Научная статья на тему 'Сульфоксиды - аналоги L-метионина и L-цистеина как пролекарства против грамположительных и грамотрицательных бактерий'

Сульфоксиды - аналоги L-метионина и L-цистеина как пролекарства против грамположительных и грамотрицательных бактерий Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
660
110
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Acta Naturae (русскоязычная версия)
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
PubMed

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Ануфриева Н.В., Морозова Е.А., Куликова В.В., Бажулина Н.П., Манухов И.В.

Проблема резистентности бактерий к антибиотикам требует разработки новых классов антимикробных препаратов широкого спектра действия. Концепция пролекарств позволяет искать новые подходы к получению эффективных препаратов с улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами. Известно, что антимикробной активностью обладают тиосульфинаты, образующиеся ферментативно из сульфоксидов аминокислот при разрушении клеток растений рода Allium. Неустойчивость и высокая реакционная способность тиосульфинатов затрудняют их использование как индивидуальных соединений. Предложена фармакологически комплементарная пара: пролекарство сульфоксид аминокислоты и витамин В6-зависимая метионин-γ-лиаза (МГЛ), метаболизирующая его в организме пациента. Фермент катализирует реакции γи β-элиминирования сульфоксидов аналогов L-метионина и L-цистеина с образованием тиосульфинатов. Нами клонирован ген МГЛ из Clostridium sporogenes. Методом логнормального разложения спектра холофермента установлены ионные и таутомерные формы внутреннего альдимина МГЛ, получены каталитические параметры рекомбинантного фермента в реакциях γи β-элиминирования аминокислот и ряда сульфоксидов. Установлена возможность использования витамин В6-зависимой МГЛ для эффективной конверсии сульфоксидов, выявлена антимикробная активность тиосульфинатов в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий in situ.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Ануфриева Н.В., Морозова Е.А., Куликова В.В., Бажулина Н.П., Манухов И.В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Сульфоксиды - аналоги L-метионина и L-цистеина как пролекарства против грамположительных и грамотрицательных бактерий»

УДК 577.152.41

Сульфоксиды - аналоги L-метионина и L-цистеина как пролекарства против грамположительных и грамотрицательных бактерий

Н. В. Ануфриева1, Е. А. Морозова1, В. В. Куликова1, Н. П. Бажулина1, И. В. Манухов2, Д. И. Дёгтев2, Е. Ю. Гнучих2, А. Н. Родионов1, Г. Б. Завильгельский2, Т. В. Демидкина1* 1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32

■Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1 *E-mail: tvd@eimb.ru, tvdemidkina@yandex.ru Поступила в редакцию 31.08.2015

РЕФЕРАТ Проблема резистентности бактерий к антибиотикам требует разработки новых классов антимикробных препаратов широкого спектра действия. Концепция пролекарств позволяет искать новые подходы к получению эффективных препаратов с улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами. Известно, что антимикробной активностью обладают тиосульфинаты, образующиеся фермен-тативно из сульфоксидов аминокислот при разрушении клеток растений рода Allium. Неустойчивость и высокая реакционная способность тиосульфинатов затрудняют их использование как индивидуальных соединений. Предложена фармакологически комплементарная пара: пролекарство - сульфоксид аминокислоты и витамин В6-зависимая метионин-у-лиаза (МГЛ), метаболизирующая его в организме пациента. Фермент катализирует реакции у- и ß-элиминирования сульфоксидов - аналогов L-метионина и L-цистеина с образованием тиосульфинатов. Нами клонирован ген МГЛ из Clostridium sporogenes. Методом логнормального разложения спектра холофермента установлены ионные и таутомерные формы внутреннего альдимина МГЛ, получены каталитические параметры рекомбинантного фермента в реакциях у- и ß-элиминирования аминокислот и ряда сульфоксидов. Установлена возможность использования витамин В6-зависимой МГЛ для эффективной конверсии сульфоксидов, выявлена антимикробная активность тиосульфинатов в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий in situ.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА пролекарства, витамин В6-зависимые ферменты, клонирование гена метионин-у-лиазы из Clostridium sporogenes, аллиин, аллицин, сульфоксиды аминокислот, грамположительные и грамотрица-тельные бактерии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПЛФ - пиридоксаль-5'-фосфат; МГЛ - метионин-у-лиаза; His-tag - полигистидино-вый фрагмент; His-tag МГЛ - метионин-у-лиаза с полигистидиновым фрагментом; megL - ген, кодирующий МГЛ Clostridium sporogenes; ДТТ - дитиотреитол; NADH - ß-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный; EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема поиска новых антимикробных препаратов с минимальным риском индукции быстрой устойчивости к антибиотикам весьма остро стоит в настоящее время. Многие потенциально эффективные антимикробные средства достаточно быстро деградируют в организме человека и обладают повышенной токсичностью, что затрудняет их применение в концентрации, нужной для терапии. Эту проблему можно решить с помощью концепции пролекарств -препаратов, которые должны подвергнуться метабо-

лизму в организме пациента. Эту концепцию успешно применили в противоопухолевой терапии [1].

