CC BY
43
УДК 577.181.5
Антибактериальное действие тиосульфинатов на мультирезистентные штаммы бактерий, выделенные от больных муковисцидозом
В. В. Куликова1, М. Ю. Чернуха2, Е. А. Морозова1, С. В. Ревтович1, А. Н. Родионов1, В. С. Коваль1, Л. Р. Аветисян2, Д. Г. Кулястова2, И. А. Шагинян2, Т. В. Демидкина1* 1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи
Минздрава России, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18
*E-mail: tvd@eimb.ru, tvdemidkina@yandex.ru
Поступила в редакцию 11.10.2017
Принята к печати 26.06.2018
РЕФЕРАТ Установлена мультирезистентность штаммов Achromobacter ruhlandii 155В, Burkholderia cenocepacia 122 и Pseudomonas aeruginosa 48В, выделенных от больных муковисцидозом. Показан антибактериальный эффект аллицина, диметилтиосульфината и дипропилтиосульфината на мультирезистентные штаммы. В зависимости от микроорганизма и концентрации тиосульфинаты могут оказывать как бакте-риостатическое, так и бактерицидное действие. Исследованные тиосульфинаты могут рассматриваться в качестве кандидатов для разработки альтернативных лекарственных препаратов, эффективных при инфекциях, вызванных возбудителями, мультирезистентными к антибиотикам.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аллицин, антибактериальная активность, метионин-у-лиаза, муковисцидоз, тиосуль-финаты.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МГЛ - метионин-у-лиаза; МПК - минимальная подавляющая концентрация; МБК -минимальная бактерицидная концентрация.
ВВЕДЕНИЕ
Разработка новых подходов к созданию эффективных антибактериальных препаратов актуальна из-за широкого распространения антибиотикорези-стентных штаммов бактерий. Мультирезистентные микроорганизмы вызывают внутрибольничные инфекции, которые могут быть причиной осложнений у ослабленных больных. Серьезную проблему представляет хроническая легочная инфекция у больных муковисцидозом, вызванная ассоциацией таких возбудителей, как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia complex и др. [1], при которой под воздействием длительной антибиотикотерапии происходит формирование мультирезистентных штаммов микроорганизмов, что обуславливает неэффективность терапии антибиотиками.
Тиосульфинаты, обнаруженные в растениях рода Allium, обладают антимикробным действием [2].
Антибактериальный эффект аллицина, основного тиосульфината чеснока, обусловлен сочетанием снижения уровня клеточного глутатиона и инактивации ключевых метаболических ферментов вследствие модификации их тиоловых групп [3, 4]. Поскольку аллицин, окисляющий тиоловые группы ферментов и белков, имеет много мишеней в клетке, аллицин и другие тиосульфинаты, скорее всего, не должны вызывать резистентность [5].
В растениях рода Allium аллииназа [КФ 4.4.1.4] катализирует разложение сульфоксидов S-замещенных аналогов L-цистеина с образованием тиосульфинатов. Нами показано, что тиосульфинаты могут быть получены при помощи метионин-у-лиазы (МГЛ, [КФ 4.4.1.11]) (схема). Тиосульфинаты, образующиеся при расщеплении сульфокси-дов S-аллил^-цистеина, S-метил-L-цистеина и S-этил-L-цистеина, катализируемом как МГЛ дикого типа, так и ее более эффективной мутантной
+H3N
МГЛ
О" 2Н20
Сульфоксид аминокислоты
О R
V /
S-S
/ R
О о
♦ 2 М
НзС О-
Тиосульфинат
+ 2NH4
R: Н2С=СН-СН;
О
; СН2 R: НзС-СН-СНг—;
V / °v А
Б -S Б—S
' Аллицин -
/
С Из R: Н3С
О СНз
V /
ъ—S
^ НзС
Н?С НзС Диметилтиосульфинат
Дипропилтиосульфинат
Схема. Реакция ß-элиминирования сульфоксидов S-замещенных аналогов L-цистеина
формой С115Н, ингибируют рост грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий [6], в том числе P. aeruginosa, выделенной из кишечника мышей [7].
