CC BY
21
DOI 10.24412/2074-5036-2021-3-14-18 УДК: 619:616.937.5
Ключевые слова: рецепторы, вирус, лимфоциты, лейкоз, овцы Key words: receptors, virus, lymphocytes, leukemia, sheep
Григорьев А. Г., Ездакова И. Ю., Капустина О. В., Белоусова Р. В.
СУБПОПУЛЯЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ОВЕЦ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЗАРАЖЕНИИ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
SUBPOPULATION CHARACTERISTICS OF SHEEP BLOOD LYMPHOCYTES IN EXPERIMENTAL INFECTION WITH BOVINE LEUKEMIA VIRUS
ФГБНУ «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук». Адрес: 109428, Россия, г. Москва, Рязанский просп., 24, корп. 1 Federal State Budget Scientific Institution «Federal Scientific Centre VIEV» (FSC VIEV) Address: 24, Ryazan ave., 1, Moscow, 109428, Russia
Григорьев Артём Геннадьевич, аспирант. E-mail: griartis.viev@yandex.ru Grigoriev Artem Gennadievich, Post-Graduate student. E-mail: griartis.viev@yandex.ru Ездакова Ирина Юрьевна, д. б. н., заведующая лабораториейи иммунологии. E-mail: ezdakova.i@viev.ru Ezdakova Irina Yuryevna, Doctor of Biological Sciences, Head of Laboratory of Immunology.
E-mail: ezdakova.i@viev.ru Капустина Ольга Владимировна, д. в. н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии.
E-mail: оlgakapustina2010@yandex.ru Kapustina Olga Vladimirovna, Doctor of Veterinary Sciences, Senior Researcher ofat the Laboratory of Immunology. E-mail: olgakapustina2010@yandex.ru Белоусова Раиса Васильевна, доктор ветеринарных наук. E-mail: rvbelousova@mail.ru Belousova Raisa Vasilyevna, Doctor of Veterinary Sciences. E-mail: rvbelousova@mail.ru
Аннотация. В настоящей работе представлен анализ динамики иммунокомпетентных клеток крови овец различного возраста при экспериментальном заражении вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Показано, что иммуногенез сопровождается увеличением числа CD5+-лимфоцитов на 12-е сутки у обеих групп животных. В течение 20 суток иммунного ответа, вирус вызывает стабильное снижение уровня В-клеток, которые являются его основной мишенью. На 12-е сутки после заражения отмечалось кратковременное повышение содержания CD8+-клеток и естественных киллеров у взрослой группы животных. У молодых животных количественный профиль субпопуляций лимфоцитов отличается от показателей взрослых животных, что, показывает различный ответ организма на введение вируса в возрастном аспекте на ранней стадии развития болезни.
Summary. This work presents an analysis of the dynamics of immunocompetent blood cells of sheep of various ages during experimental infection with the bovine leukemia virus. It was shown that immunogenesis was accompanied by an increase in the number of CD5+ lymphocytes on the 12th day in both groups of animals. Within 20 days of the immune response, the virus causes a stable decrease in the level of B-cells, which are its main target. On the 12th day after infection, there was a short-term increase in the content of CD8+ cells and natural killer cells in the adult group of animals. In young animals, the quantitative profile of lymphocyte subpopulations differs from the indicators of adult animals, which shows a different response of the organism to the introduction of the virus in the age aspect at an early stage of the development of the disease.
Введение
Согласно современным теориям иммунитета, ведущая роль в противовирусной защите принадлежит иммунокомпетентным клеткам. Известно, что мишенью BLV являются не только В-клетки, но и CD5+-лимфоциты, рецепторная характеристика которых не по-
зволяет четко определить их статус. CD5-антиген может экспрессироваться как на В-клетках, так и Т-клетках [5, 8]. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) был открыт достаточно давно, но патогенез болезни на клеточном уровне и его адаптация к другим видам животных изучены пока недостаточно.
14
После экспериментального заражения BLV у овец через 1,5 года развивается стойкий В-клеточный лимфоцитоз, а через 2,5 года после заражения появляются опухоли типичные для этой болезни (симптомы лим-фосаркомы) [6, 7, 9]. К тому же лейкоз овец вызывает почти 100 % летальность, по сравнению с 5 % у крупного рогатого скота (КРС). У последних лейкемия может возникнуть через 8-10 лет с момента заражения, и только у 20-30 % инфицированных разовьётся персистирующий лимфоцитоз (PL) [4, 9, 10]. У взрослых коров PL проявляется увеличением числа B-клеток [5, 9], у телят же в первую неделю после заражения наблюдается рост числа В-клеток с фенотипом IgM+CD5+ (B-1-лимфоциты) [1, 3]. Ввиду более быстрого и агрессивного течения лейкоза у овец, представляет особый интерес изучение лимфоци-тарного профиля иммунного ответа [4, 9].
