., Holburn R. H. The clot accelerating effect of dilution on blood and plasma. Relation to the mechanism of coagulation of normal and hemophilic blood. Blood 1951; 6(8): 720-39.
42. Ruttmann T. G., James M. F., Viljoen J. F. Hae-modilution induces a hypercoagulable state. Br. J. Anaesth. 1996; 76(3): 412-4.
43. Ruttmann T. G., James M. F., Finlayson J. Effects on coagulation of intravenous crystalloid or colloid in patients undergoing peripheral vascular surgery. Br. J. Anaesth. 2002; 89(2): 226-30.
44. Ruttmann T. G., Jamest M. F., Lombard E. H. Haemodilution-induced enhancement of coagula-
264
Клиническая онкогематология
Ф
Свертывание крови
tion is attenuated in vitro by restoring antithrombin III to pre-dilution concentrations. Anaesth. Intensive Care 2001; 29(5): 489-93.
45. Nielsen V. G., Lyerly R. T. III, Gurley W. Q. The effect of dilution on plasma coagulation kinetics determined by thrombelastography is dependent on antithrombin activity and mode of activation. Anesth. Analg. 2004; 99(6): 1587-92.
46. McCammon A. T., Wright J. P., Figueroa M., Nielsen V. G. Hemodilution with albumin, but not Hextend, results in hypercoagulability as assessed by Thrombelastography in rabbits: role of heparin-dependent serpins and factor VIII complex. Anesth. Analg. 2002; 95(4): 844-50.
47. Nielsen V. G., BairdM. S. Extreme hemodilution in rabbits: an in vitro and in vivo Thrombelastographic analysis. Anesth. Analg. 2000; 90(3): 541-5.
48. Asskali F., Lehmann G., Forster H. Throm-belastographic coagulation analysis following in vitro and in vivo haemodilution with hydroxyethyl starch (HES) [In German Anasthesiol Intensivmed Notfallmed Schmerzther] 2002; 37(5): 258-66.
49. Srivastava A. R., Banerjee A., Misra B. B. et al. Does hemodilution by the crystalloid priming solution derange the efficacy of anticoagulation during cardiopulmonary bypass? J. Card. Surg. 2008; 23(3): 239-45.
50. Konrad C. J., Markl T. J., Schuepfer G. K. et al. In vitro effects of different medium molecular hydroxyethyl starch solutions and lactated Ringer’s solution on coagulation using SONOCLOT. Anesth. Analg. 2000; 90(2): 274-9.
51. HemkerH. C., Beguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb. Haemost. 2000; 84(5): 747-51.
52. Hemker H. C., Al Dieri R., Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr. Opin. Hematol. 2004; 11(3): 170-5.
53. Hemker H. C., Al Dieri R., De Smedt E., Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb. Haemost.
2006; 96(5): 553-61.
54. Hemker H. C., Giesen P. L., Ramjee M. et al. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb. Haemost. 2000; 83(4): 589-91.
55. Hemker H. C., Giesen P., AlDieri R. et al. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Patho-physiol. Haemost. Thromb. 2002; 32(5-6): 249-53.
56. OvanesovM. V.,KrasotkinaJ. V., Ul’yanovaL.I. et al. Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572(1): 45-57.
57. Ovanesov M. V., Lopatina E. G., Saenko E. L. et al. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb. Haemost. 2003; 89(2): 235-42.
58. Синауридзе Е. И., Горбатенко А. С., Грибкова И. В. и др. Гиперкоагуляция, вызываемая разбавлением плазмы искусственными плазмозамещающими растворами. Технологии живых систем 2008; 5(1): 3-14.
59. SinauridzeE. I., Bulanov A. Y. Hemodilution causes hypercoagulability. J. Thromb. Haemost. 2007; 5(Suppl. 2): PW 463.
60. Sinauridze E. I., Gorbatenko A. S., Bulanov A. Y. et al. Plasma dilution by standard plasma expanders produces hypercoagulation. Proceedings of the workshop “Modeling of Blood Diseases”, November 5-8, 2007. — Lyon, 2007. — Р. 20.
61. Синауридзе Е. И., Буланов А. Ю., Щербакова О. В. и др. Усиление коагуляции, вызываемое переливанием искусственных плазмозамещающих растворов. Тер. арх. 2008; в печати.
62. Синауридзе Е. И., Горбатенко А. С., Ажи-гирова М. А. и др. Раствор для коррекции первичных нарушений гемостаза плазмозамещающими растворами нового состава. Патент РФ № 2300385 от 27 декабря 2005 г.
63. Пантелеев М. А., Атауллаханов Ф. И. Свертывание крови: биохимические основы. Клин. онкогематол. 2008; 1(1): 50-62.
64. Owen C. A. A History of Blood Coagulation. — Rochester: Mayo Foundation, 2001.
65. ColmanR. W., SchmaierA. H. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90: 3819-43.
66. Colman R. W. Are hemostasis and thrombosis two sides of the same coin? J. Exp. Med. 2006; 203(3): 493-5.
67. Pauer H. U., Renne T., Hemmerlein B. et al. Targeted deletion of murine coagulation factor XII gene-a model for contact phase activation in vivo. Thromb. Haemost. 2004; 92(3): 503-8.
68. Renne T., NieswandtB., GailaniD. The intrinsic pathway of coagulation is essential for thrombus stability in mice. Blood Cells Mol. Dis. 2006; 36(2): 148-51.
69. Kleinschnitz C., Stoll G., Bendszus M. et al. Targeting coagulation factor XII provides protection from pathological thrombosis in cerebral ischemia without interfering with hemostasis. J. Exp. Med.
2006; 203(3): 513-8.
70. Schousboe I. Pharmacological regulation of factor XII activation may be a new target to control pathological coagulation. Biochem. Pharmacol.
2008; 75(5): 1007-13.
71. Gailani D., Renne T. Intrinsic pathway of coagulation and arterial thrombosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27(12): 2507-13.
AT
Благодарности
Мы хотели бы выразить глубокую благодарность М. А. Волковой за приглашение написать эту серию обзоров, чтение руко писи и важную критику. Работа авторов поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04 48426, 07-04-00146 и 08-04-12060, а также грантом Федерального агентства по науке и инновациям МК-340.2008.4.
www.medprint.ru
265
Ф