В представленной работе предложено использовать этот подход для создания эффективной антимикробной терапии с помощью фармакологической пары: пролекарство и биокатализатор, его метаболи-зирующий. Недавно мы показали, что метионин-у-лиаза (МГЛ) [КФ 4.4.1.11] из Citrobacter freundii катализирует реакцию ß-элиминирования небелковой аминокислоты, (±)-сульфоксида S-(2-пропенил)-L-цистеина ((±)-аллиина), с образованием 2-пропенти-

осульфината (аллицина) - природного антибиотика [2]. МГЛ катализирует реакцию у-элиминирования Ь-метионина с образованием метилмеркаптана, а-кетомасляной кислоты и аммиака. Фермент катализирует реакцию Р-элиминирования Ь-цистеина и его S-замещенных производных с образованием соответствующих меркаптанов, пировиноградной кислоты и аммиака и реакции замещения у Ср- и С^-атомов Ь-цистеина и Ь-метионина и их аналогов [3,

4]:

н2о,

RX—CH2—CH2—CH

,COOH

^RXH

RSH + CH3-CH2-C^ + NH3

3 2 II

O

у-элиминирование

^COOH

RSH + R'X'—CH2-CH2-CH

у-замещение

H20

RX—CH^CH_

■nh2

V

RSH + CH3—C 3 II

O

NH3

ß-элиминирование

,COOH

RSH + R'X'—CH^CH, ß-замещение

'NH2

X = S, O или Se;

X' = S или Se

МГЛ содержится в грибах [5], Arabidopsis thaliana [6], в различных видах бактерий, в том числе в патогенных Aeromonas spp. [7], Clostridium sporogenes [8], Porphyromonas gingivalis [9] и в патогенных простейших Entamoeba histolytica [10] и Trichomonas vaginalis [11]. Фермент отсутствует у млекопитающих, поэтому может рассматриваться как мишень в патогенах. Такой подход применили с использованием суицидального субстрата фермента. Катализ реакции Y-элиминирования трифторметионина приводил к образованию трифтормеркаптана, спонтанно разлагающегося до дифторида тиоугольной кислоты, который обладает антимикробной активностью в отношении содержащих МГЛ T. vaginalis [12], P. gingivalis [13], E. histolytica [14]. Однако высокая токсичность дифтори-да тиоугольной кислоты не позволяет использовать трифторметионин как антимикробное средство.

Аллицин, наиболее известный антимикробный и противоопухолевый компонент чеснока, составляет около 70% от общего количества тиосульфи-натов [15], образующихся в результате реакции ß-элиминирования аллиина, катализируемой ПЛФ-зависимой аллииназой [КФ 4.4.1.4] [16] при разрушении чеснока. Антимикробное действие аллицина и других тиосульфинатов, образующихся фермента-тивно при разрушении клеток растений рода Allium, во многом объясняется тем, что они окисляют суль-

фгидрильные группы белков/ферментов бактериальных клеток, в то время как клетки животных частично защищены присутствующим в них глута-тионом [17]. Противомикробные, противовоспалительные, антиоксидантные и антиканцерогенные эффекты органических сульфосоединений, экстрактов клеток чеснока и лука [18, 19] известны с древнейших времен. Однако отдельные тиосульфинаты не используются в медицине из-за их высокой реакционной способности и, как следствие, неустойчивости. Как индивидуальное биологически активное соединение, наиболее подробно изучен только аллицин, обнаружены его противоопухолевые, антиок-сидантные, антибактериальные и противогрибковые свойства [20-22].

Способность МГЛ катализировать реакции у-и Р-элиминирования сульфоксида метионина [23] и аллиина [2] с образованием тиосульфинатов позволяет применить концепцию пролекарств для разработки нового антимикробного препарата, используя в качестве пролекарств аллиин и другие субстраты-сульфоксиды как источники тиосульфинатов in situ.

Ранее мы клонировали ген (megL) C. sporogenes, кодирующий МГЛ с полигистидиновым фрагментом (His-tag) на N-конце полипептидной цепи, определили некоторые кинетические характеристики рекомбинантного фермента (His-tag МГЛ). МГЛ C. sporogenes катализировала реакцию у-элиминирования L-метионина с большей скоростью, чем фермент из C. freundii [24], и обладала лучшей цитостатической активностью в отношении ряда опухолевых клеток [25].

