CC BY
66
4. Ischenko, O. Yu. Vliyanie skarmlivaniya hromsoderzhaschih kormovyh dobavok s ispol'zovaniem fermenta Roksazim G2 G molodnyaku kur na ih rost i obmen veschestv [Tekst]/ T. A. Krasnoschekova, V. C. Nimaeva, O. Yu. Ischenko // Molodezh' XXI veka: shag v buduschee: materi-aly XV regional'noj nauchno-prakticheskoj konferencii (22 maya 2014 g., Blagoveschensk). - Blago-veschensk: Tipografiya AmGU, 2014. - T.6. - Р. 85-86.
5. Ispol'zovanie sapropelej i laminarii yaponskoj v kormlenii zhivotnyh i pticy [Tekst]/ A.C. Prostokishin, V. A. Ryzhkov, E. V. Tuaeva, K.P. Babuhadiya, Yu. B. Kurkov, O. Yu. Ischenko // Zootehniya. - 2014. - № 3. - Р. 21-22.
6. Kravchenko, N. Jeffektivnye fermenty dlya pticevodstva [Tekst]/ N. Kravchenko, M. Mon-in // Pticevodstvo. - 2006. - № 4. - Р. 26-27.
7. Novyj istochnik fosfora v kombikormah dlya kur-nesushek [Tekst]/ I. Egorov, V. Maeuky-an, G. Ignatova, A. Ermakov, V. Oblov, N. Derbukovich // Pticevodstvo. - 2012. - №2. - S. 29-31.
8. Nesterov, V. D. Ispol'zovanie novoj mineral'noj dobavki FAKS-2 [Tekst]/ V. D. Nesterov, A. N. Dobud'ko, I. A. Bojko // Zootehniya. - 2012. - №8. - Р. 20-21.
9. Osnovy tehnologii proizvodstva i pervichnoj obrabotki produkcii zhivotnovodstva [Tekst] / L. Yu. Kiselev, Yu. I. Zabudskij, A. P. Golikova, N. A. Fedoseeva. - SPb. : Lan', 2012. - 448 р.
10. Okolelova, T. O problemah mineral'nogo pitaniya sovremennyh vysokoproduktivnyh krossov kur [Tekst]/ T. Okolelova, N. O. Markelova // Pticevodstvo. - 2012. - № 4. - Р. 26-28.
11. Timofeeva, Je. Mikrojelementy v kormlenii kur nesushek [Tekst] / Je. Timofeeva //Pticevodstvo. - 2012. - №1. - Р. 25-28.
12. Jeffektivnost' kompleksnogo primeneniya preparatov joda, selena i laktoamilovarina pri vyraschivanii cyplyat-brojlerov [Tekst]/ V. N. Nikulin, V. V. Gerasimenko, T. V. Kotkova, E. A. Nazarova, S. N. Abdullina // Zootehniya. - 2012. - №3. - Р. 17.
E-mail: nikolaevvolgau@ya.ru
УДК 636.085:543.632.518
СУЩЕСТВУЮЩИЕ ПРОБЛЕМЫ И ПУТИ ИХ РЕШЕНИЯ ПРИ АНАЛИЗЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ПРОДУКТА
EXISTING PROBLEMS AND WAYS OF THEIR SOLUTION IN THE ANALYSIS OF AMINO ACID COMPOSITION
1 2
А.П. Санжеев ' , аспирант С.И. Николаев1, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Е.В. Корнилова2, кандидат сельскохозяйственных наук, эксперт в области качества кормов и продукции животного происхождения
А.А. Михина3,4, Д.А. Севко3
A. P. Sanjeev1, S.I. Nikolaev1, E. V. Kornilova2, A. A. Mikhina3,4, D. A. Sevko3
1Волгоградский государственный аграрный университет 2 ООО «Научно-испытательный центр кормов и продуктов животного происхождения
Черкизово», г. Москва
3 ФГБОУ ВО «Московский государственный технический университет имени Н.Э. Баумана (национальный исследовательский университет)», г. Москва 4 Научно-производственная компания «Sevko&Co», г. Москва
1 Volgograd State Agrarian University 2 LLC «Scientific and testing center for animal feed and products Cherkizovo», Moscow 3 Moscow state technical University named After N. Uh... Bauman (national research University) 4 Research and production company «Sevko&Co», Moscow
Аминокислоты играют огромную роль в процессах жизнедеятельности живых организмов, являясь структурной единицей белков. Они отвечают за транспорт и хранение питательных веществ, функционирование и восстановление различных тканей, в том числе мышц, костей, волос. В природе обнаружено уже более 700 аминокислот, 21 из них являются протеиногенными, то есть
кодируются генетическим кодом. Проведено сравнение методов анализа аминокислот с пред- и постколоночной дериватизацией на примере определения содержания сульфата лизина. Экспериментально показано преимущество использования постколоночной дериватизации с нингид-рином. Рассмотрены виды пробоподготовки для белковых и пептидных препаратов, на примере валина и треонина, выбран оптимальный. В образцах сульфата лизина было проведено определение содержания указанной аминокислоты в свободной форме. Как заявляет производитель, содержание лизина в продукте должно быть не меньше 55 %. Испытания проводились двумя различными методами анализа: с пред- и постколоночной дериватизацией. Проведено сравнение методов анализа аминокислот с пред- и постколоночной дериватизацией на примере определения содержания сульфата лизина. Экспериментально показано преимущество использования постколоночной дериватизации с нингидрином. Рассмотрены виды пробоподготовки для белковых и пептидных препаратов на примере валина и треонина. Показано, что для дальнейшего определения аминокислот важным является выбранный подход для доведения рН до 2,2 и оптимальным является добавление щелочи (вместо использования выпаривания и перерастворения).