Целью работы был анализ количественной динамики Т-, В-клеток и естественных киллеров в крови овец разных возрастных групп для изучения механизмов формирования иммунного ответа на ретровирусную инфекцию у овец романовской породы.
Материалы и методы
Для заражения овец использовали кровь от BLV-положительной коровы (16000 лей-коцитов/мкл). 10 голов овец романовской породы были разделены на две группы: 1 группа овцы в возрасте 6-7 лет (5 голов) и 2 группа - овцы 3-4-месячного возраста (5 голов). Клетки крови овец исследовали до заражения и на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е, 10-е, 12-е, 14-е и 20-е сутки после заражения. Из свежевыде-ленной крови выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла (d=1,077). Лимфоциты (0,5-1,0х106) по 30 мкл вносили в 10-луночные предметные стёкла, фиксировали этиловым спиртом. Для регидратации клеток после фиксации использовали физиологический раствор. Для блокирования эндогенной пероксидазы использовали 1 % перекись водорода, а для блокировки неспецифических сайтов связывания - 1 % BSA. Для идентификации клеток использовали метод иммунопероксидазного окрашивания лимфоцитов (ИПО) с монокло-
нальными антителами к CD20+, CD16+ CD8+, CD5+ и CD4+ лимфоцитам человека в рабочем разведении, согласно инструкции производителя (ООО «Сорбент»). В качестве вторичных антител использовали ПХ конъюгат овечьих IgG к Ig мыши в разведении 1:400 в ЗФР-БСА буфере рН 7,2-7,4. В качестве субстрата использовали 3-амино-9-этил кар-базол. Идентификацию клеток проводили с помощью светового микроскопа Zeiss AXI0 Scope.A1. Для определения концентрации иммуноглобулинов классов М, G и А в сыворотке крови овец использовали метод простой радиальной иммунодиффузии (РИД).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excell (Microsoft, USA) и Statistica 8.0.
Результаты исследования и обсуждение
Изменения субпопуляционного профиля иммунокомпетентных клеток овец при введении вируса лейкоза крупного рогатого скота являются ответом иммунной системы на проникновение чужеродного агента в организм.
Относительное количество В-лимфоцитов у овец обеих групп до заражения BLV находилось в пределах физиологической нормы (11-50 %) [11] и у взрослых животных (1 группа) составляло 32,0±2,2 %, а у молодых 18,0±4,3 %.
После заражения отмечалось снижение уровня В-клеток (CD20+) на протяжении всего изучаемого периода с небольшим увеличением на 12-е сутки как в первой, так и во второй группах животных (рис. 1). На 7-е и 14-е сутки число В-лимфоцитов снизилось до 2,0±0,6 % и 8,4±3,2 % у взрослых и до 2,0±1,09 % и 9,2±3,7 % у молодых овец, соответственно. Несмотря на более значимую роль клеточного иммунитета при вирусных инфекциях, хорошо известно участие гуморального звена в защитных реакциях организма. При онкогематологических патологиях изменяется содержание и активность полиспецифических иммуноглобулинов, что ассоциируется с неблагоприятным прогнозом заболевания. На 7-е сутки иммунного ответа концентрация IgG у 1-ой группы овец составила 24,4±2,3 мг/мл, а у 2-ой группы
15
увеличилась с 10,0±2,0 мг/мл до 12,0±0,9 мг/мл [2]. Концентрация ^А в сыворотке крови на протяжении всех 20-ти суток значительных изменений не претерпевала [2], и, судя по всему, сывороточный ^А на ранней стадии развития экспериментальной инфекции не имеет определяющего значения, что может быть связано со способом введения вируса в организм. Известно, что у телят гуморальный иммунный ответ развивается в течение первых дней после заражения. У экспериментально инфицированных BLV телят в сыворотке крови высокий уровень ^М был установлен на 5-7-е сутки, что говорит о начале гуморального иммунного ответа [1]. У опытных групп овец на протяжении всего эксперимента не было установлено каких-либо значимых изменений в концентрации антител данного класса, что связано с особенностями течения лейкоза у овец.