Целью данной работы было исследование антибактериального действия тиосульфинатов, полученных в реакции ß-элиминирования трех сульфоксидов S-замещенных аналогов L-цистеина (схема), катализируемой С115Н МГЛ, на мультирезистентные штаммы грамотрицательных бактерий Achromobacter ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В, выделенных от больных муковисцидозом.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выделение фермента, определение его активности, синтез сульфоксидов S-замещенных аналогов L-цистеина и получение тиосульфинатов проводили как описано ранее [6]. Концентрацию тиосульфинатов определяли согласно [8].
Антибактериальную активность тиосульфинатов определяли методом двукратных серийных разведений и методом диффузии в агаре.
При определении антибактериальной активности тиосульфинатов методом двукратных серийных разведений [9] использовали бульон Мюллера-Хинтона и разведение культур штаммов 105 КОЕ/мл с добавлением препаратов в концентрациях от 1 до 0.0039 мг/мл с последующим высевом на плотную питательную среду (среда № 1 для P. aeruginosa 48В и кровяной агар для A. ruhlandii 155В и B. cenocepacia 122).
Антибактериальную активность препаратов на твердой среде определяли при концентрации от 2 до 0.05 мг/мл путем высева из разведений культур
штаммов от 104 до 107 КОЕ/мл на агар Мюллера-Хинтона диско-диффузионным методом и методом непосредственного нанесения исследуемых образцов в объеме 10 мкл.
Резистентность штаммов к действию стандартных антибиотиков, назначаемых при муковисцидозе, определяли методом серийных разведений согласно клиническим рекомендациям о пограничных значениях МПК для каждого антибиотика [10].
Антибактериальную эффективность тиосульфи-натов и антибиотиков сравнивали, используя диско-диффузионный метод при высеве из разведений культур штаммов 106 КОЕ/мл на агар Мюллера-Хинтона.
Время инкубации культур на твердой питательной среде во всех экспериментах составляло 24-48 ч.
В работе использовались штаммы A. ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В из коллекции культур лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций, НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ, выделенные от больных муковисцидозом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определяли антибактериальную активность аллицина, диметил- и дипропилтиосульфинатов против штаммов A. ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В, выделенных от больных муко-висцидозом (табл. 1). Выявлены различия в характере и степени выраженности антимикробного действия тиосульфинатов.
Наиболее активными в отношении B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В оказались аллицин и диме-
тилтиосульфинат, дипропилтиосульфинат был менее активным.
Величины МПК и МБК тиосульфинатов при действии на B. cenocepacia оказались равными или близкими, что свидетельствует о бактерицидном действии этих двух соединений. Значение МПК аллицина лежит в диапазоне, полученном для коммерческого аллицина против нескольких штаммов B. cepacia complex (0.008-0.062 мг/мл) [11].
На штамм P. aeruginosa 48В тиосульфинаты оказывают бактериостатическое действие, поскольку в исследуемом диапазоне концентраций тиосульфи-натов значение МБК (1 мг/мл) определяется только для аллицина. Значения МПК и МБК аллицина для штамма P. aeruginosa 48В соответствуют величинам МПК (0.064-0.512 мг/мл) и МБК (0.128-1.024 мг/мл) аллицина против трех клинических штаммов P. aeruginosa [12].
Антибактериальное действие тиосульфинатов на штамм A. ruhlandii 155В было наименее значимым. Значения МПК, полученные в опыте по определению антибактериальной активности на твердой питательной среде диско-диффузионным методом (табл. 1), составили 2 мг/мл для диметил- и дипропилтиосуль-финатов, что превышало максимальную концентрацию, используемую в методе серийных разведений. Наиболее эффективным против A. ruhlandii 155В оказался аллицин, обладающий бактерицидным действием в концентрации 1 мг/мл.