Amino acids play a huge role in the processes of vital activity of living organisms, being a structural unit of proteins. They are responsible for the transport and storage of nutrients, functioning and recovery of various tissues, including muscles, bones, hair. In nature, more than 700 amino acids have been found, 21 of them are proteinogenic, that is, they are encoded by a genetic code. The methods of amino acid analysis are compared with pre - and post-column derivatization on the example of determining the content of lysine sulfate. It is shown experimentally the advantage of using post column derivatization with ninhydrin. The types of sample preparation for protein and peptide preparations, on the example of valine and threonine, the optimal one are considered. In the samples of lysine sulfate was carried out to determine the content of the amino acid in free form. According to the manufacturer, the content of lysine in the product should be at least 55%. The tests were carried out by two different methods of analysis: pre - and post-column derivatization. The methods of amino acid analysis are compared with pre - and post-column derivatization on the example of determining the content of lysine sulfate. It is shown experimentally the advantage of using post column derivatization with ninhydrin. Types of sample preparation for protein and peptide preparations, on the example of valine and threonine are considered. It is shown that for the further determination of amino acids, the chosen approach for bringing pH to 2.2 is important and the optimal one is the addition of alkali (instead of using evaporation and overgrowth).
Ключевые слова: аминокислоты, высокоэффективная жидкостная хроматография, ионообменная хроматография, капиллярный электрофорез, аминокислотный анализ, кислотный гидролиз.
Key words: amino acids, high-performance liquid chromatography, ion exchange chromatography, capillary electrophoresis, amino acid analysis, acid hydrolysis.
Введение. Аминокислоты играют огромную роль в процессах жизнедеятельности живых организмов, являясь структурной единицей белков. Они отвечают за транспорт и хранение питательных веществ, функционирование и восстановление различных тканей, в том числе мышц, костей, волос. В природе обнаружено уже более 700 аминокислот, 21 из них являются протеиногенными, то есть кодируются генетическим кодом.
Анализ аминокислот важен для различных областей: пищевой промышленности, производства лекарств, клинических анализов и т.д. Среди большого числа разработанных подходов (тонкослойная, ионообменная, газовая хроматография) наиболее чувствительными являются методики, основанные на хроматографическом разделении це-
левых аналитов с использованием различных видов дериватизации: пред- и постколоночной. Использование дериватизирующих агентов позволяет решить основные виды проблем, возникающие при их хроматографическом разделении:
- высокая полярность молекул аминокислот за счет наличия карбоксильной и аминогрупп не позволяет разделить их хроматографически без использования ионообменных неподвижных фаз;
- низкие коэффициенты поглощения аминокислот в ультрафиолетовой области [1, 8] затрудняют их детектирование и не позволяют достичь низких пределов обнаружения.
При предколоночной дериватизации используют ортофталевый ангидрид (рисунок 1), а дериватизаты после ВЭЖХ-разделения детектируют с использованием УФ-детектора. Недостатком этого метода является наблюдаемое в ряде случаев разложение дериватизатов до завершения анализа.
а гно
4 Н5-СН3~СН^-ОН + К^-И -*
2 -мер капгоэтано л амино-группа
фгапевый ангидрид СНа-СН8-ОН
5
Рисунок 1 - Реакция фталевого ангидрида с аминогруппой аминокислот
При постколоночной дериватизации в качестве реагента используют нингидрин (рисунок 2), позволяющий получить стабильные дериватизаты после разделения аминокислот на ионообменной колонке. Дериватизаты при этом детектируются спектрофотометр ически.