Скорость расщепления физиологического субстрата C. sporogenes МГЛ возрастала в 1.5 раза после отщепления His-tag тромбином. В данной работе мы клонировали ген МГЛ C. sporogenes без His-tag. Определены стационарные кинетические параметры реакций y- и Р-элиминирования ряда известных субстратов и сульфоксидов - аналогов цистеина и мети-онина и спектральные характеристики C. sporogenes МГЛ. На твердой среде показана антибактериальная активность смесей, содержащих МГЛ из C. spo-rogenes и C. freundii и сульфоксиды аминокислот. Установлено, что кинетические параметры рекомби-нантной ПЛФ-зависимой МГЛ делают принципиально возможным использование фермента в конверсии пролекарств - сульфоксидов аминокислот - в тио-сульфинаты.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы, ферменты

В работе использовали: пиридоксаль-5'-фосфат, L-метионин, L-цистеин, L-гомоцистеин, L-норвалин,

NH

2

2

COOH

COOH

L-норлейцин, L-a-аминомасляную кислоту, ал-лиин, S-этил-L-цистеин, S-этил-L-гомоцистеин, L-аланин, О-ацетил^-серин, лактатдегидрогена-зу из мышцы кролика, ДТТ, NADH, периодат натрия, этилбромид (Sigma, США); EDTA, протамин-сульфат (Serva, США); лактозу (Panreac, Испания); глюкозу, глицерин, сульфат магния, сульфат аммония, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный («Реахим», Россия); дрожжевой экстракт, триптон (Difco, США); DEAE-сефарозу (GE Healthcare, Швеция); О-ацетил^-гомосерин получен ацетилировани-ем L-гомосерина по описанному ранее методу [26]. 2-Нитро-5-тиобензойная кислота получена согласно [27]. (±)-Сульфоксид L-метионина получали по стандартной методике [28]. Синтез (±)-сульфоксидов S-этил-L-цистеина и S-этил-L-гомоцистеина проводили согласно [29-31].

Реакции рестрикции и лигирования проводили с использованием ферментов фирмы Promega (США). В работе использовали «рабочий буфер», рН 8.0, содержащий 100 мМ калий-фосфат, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ и 1 мМ EDТА.

Штамм Escherichia coli BL21(DE3) F- ompT hsdSB gal dcm (DE3) (Novagen) был использован для экспрессии гена C. sporogenes МГЛ. Штамм E. coli K12 AB2463 - recA~ производное штамма E. coli K12, имеет генотип: F-, thr-1 leu-6 proA2 his-4 thi-1 argE3 lacYl galK2 ara-14 xyl-5 mtl-1 tsx-33 rpsL31 supE44, recA13. Его использовали для клонирования, наработки и хранения плазмиды. Штамм C. freundii ATCC 21434 из American Type Culture Collection (США) любезно предоставлен Р.С. Филлипсом. Штамм 015 Staphylococcus aureus любезно предоставлен Ю.Ф. Белым. Плазмида с геном D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназы любезно предоставлена K. Мураторе.

Клонирование гена МГЛ из C. sporogenes Плазмида pET28a-megL_sporog сконструирована на основе плазмиды pET28a, содержащей ген megL C. sporogenes с полигистидиновым фрагментом (His-tag) и обозначена как pET-28a::megL_s_HT [24]. Методом ПЦР получен ампликон (megL_sporog), содержащий ген megL без His-tag. В качестве матрицы использовали плазмиду pET28a, содержащую ген megL с His-tag. В праймерах был предусмотрен сайт рестрикции NcoI (подчеркнут): megL_sporog:5'-CGC-GCGGCAGCCCCATGGAGAA-3' (прямой), megL_ sporog: 5'-CCGGATCTCAGTGGTGGTGGTG-3' (обратный).

Ампликон megL_sporog клонировали в векторе pET28a по сайтам NcoI и EcoRI в recA~ штамме E. coli AB2463. Контроль клонирования осуществляли пу-

тем секвенирования вставки. Трансформацию проводили, используя штамм E. coli BL21(DE3).

Выращивание биомассы и выделение фермента

Клетки E. coli BL21(DE3), содержащие ген МГЛ без His-tag в плазмиде pET28a megL_sporog, выращивали на «индуцирующей» среде [32] при 37°C с перемешиванием (180 об/мин) в течение 24 ч. Клетки собирали центрифугированием и хранили при -80°C. Клетки разрушали и освобождали от нуклеиновых кислот как описано ранее [33]. Далее очистку проводили с использованием ионообменной хроматографии на колонке с DEAE-сефарозой, уравновешенной рабочим буфером. Колонку промывали рабочим буфером, содержащим 100 мМ KCl. Фермент элюи-ровали рабочим буфером, содержащим 500 мМ KCl, концентрировали и диализовали против рабочего буфера. Чистоту препарата проверяли при помощи ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях по методу Лэммли [34]. Концентрацию очищенных препаратов определяли, используя коэффициент А№278 = 0.8 [23].