Изменение антибактериальной эффективности тиосульфинатов определяли в зависимости от концентрации бактериальных клеток. Эксперимент был проведен диско-диффузионным методом (табл. 2) и методом нанесения образцов на твердую питатель-
Таблица 1. Значения МПК и МБК тиосульфинатов
Бактериальный штамм Тиосульфинат МПК МБК
мг/мл
A. ruhlandii 155В Аллицин 0.50 1
Диметилтиосульфинат 2.00* -
Дипропилтиосульфинат 2.00* -
B. cenocepacia 122 Аллицин 0.03 >0.03**
Диметилтиосульфинат 0.03 >0.03**
Дипропилтиосульфинат 0.25 0.5
P. aeruginosa 48В Аллицин 0.06 1
Диметилтиосульфинат 0.06 -
Дипропилтиосульфинат 0.50 -
Примечание. «-» - отсутствие бактерицидного действия.
*Данные получены из эксперимента по определению антибактериальной активности на твердой питательной среде диско-диффузионным методом. **Но не более 0.06.
ную среду. Результаты, полученные обоими методами, совпали.
Тиосульфинаты в концентрации 2 мг/мл эффективно подавляют рост A. ruhlandii 155В и B. cenocepacia 122 при концентрации клеток до 107 КОЕ/мл включительно. Антибактериальное действие тиосульфинатов на P. aeruginosa 48B выражено слабо. Аллицин в максимальной концентрации незначительно подавляет рост P. aeruginosa 48B даже при минимальной концентрации клеток. Интересно, что среди тиосульфинатов только диметилтиосуль-финат в концентрации 0.4 мг/мл (табл. 2) подавляет рост P. aeruginosa. Результаты, полученные для ал-
Таблица 2. Антибактериальная эффективность тиосульфинатов при различных концентрациях клеток
Бактериальный штамм Тиосульфинат Диаметр зон ингибирования (мм) при концентрации клеток, КОЕ/мл
104 105 106 107 104 105 106 107
и концентрации тиосульфината*, мг/мл
2 0.4
A. ruhlandii 155В Аллицин 30 30 30 30 0 0 0 0
Диметилтиосульфинат 30 30 30 30 0 0 0 0
Дипропилтиосульфинат 30 30 30 30 0 0 0 0
B. cenocepacia 122 Аллицин 25 25 25 25 0 0 0 0
Диметилтиосульфинат 25 25 25 25 0 0 0 0
Дипропилтиосульфинат 20 20 20 20 0 0 0 0
P. aeruginosa 48В Аллицин 10 0 0 0 0 0 0 0
Диметилтиосульфинат 15 15 15 15 10 - - -
Дипропилтиосульфинат 15 15 0 0 0 0 0 0
'Концентрации тиосульфинатов 0.2, 0.1 и 0.05 мг/мл в таблице не представлены, так как при этих концентрациях антибактериальный эффект отсутствовал.
Таблица 3. Резистентность (+) бактериальных штаммов к антибиотикам
Штамм Азтреонам Амикацин Гентамицин Доксициклин Имипенем Колистин Левофлоксацин Норфлоксацин Офлоксацин Тобрамицин Хлорамфеникол Цефепим Цефотаксим Цефтазидим Цефтриаксон Цефуроксим Ципрофлоксацин
A. ruhlandii 155В + + + + + + + + + + + + + + + +
B. cenocepacia 122 + + + + + +
P. aeruginosa 48В + + + + + + + + +
Таблица 4. Антибактериальная эффективность тиосульфинатов и антибиотиков при концентрации клеток 106 КОЕ/мл
Концентрация, мкг/диск Тиосульфинат Диаметр зоны ингибирования, мм
A. ruhlandii 155В B. cenocepacia 122 P. aeruginosa 48В
20 Аллицин 25 20 0
20 Диметилтиосульфинат 16 30 30
20 Дипропилтиосульфинат 30 5 0
5 Имипенем 0 30 30
10 Тобрамицин 0 0 0
10 Ципрофлоксацин 0 0 0
лицина и диметилтиосульфината, хорошо соотносятся с данными для P. aeruginosa из кишечного тракта мышей [7].