Рисунок 2 - Реакция нингидрина с аминогруппой аминокислот
Для анализа аминокислотного состава белковых и пептидных препаратов важным является выбор пробоподготовки, так как сначала необходимо провести исчерпывающий гидролиз этих полимеров до отдельных аминокислот и учесть при этом все возможные потери.
Стандартная процедура разложения белка до аминокислот - кислотный гидролиз (6М раствор соляной кислоты при температуре 110 0С [1-6]) - позволяет в дальнейшем определить все аминокислоты, кроме серосодержащих (цистеин и метионин).
Серосодержащие аминокислоты при кислотном гидролизе частично разлагаются, поэтому для точного определения их количества в пробе необходимо предварительно перевести их в стабильные соединения (рисунок 3) - цистеиновую кислоту и метио-нинсульфон, соответственно. Для этого проводят окисление указанных аминокислот путем охлаждения (0 - 5 0С) с надмуравьиной кислотой в течение 18 часов. Далее уже можно проводить кислотный гидролиз и количественное определение цистеиновой кислоты и метионинсульфона с последующим пересчетом на исходные аминокислоты [1, 2, 5, 6, 10].
.ОН
н,с—Б—сн — сн—сн—с С.
■■—О
/ОН
Н,С S СН0 CHÔ—сн—с
\ -^0
о nh
2
NH2 -te и он
о
H3C-S—сн—сн—сн—с
2 "2
о
о nh2
Рисунок 3 - Реакция окисления метионина
Отдельно отметим, что при кислотном гидролизе триптофан полностью разлагается, поэтому для его определения используют щелочной гидролиз (гидроксид бария, 110 0С, 20 часов) [7, 9].
Материалы и методы. Целью нашей работы было сравнение методов с пред- и постколоночной дериватизацией на примере анализа образца сульфата лизина. Метод, который покажет наилучшую точность, будет в дальнейшем использован для отработки методов пробоподготовки образцов белков и пептидов на содержание валина и треонина. Реактивы и материалы: соляная кислота (ХИММЕД, ХЧ), гидроксид натрия (ВЕК-ТОН, ХЧ), гидроксид бария 8-водный (AppliChem Panreac, pure), дисульфит натрия (AppliChem Panreac, USP-NF, BP, Ph. Eur., pure, pharma grade), муравьиная кислота (ЗАО «База №1 Химреактивов», 85 %-ная), перекись водорода (ХИММЕД, 37 %, мед), ортофосфорная кислота («КОМПОНЕНТ-РЕАКТИВ, особо чистая 12-3), набор буферов для аминокислотного анализа методом ВЭЖХ («Sevko&Co»), орто-фталевый ангидрид (sigma aldrich, ACS reagent). Оборудование: анализатор аминокислотный HITACHI L-8900 (Япония), анализатор аминокислотный Sykam S 433 (Германия), хроматограф жидкостной 1290 Infinity II LC (Agilent Technologies, Германия), весы неавтоматического действия Mettler Toledo XPE 204 (Швейцария), электропечь сопротивления низкотемпературная лабораторная SNOL 67/350 (Литва).
Результаты и обсуждение. В образцах сульфата лизина было проведено определение содержания указанной аминокислоты в свободной форме. Как заявляет производитель, содержание лизина в продукте должно быть не меньше 55 %. Испытания проводились двумя различными методами анализа: с пред- и постколоночной дерива-тизацией, результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Результаты анализа сульфата лизина
Содержание лизина, %
Название, номер пробы Дериватизация Европейская аккредитованная лаборатория [10] о я
Предколо-ночная [9] А от независимого определения Постколоночная [8] А от независимого определения <ц « « S со
Сульфат лизина № 1 42,5 16,3 56,1 2,8 58,8 > 55
Сульфат лизина № 2 49,8 6,4 54,9 1,3 56,2 > 55
Сульфат лизина № 3 50,9 7,0 58,3 0,4 57,9 > 55
Экспериментально показано, что при постколоночной дериватизации результаты согласуются с теми, что измерены в независимой Европейской аккредитованной лаборатории. Таким образом, этот метод был выбран для дальнейшей работы.
Для определения оптимальной пробоподготовки образцов белков и пептидов на ва-лин и треонин в качестве первой стадии был выбран кислотный гидролиз, т.к. целевые аналиты не являются серосодержащими и также не требуется определения триптофана.
После процесса кислотного гидролиза перед анализом рН в образце необходимо довести до 2.20. Для этого возможно использование двух подходов:
- полностью выпарить соляную кислоту и перерастворить образец в буфере с соответствующим рН;
- довести рН в образце после гидролиза до нужного значения путем добавления щелочи.
Экспериментально было установлено, что при использовании первого подхода гидрофобные аминокислоты (например, валин) не полностью перерастворяются после упаривания, и итоговые результаты анализа получаются заниженными (таблица 2). Предположительно, это связано с частичным «запеканием» целевых аналитов с углеводами.