Определение активности фермента и параметров стационарной кинетики

Активность МГЛ в процессе очистки определяли в реакциях у- и ß-элиминирования, измеряя скорости образования кетокислот в сопряженной реакции с D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназой (реакция у-элиминирования) или лактатдегидро-геназой (реакция ß-элиминирования) по снижению поглощения NADH при 340 нм (е = 6220 М-1см-1) и 30°С. Реакционные смеси содержали рабочий буфер, 0.2 мМ NADH, 10 ед. лактатдегидрогеназы или 70 мкг D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназы, 30 мМ S-этил-Ь-цистеина или 30 мМ L-метионина. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1.0 мкМ/мин пирувата (или а-кетобутирата). Удельная активность препаратов фермента, имеющих 95% чистоты, составила 26.8 ед./мг в реакции у-элиминирования L-метионина и 8.32 ед./мг в реакции ß-элиминирования S-этил-L-цистеина.

Стационарные кинетические параметры реакций у- и ß-элиминирования определяли таким же образом, варьируя концентрации субстратов. Полученные данные обрабатывали согласно уравнению Михаэлиса-Ментен с использованием программы EnzFitter. В расчетах использовали величину молекулярной массы субъединицы фермента, равную 43 кДа. Ингибирование реакции у-элиминирования L-метионина различными аминокислотами изучали в условиях, описанных выше, варьируя концентрацию субстратов и ингибиторов в реакционных смесях.

Значения констант ингибирования определяли с помощью программы EnzFitter. Данные обрабатывали в координатах Диксона [35].

Спектральные исследования

Спектр поглощения холофермента регистрировали при 25°C на спектрофотометре Cary-50 (Varian, США) в рабочем буфере без ПЛФ. Концентрация фермента - 1.036 мг/мл.

Антимикробная активность препаратов

Ночные культуры C. freundii и S. aureus, выращенные на среде Лурия-Бертани (LB-среда) при 37°С, разводили в 100 раз в среде LB и растили при 37°С при перемешивании до оптической плотности 0.20.3 при 600 нм. Культуры бактерий рассевали на чашки с твердой средой (LB-агар). Смеси МГЛ из разных источников и сульфоксидов аминокислот, предварительно инкубированные при комнатной температуре в течение 1 ч, наносили на диски из фильтровальной бумаги диаметром 12 мм, помещенные на чашки. Концентрации МГЛ из C. sporogenes и C. freundii и сульфоксидов составляли 10 и 2.5 мг/мл соответственно. Чашки инкубировали в течение 24 ч при 37°С, затем измеряли зоны ингибирования. Контрольные препараты растворов смесей фермента с сульфоксидами сохраняли антибактериальную активность в течение 2 недель.

Определение аллицина

Аллицин, образующийся в смесях, содержащих МГЛ и аллиин, определяли в реакции с 2-нитро-5-тиобензойной кислотой. Смесь МГЛ и аллиина добавляли к 1 мл 0.1 мМ 2-нитро-5-тиобензойной кислоты в 100 мМ калий-фосфатном буфере, содержащем 0.2 мМ ПЛФ, рН 8.0. Смесь инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Молярную концентрацию аллицина рассчитывали по уменьшению оптической плотности при 412 нм, используя значение молярного коэффициента поглощения 2-нитро-5-тиобензойной кислоты при 412 нм, равное 28300 М-1см-1 [27].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кинетические параметры реакций в- и у-элиминирования

Ранее [25] мы определили, что отщепление тромбином His-tag от МГЛ C. sporogenes приводит к повышению в 1.5 раза активности фермента в физиологической реакции с L-метионином. В данной работе определены параметры стационарной кинетики МГЛ C. sporogenes без His-tag в реакции Y-элиминирования пяти субстратов - L-метионина, сульфоксида L-метионина, S-этил-L-гомоцистеина,

сульфоксида S-этил-Ь-гомоцистеина и О-ацетил-L-гомосерина, в реакции ß-элиминирования четырех субстратов - S-этил-L-цистеина, сульфоксида S-этил-L-цистеина, О-ацетил^-серина и алли-ина. В табл. 1 приведены параметры для МГЛ из C. sporogenes, для МГЛ из двух других бактериальных источников и His-tag МГЛ C. sporogenes.

У МГЛ C. sporogenes параметр k в реакции Y-элиминирования трех субстратов - L-метионина, S-этил-L-гомоцистеина и сульфоксида L-метионина, оказался в 2-3 раза больше, чем у His-tag МГЛ C. sporogenes. Величины K для первых двух субстратов оказались близкими, в случае сульфоксида L-метионина величина K была несколько больше,

м '

чем у His-tag МГЛ.