Отсутствие зон задержки роста в опыте на твердой среде при низких концентрациях аллицина и диме-тилтиосульфината, вероятно, обусловлено медленной диффузией веществ в агар Мюллера-Хинтона. Таким образом, оптимальным методом определения антибактериальной активности исследуемых тио-сульфинатов является метод серийных разведений.
Резистентность штаммов A. ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В оценивали с использованием 17 антибиотиков, наиболее часто назначаемых при муковисцидозе (табл. 3). Штамм A. ruhlandii 155В оказался резистентным к 16 антибиотикам, штамм B. cenocepacia 122 - к шести, а P. aeruginosa 48В - к девяти антибиотикам. Полученные данные подтвердили формирование резистентности у этих штаммов после длительной антибиотикотерапии. Примечательно, что ни один из протестированных антибиотиков не оказывал антибактериального действия на все три бактериальных штамма.
Мы сравнили эффективность антибактериального действия тиосульфинатов и антибиотиков широкого спектра действия, принадлежащих к трем различным группам, наиболее часто назначаемым при му-ковисцидозе: имипенема из группы карбапенемов,
тобрамицина из группы аминогликозидов и ци-профлоксацина из группы фторхинолонов (табл. 4). Как и в случае двукратных серийных разведений, при определении антибактериальной активности диско-диффузионным методом на плотной питательной среде три штамма оказались резистентными к тобрамицину и ципрофлоксацину в стандартных концентрациях 10 мкг/диск. Диаметры зон ингиби-рования имипенема при действии на B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В сравнимы со значениями для диметилтиосульфината и незначительно больше зоны ингибирования B. cenocepacia 122 аллицином. Аллицин и диметилтиосульфинат подавляют рост A. ruhlandii 155В, в то время как к действию имипе-нема данный штамм резистентен.
Полученные данные открывают возможность разработки препаратов для антибактериальной терапии хронической легочной инфекции у больных муковис-цидозом. •
Авторы благодарят НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи
Минздрава РФ за возможность проведения экспериментов по определению антимикробной активности препаратов на клинических изолятах.
Работа поддержана грантом РНФ № 15-14-00009.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Шагинян И.А., Капранов Н.И., Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Семыкин С.Ю., Аветисян Л.Р., Каширская Н.Ю., Пивкина Н.В., Данилина Г.А., Батов А.Б., Бусуек Г.П. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009. № 5. С. 15-20.
2. Cavallito C.J., Bailey J.H. // J. Am. Chem. Soc. 1944. V. 66. P. 1950-1951.
3. Rabinkov A., Miron T., Konstantinovski L., Wilchek M., Mirelman D., Weiner L. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1379. P. 233-244.
4. Muller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. // J. Biol. Chem. 2016. V. 291. P. 11477-11490.
5. Ankri S., Mirelman D. // Microb. Infect. 1999. V. 2. P. 125-129.
6. Morozova E.A., Kulikova V.V., Rodionov A.N., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Demidkina T.V. // Biochimie. 2016. V. 128-129. P. 92-98.
7. Kulikova V.V., Anufrieva N.V., Revtovich S.V., Chernov A.S.,
Telegin G.B., Morozova E.A., Demidkina T.V. // IUBMB Life. 2016. V. 68. P. 830-835.
8. Miron T., Rabinkov A., Mirelman D., Weiner L., Wilchek M. // Anal. Biochem. 1998. V. 265. P. 317-325.
9. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н., Верстакова О.Л., Журавлева М.В., Лепахин В.К., Коробов Н.В., Меркулов В.А., Орехов С.Н, Сакаева И.В. и др. Руководство
по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
10. Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2015-02). М.: Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии, 2015.
11. Wallock-Richards D., Doherty C.J., Doherty L., Clarke D.J., Place M., Govan J.R.W., Campopiano D.J. // PLoS One. 2014. V. 9. № 12. e112726.
12. Reiter J., Levina N., van der Linden M., Gruhlke M., Martin C., Slusarenko A.J. // Molecules. 2017. V. 22. P. 1711.