Второй же подход, несмотря на большой расход дополнительного реактива (0,3 г щелочи на 1 пробу), дает более точные результаты.
Таблица 2 - Сравнение результатов разных способов пробоподготовки
Аминокислота в пробе Содержание аминокислот, % Европейская аккредитованная лаборатория [10]
Метод перерастворения А от независимого определения Метод добавки щелочи А от независимого определения
Валин 0,64 0,33 0,96 0,01 0,97
Треонин 0,79 0,05 0,84 0 0,84
Заключение. Проведено сравнение методов анализа аминокислот с пред- и постколоночной дериватизацией на примере определения содержания сульфата лизина. Экспериментально показано преимущество использования постколоночной деривати-зации с нингидрином.
Рассмотрены виды пробоподготовки для белковых и пептидных препаратов, на примере валина и треонина. Показано, что для дальнейшего определения аминокислот важным является выбранный подход для доведения рН до 2.2 и оптимальным является добавление щелочи (вместо использование выпаривания и перерастворения).
Библиографический список
1. Аминокислоты, пептиды, белки [Текст]/ Х.-Д. Якубе, Х. Ешкайт и др. - М.: Мир, 1985. - 444 с.
2. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии [Текст]/ А. Хеншен, К-П. Хупе, Ф. Лотшпайх, В. Вельтер. - Federal Republic of Germany, 1988. - 688 с.
3. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения лизина и триптофана ГОСТ 13496.21-2015 [Текст].
4. Корма, премиксы. Определение содержания лизина, метионина и треонина ГОСТ 33428-2015 [Текст].
5. Панышев, А. И. Влияние гидробаротермической обработки на углеводный состав концентратов [Текст] / А. И. Панышев, В. А. Ситников, С. Ю. Николаев //Аграрный вестник Урала. - 2012. - №. 9 (101). - С. 29-32.
6. Analysis of Amino Acids by HPLC, Agilent Technologies, Inc., REG (EC) 152/2009
7. Determination of amino acids in biomass and protein samples by microwave hydrolysis and ion-exchange chromatography, Lars Joergensen*, Helle N. Thestrup, 1995
8. Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins, Michael Fountoulakis, HansWerner Lahm, 1998
9. Hydrolysis of proteins performed at high temperatures and for short times with reduced rac-emization, in order to determine the enantiomers of D- and L-amino acids, J. Csap, Zs. Kiss-Csap, Cs. Albert, K. Loki, 2008
10. Soshnikova O. V. et al. The investigations of the chemical composition of Amaranthus ret-roflexus L //IP Pavlov Russian Medical Biological Herald. - 2010. - Т. 18. - №. 2. - С. 135-141.
Reference
1. Aminokisloty, peptidy, belki [Tekst]/ H.-D. Yakube, H. Eshkajt i dr. - M.: Mir, 1985. - 444 р.
2. Vysokojeffektivnaya zhidkostnaya hromatografiya v biohimii [Tekst]/ A. Hen-shen, K.-P. Hupe, F. Lotshpajh, V. Vel'ter. - Federal Republic of Germany, 1988. - 688 р.
3. Korma, kombikorma, kombikormovoe syr'e. Metody opredeleniya lizina i triptofana GOST 13496.21-2015 [Tekst].
4. Korma, premiksy. Opredelenie soderzhaniya lizina, metionina i treonina GOST 33428-2015
[Tekst].
5. Panyshev, A. I. Vliyanie gidrobarotermicheskoj obrabotki na uglevodnyj sostav koncentra-tov [Tekst] / A. I. Panyshev, V. A. Sitnikov, S. Yu. Nikolaev //Agrarnyj vestnik Urala. - 2012. - №. 9 (101). - Р. 29-32.
6. Analysis of Amino Acids by HPLC, Agilent Technologies, Inc., REG (EC) 152/2009
7. Determination of amino acids in biomass and protein samples by microwave hydrolysis and ion-exchange chromatography, Lars Joergensen*, Helle N. Thestrup, 1995
8. Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins, Michael Fountoulakis, HansWerner Lahm, 1998
9. Hydrolysis of proteins performed at high temperatures and for short times with reduced rac-emization, in order to determine the enantiomers of D- and L-amino acids, J. Csap, Zs. Kiss-Csap, Cs. Albert, K. Loki, 2008
10. Soshnikova O. V. et al. The investigations of the chemical composition of Am-aranthus retroflexus L //IP Pavlov Russian Medical Biological Herald. - 2010. - Т. 18. - №. 2. - С. 135-141.
E-mail: nikolaevvolgau@ya.ru