Фрагмент His-tag не влияет на кинетические параметры реакции ß-элиминирования S-этил^-цистеина, величины k и K у МГЛ практически

' кат м ^ 1

такие же, как у His-tag МГЛ. Катализ стадии элиминирования боковой группы субстрата в реакциях Y- и ß-элиминирования осуществляется разными кислотными группами фермента. Предполагается, что в реакции ß-элиминирования, катализируемой ПЛФ-зависимыми лиазами, такой группой является боковая группа остатка лизина (Lys210 в C. freundii МГЛ), связывающего кофермент [36]. В ПЛФ-зависимых реакциях Y-элиминирования и Y-замещения эта роль приписывается консервативному остатоку тирозина (Tyr113 в C. freundii МГЛ), находящемуся в стекинг-взаимодействии с кольцом кофермента [36]. Это предположение подтверждают данные для мутантной формы МГЛ Pseudomonas putida с заменой Tyr114 на Phe [37]. Получены также свидетельства того, что кислотно-основные свойства Tyr113 МГЛ С. freundii регулируются триадой Cys115/Tyr113/Arg60 [2]. Arg60 расположен в подвижной N-концевой петле фермента, и атом азота гуанидиновой группы находится на расстоянии водородной связи от гидроксильной группы Tyr113 в трехмерной структуре холофермента [38], в структурах комплексов МГЛ с аминокислотами, моделирующими комплекс Михаэлиса [39], и в пространственной структуре внешнего аль-димина фермента с глицином [40]. Фрагмент His-tag может влиять на конформацию N-концевой петли и, следовательно, на взаимное расположение ги-дроксильной группы Tyr113 и гуанидиновой группы Arg60, что, в свою очередь, может влиять на величину рК гидроксильной группы Tyr113. Возможно, этим объясняется увеличение Y-элиминирующей активности МГЛ C. sporogenes по сравнению с His-tag МГЛ.

Сравнение ферментов из трех бактериальных источников (табл. 1) - P. putida, C. freundii и C. spo-

Таблица 1. Кинетические параметры реакций у- и Р-элиминирования*

Субстрат МГЛ С. sporogenes His-tag МГЛ С. зрот-genes** МГЛ С. ^вп^и*** МГЛ Р. pпtida****

к кат, с-1 КМ, мМ к /КМ кат' М, М-1с-1 ' к кат, с-1 КМ, мМ к /КМ кат' М, М-1с-1 ' к кат, с-1 КМ, мМ к /КМ кат' М, М-1с-1 ' к кат с-1 КМ, мМ к /КМ кат' М, М-1с-1 '

L-Met 21.61 0.60 3.60 X 104 9.86 0.43 2.28 х 104 6.2 0.7 8.85 х 103 48.6 0.90 5.4 х 104

(±)-Ь-МеЮ 21.66 11.39 1.90 х 103 8.59 7.89 1.09 х 103 8.12 4.65 1.75 х 103 - - -

S-Et-L-Hcy 21.31 0.24 8.87 х 104 7.05 0.27 2.54 х 104 6.78 0.54 1.25 х 104 33.4 0.27 1.23 х 105

(±)^-Е^Ь-НсуО 0.48 0.60 8.0 х 102 - - - - - - - - -

О-Ас-Ь-Ше 37.26 3.18 1.17 х 104 - - - 2.1 2.91 7.21 х 102 78.0 2.22 3.51 х 104

S-Et-L-Cys 6.53 0.43 1.52 х 104 6.3 0.358 1.76 х 104 5.03 0.17 2.96 х 104 5.79 0.48 1.21 х 104

(±)-S-Et-L-CysO 1.39 0.33 4.21 х 103 - - - - - - - - -

О-Ас-Ь^ег 5.31 8.01 6.6 х 102 - - - 2.13 4.28 4.98 х 102 - - -

(±)-Аллиин 11.43 1.43 7.99 х 103 - - - 5.9 4.7 1.26 х 103 - - -

*Ошибка не превышала 10%. **Данные [25]. ***Данные [2, 23, 33]. ****Данные [37].

rogenes, показало, что сродство как к физиологическому субстрату, так и к его аналогам практически одинаково. Каталитические эффективности реакции у-элиминирования Ь-метионина у МГЛ С. sporo-qenes и Р. pпtida близки, а величина к /К у МГЛ С.

^ ' кат м "

freundii несколько меньше. Кинетические параметры реакции Р-элиминирования S-этил-L-цистеина у трех ферментов очень близки.

МГЛ С. sporogenes катализирует реакцию у-элиминирования сульфоксида Ь-метионина с каталитической эффективностью на порядок большей, чем в реакции у-элиминирования сульфоксида S-этил-L-гомоцистеина. Скорость реакции Р-элиминирования сульфоксида S-этил-L-цистеина, катализируемой ферментом, в 15 раз меньше скорости реакции у-элиминирования сульфоксида Ь-метионина, но за счет большего сродства МГЛ С. sporogenes к этому субстрату каталитическая эффективность практически одинакова. В реакциях с сульфоксидами аминокислот наиболее эффективно фермент катализирует реакцию Р-элиминирования аллиина.

Фермент из С. sporogenes более эффективно катализирует реакцию у-элиминирования сульфоксида Ь-метионина, чем МГЛ С. freundii (величины ккат больше в 2.5 раза). Скорость расщепления аллиина МГЛ С. sporogenes почти в 2 раза больше, чем у фермента С. freundii, сродство к субстрату в 3 раза, а эффективность катализа в 6.3 раза выше.

Аминокислоты с неразветвленной боковой цепью ингибировали реакцию у-элиминирования Ь-метионина по конкурентному типу. В табл. 2 приведены константы ингибирования МГЛ из С. sporo-genes, С. freundii и Р. putida. У всех этих ферментов наблюдается улучшение связывания с увеличением количества метиленовых групп в аминокислотах с неразветвленной боковой цепью, что, вероятно, объясняется гидрофобным характером активных центров фермента из Р. putida [41] и С. freundii [38]. Возможно, значительное возрастание сродства при переходе от Ь-норвалина к Ь-норлейцину у фермента из трех источников и близкие значения величин К Ь-норлейцина и К для Ь-метионина

À, нм

Рис. 1. Спектр поглощения холофермента МГЛ C. sporogenes

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Таблица 2. Ингибирование реакции у-элиминирования L-метионина*

Рис. 2. Диффузия в агаре по методу Кирби-Бауэра [44]. На диск наносили смесь C. sporogenes МГЛ (10 мг/мл) и аллиина (2.5 мг/мл) в 100 мМ калий-фосфатном буфере. А - культура C. freundii. Б - культура S. aureus

и S^Tun-L-uucTeMHa объясняются наличием «кармана» для метильной группы аминокислот в активных центрах МГЛ.

Спектральные характеристики фермента

Спектр поглощения холофермента МГЛ C. sporogenes (рис. 1) при рН 8.0 сходен со спектром МГЛ C. freundii [23] с преобладающей полосой в области 422-425 нм, принадлежащей внутреннему альди-мину в форме кетоенамина (рис. 1, структура II). Как и у His-tag МГЛ C. sporogenes [24], спектр содержит интенсивную полосу поглощения с максимумом в области 502-505 нм, которую в спектрах комплексов ПЛФ-зависимых ферментов с аминокислотами и модельными соединениями приписывают хиноид-ному интермедиату [42].

Аминокислота K, мМ i7

C. freundii** C. sporogenes P. putida***

L-Ala 3.4 1.5 5.1

L-Abu 8.3 2.0 8.4

L-Nva 4.7 1.9 3.0

L-Nle 0.6 0.37 0.5

*Ошибка не превышала 10%.

**Данные [23].

***Данные [43].

Таблица 3. Параметры полос спектра поглощения внутреннего альдимина C. sporogenes МГЛ

Структура E, эВ v x 10-3, см-1 À, нм 8 x 10-3, М-1см-1 W x 10-3, см-1 P f n, %

II1 2.92 23.53 425.0 10.46 3.58 1.58 0.22 64.7

ir 3.24 26.15 382.4 7.76 4.00 1.37 0.02 7.5

I 3.63 29.28 341.5 9.44 3.65 1.23 0.03 10.0

II" 3.79 30.56 327.2 10.27 3.47 1.29 0.01 5.6

II2* 4.28 34.55 289.4 5.98 5.06 1.20 0.18

* 4.46 35.99 277.9 6.70 4.70 1.50 0.26

1.0

0.8

п о

« 0.6 ни

е

о 0.4 л г о

С 0.2

*Экспериментальная информация об этих полосах недостаточна.

Примечание. Е — энергия электронного перехода; V — волновое число; X — длина волны; с — коэффициент молярного поглощения; V — полуширина; р — асимметрия; f — сила осциллятора; п — содержание таутомеров и конформеров. Содержание ПЛФ в ферменте - 87.8%. Надстрочные индексы (1, 2) относятся к первому и второму электронным переходам структуры II. Надстрочные индексы (,<) относятся к двум конформерам структуры II (конформер с альдиминной связью, находящейся в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла, и конформер с альдиминной связью, частично выведенной из плоскости пиридинового кольца, но сохраняющей сопряжение и водородную связь между альдиминным азотом и З'-оксигруппой кофермента).

Таблица 4. Ингибирование культур клеток бактерий смесями, содержащими МГЛ и сульфоксиды аминокислот

Сульфоксид аминокислоты Зона ингибирования, мм2

МГЛ C. freundii МГЛ C. s oorogenes

C. freundii S. aureus C. freundii S. aureus

(±)-Аллиин 380 754 254 754

(±)-L-MetO 452 491 177 227

(±)-S-Et-L-CysO 314 491 254 314

(±)-S-Et-L-HcyO 254 415 227 227

Разложение спектра холофермента с использованием логнормальных кривых в области 300-500 нм проводили согласно [23]. В табл. 3 приведены параметры полос поглощения, полученные в результате разложения. Внутренний альдимин, помимо кетое-намина (рис. 1, структура II, е = 10410 М-1с-1), описывается минорными структурами, енольным тауто-мером (рис. 1, структура I) и двумя конформерами кетоенамина, с альдиминной связью, перпендикулярной плоскости кольца кофермента (поглощает в области 380 нм), и с альдиминной связью, частично выведенной из плоскости кольца, но сохраняющей сопряжение с п-электронами кофактора и водородную связь между альдиминным азотом и 3'-ок-сигруппой ПЛФ (поглощает в области 327-328 нм). Ионная форма внутреннего альдимина и таутомер-ное равновесие практически такие же, как у МГЛ C. freundii. Идентификация поглощения в области 502-505 нм нуждается в дополнительных исследованиях.

Антимикробная активность смесей МГЛ C. freundii и C. sporogenes с сульфоксидами аминокислот

Антибактериальная активность смесей МГЛ из двух источников с сульфоксидами аминокислот проверена на культурах бактерий - грамположительной S. aureus и грамотрицательной C. freundii (табл. 4). Все смеси показали бактериостатический эффект в отношении грамположительных и грамотрица-тельных бактерий. Наиболее значительный эффект наблюдали для культуры S. aureus (рис. 2). Бактериостатический эффект был сравним с ингиби-рованием роста бактериальных клеток канамицином. Зоны ингибирования канамицином (0.05 мг) и смесью,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Wentworth P., Datta A., Blakey D., Boyle T., Partridge L.J., Blackburn G.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93.

P. 799-803.

2. Morozova E.A., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Kulikova V.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crys-tallogr. 2014. V. 70. № 11. P. 3034-3042.

содержавшей 0.04 мг аллицина, на культуре C. freundii составили 314 и 346 мм2.

Таким образом, полученные данные показали, что клонированный фермент эффективно катализирует конверсию сульфоксидов аминокислот в тио-сульфинаты. Это позволяет предположить, что фармакологическая пара МГЛ и сульфоксид может обеспечить образование тиосульфинатов в количествах, достаточных для терапевтических целей.

ВЫВОДЫ

МГЛ катализирует реакции у- и Р-элиминирования сульфоксидов - аналогов метионина и цистеина -с каталитическими эффективностями, сравнимыми с эффективностями реакций у- и Р-элиминирования этих аминокислот.

На твердой среде показано, что смеси МГЛ с суль-фоксидами перспективны как антимикробные средства против грамположительных и грамотрицатель-ных бактерий in situ.

Наибольший бактериостатический эффект смеси МГЛ с сульфоксидами аминокислот оказывают на грамположительную бактерию S. aureus, и бак-териостатический эффект аллицина, полученного in situ, сравним с эффектом канамицина. •

Авторы благодарят Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов за предоставленную возможность клонирования гена метионин—у-лиазы из Clostridium sporogenes.

Работа поддержана Российским научным фондом (проект № 15-14-00009).

3. Tanaka H., Esaki N., Soda K. // Enzyme Microb. Technol. 1985. V. 7. P. 530-537.

4. Фалеев Н.Г., Троицкая М.В., Ивойлов В.С., Карпова В.В., Беликов В.М. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. T. 30. № 3. C. 458-463.

5. El-Sayed A.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 86. P. 445-467.

6. Goyer A., Collakova E., Shachar-Hill Y., Hanson A.D. // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. P. 232-242.

7. Nakayama T., Esaki N., Lee W.-J., Tanaka I., Tanaka H., Soda K. // Agric. Biol. Chem. 1984. V. 48. P. 2367-2369.

8. Kreis W., Hession C. // Cancer Res. 1973. V. 33. P. 1862-1865.

9. Yoshimura M., Nakano Y., Yamashita Y., Oho T., Saito T., Koga T. // Infection Immunity. 2000. V. 68. P. 6912-6916.

10. Tokoro M., Asai T., Kobayashi S., Takeuchi T., Nozaki T. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 42717-42727.

11. Lockwood B., Coombs G. // Biochem. J. 1991. V. 279. P. 675682.

12. Coombs G.H., Mottram J.C. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V. 45. P. 1743-1745.

13. Yoshimura M., Nakano Y., Koga T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 292. P. 964-968.

14. Sato D., Kobayashi S., Yasui H., Shibata N., Toru T., Yama-moto M., Tokoro G., Ali V., Soga T., Takeuchi T., Suematsu M., Nozaki T. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2010. V. 35. № 1. Р. 56-61.

15. Han J., Lawson L., Han G., Han P. // Anal. Biochem. 1995. V. 225. P. 157-160.

16. Stoll A., Seebeck E. // Adv. Enzymol. 1951. V. 11. P. 377-400.

17. Rabinkov A., Miron T., Konstantinovski L., Wilchek M., Mirelman D., Weiner L. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1379. P. 233-244.

18. Rose P., Whiteman M., Moore P.K., Zhu Y.Z. // Nat. Prod. Rep. 2005. V. 22. P. 351-368.

19. Lynett P.T., Butts K., Vaidya V., Garrett G.E., Pratt D.A. // Org. Biomol. Chem. 2011. V. 9. P. 3320-3330.

20. Hirsch K., Danilenko M., Giat J., Miron T., Rabinkov A., Wilchek M., Mirelman D., Levy J., Sharoni Y. // Nutr. Cancer. 2000. V. 38. P. 245-254.

21. Shadkchan Y., Shemesh E., Mirelman D., Miron T., Rabinkov A., Wilchek M., Osherov N. // J. Antimicrob. Chemother. 2004. V. 53. P. 832-836.

22. Curtis H., Noll U., Stormann J., Slusarenko A.J. // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2004. V. 65. P. 79-89.

23. Морозова Е.А., Бажулина Н.П., Ануфриева Н.В., Мамаева Д.В., Ткачев Я.В., Стрельцов С.А., Тимофеев В.П., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 1272-1280.

24. Ревтович С.В., Морозова Е.А., Ануфриева Н.В., Котлов М.И., Белый Ю.Ф., Демидкина Т.В. // дан. 2012. Т. 445. С. 187-193.

25. Морозова Е.А., Куликова В.В., Яшин Д.В., Ануфриева Н.В.,

Анисимова Н.Ю., Ревтович С. В., Котлов М.И., Белый Ю.Ф., Покровский В.С., Демидкина Т.В. // Acta Naturae. 2013. Т. 5. № 3 (18). С. 96-102.

26. Nagai S., Flavin M. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 3884-3895.

27. Miron T., Rabinkov A., Mirelman D., Weiner L., Wilchek M. // Anal. Biochem. 1998. V. 265. P. 317-332.

28. Mitsudome T., Takahashi Y., Mizugaki T., Jitsukawa K., Kaneda K. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2014. V. 53. № 32. Р. 8348-8351.

29. Frankel M., Gertner D., Jacobson H., Zilkha A. // J. Chem. Soc. 1960. P. 1390-1393.

30. Briggs W.H., Xiao H., Parkin K.L., Shen C., Goldman I.L. // J. Agricult. Food Chem. 2000. V. 48. № 11. P. 5731-5735.

31. Waelsch H., Owades P., Miller H.K., Borek E. // J. Biol. Chem. 1946. V. 166. P. 273-281.

32. Studier F.W. // Protein Expr. Purif. 2005. V. 41. P. 207-234.

33. Манухов И.В., Мамаева Д.В., Морозова Е.А., Расторгуев

C.М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В., Завильгельский Г.Б. // Биохимия. 2006. V. 71. P. 454-463.

34. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

35. Dixon M. // Biochem. J. 1953. V. 55. P. 170-171.

36. Clausen T., Huber R., Laber B., Pohlenz H.D., Messerschmidt A. // J. Mol. Biol. 1996. V. 262. P. 202-224.

37. Inoe H., Inagaki K., Adachi N., Tamura T., Esaki N., Soda K., Tanaka H. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64.

P. 2336-2343.

38. Nikulin A., Revtovich S., Morozova E., Nevskaya N., Nikonov S., Garber M., Demidkina T. // Acta Crystallography, Section

D. 2008. V. 64. P. 211-218.

39. Ревтович С.В., Морозова Е.А., Хурс Е.Н., Закомырдина Л.Н., Никулин А.Д., Демидкина Т.В., Хомутов Р.М. // Биохимия. 2011. Т. 76. С. 690-698.

40. Revtovich S.V., Faleev N.G., Morozova E.A., Anufrieva N.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Biochimie. 2014. V. 101. P. 161-167.

41. Motoshima H., Inagaki K., Kumasaka T., Furuichi M., Inoue H., Tamura T., Esaki N., Soda K., Tanaka N., Yamamoto M., et al. // J. Biochem. 2000. V. 128. P. 349-354.

42. Metzler C.M., Harris A.G., Metzler D.E. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 4923-4933.

43. Esaki N., Nakayama T., Sawada S., Tanaka H., Soda K. // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 3857-3862.

44. Bauer A.W., Kirb W.M.M., Sherris J.C., Turck M. // Am. J. Clin. Pathol. 1966. V. 36. P. 493-496.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.