Количественная динамика CD20+-лимфоцитов отличается более низкими параметрами у 2-ой группы, что, скорее всего, объясняется возрастными особенностями и не до конца сформированной иммунной системой у молодых животных. Ввиду преимущественного тропизма вируса лейкоза к В-лимфоцитам и снижение их числа, вероятнее всего, может привести к недостаточной выработке нейтрализующих антител, что может усугубить течение болезни.
Известно, что CD5+-клетки временно увеличиваются в период латентного течения болезни в периферической крови и лим-фоидных органах овец в начальную и промежуточную стадии лейкоза. Количество CD5+- лимфоцитов в крови овец до заражения составляло 9,3±0,6 % у взрослых и 7,1±0,5 % у молодых овец (рис. 1), что превышало значения нормы для овец в возрасте 9-12 месяцев (3,98±0,9 %) [8]. Нарастание числа CD5+-клеток было установлено на 1-е и 12-е сутки эксперимента у взрослых и на 12-е у молодых овец.
Рост количества CD5+-клеток в этот период можно объяснить цикличным профилем лимфоцитоза, который так же характерен для коров на первых этапах развития болезни [8]. Похожая картина наблюдалась и при экспериментальном заражении телят, у которых увеличение числа CD5+-лимфоцитов проис-
12-* 10-е 20.е
Сутки иммунного отпета
■ 1 гр. атт
■ 2rp. CD2D 1 гр. СПГ.
SS2rp.CD5
Рис. 1. Количественная характеристика CD20+- и CD5+-ktctok в процессе иммунного ответа.
12-е 14-е 20.е
Сутки иммунного отпета
■ 1 гр. arm
Ж 2 гр. C172U 1 гр. СПГ. 5S2ip.CD5
Рис. 2. Количественная характеристика CD8- и CD4-лимфоцитов в процессе иммунного ответа.
ФО"1е3-^7 * 10. " Г1
14- 20-е * . .
Сутки иммунного ответа
■ 1 гр. CDS
■ 7 гр. ПИ 1 гр. С 04
S!Zip.CM
Рис. 3. Количественная характеристика СБ16+-лимфоцитов в процессе иммунного ответа.
ходило на 14-е сутки первичного иммунного ответа [3, 4].
Известно, что вирус лейкоза крупного рогатого скота, помимо В-клеток, может инфицировать CD4+- и CD8+ -лимфоциты, количество которых может изменяться в процессе болезни [6]. В результате проведенных исследований установлено, что количество Т-хелперов до заражения находилось в пределах физиологической нормы (8-22 %) [11] и у взрослых овец составляло 20,0±0,3 %, а у молодых 18,0±2,5 %. После заражения отмечалось некоторое снижение уровня CD4+-лимфоцитов, но на 10-е сутки у 1-ой группы показатели повысились с 3,0±0,8 % (7-е сутки) до 22,0±6,7 %, а у 2-ой группы животных с 8,0±2,6 % (7-е сутки) до 21,0±6,0 %, а затем снова снизились к 20-м суткам.
16
Динамика В-клеток в процессе иммунного ответа коррелирует с профилем Т-хелперов, что подтверждает их тесную взаимосвязь при инфицировании организма [5]. Параллельно с тем, что процент Т-хелперов оставался практически без изменений, при подсчёте количества CD8+-лимфоцитов было установлено достоверное увеличение их числа на 12-е сутки иммунного ответа у взрослых овец (36,4±10,0 %). Количество CD8+-клеток до заражения находилось в пределах физиологической нормы (4-22 %) [11] и у взрослых овец составляло 18,0±1,3 %, а у молодых 15,0±0,2 % (рис. 2). На первые сутки после заражения отмечалось нарастание числа CD8+-клеток (25,5±1,9 %) в 1-ой и во 2-ой группе овец (21,2±1,2 %), что может свидетельствовать о прайминге цитотоксических лимфоцитов, напрямую уничтожающих инфицированные вирусом клетки. Количество CD8+-лимфоцитов у взрослых овец в сравнении с фоном на 1-е сутки увеличилось на 7 %, а у молодых на 6 %. К 12-м суткам иммунного ответа относительное содержание ци-тотоксических Т-лимфоцитов повысилось на 18 % в первой и на 3 % во второй группе животных.
Характер изменений уровня лимфоцитов, экспрессирующих рецептор CD16, играющий важную роль в цитотоксических иммунных реакциях, был различен у опытных групп животных. Количество CD16+-лимфоцитов у взрослых овец до заражения находилось в пределах физиологической нормы (7,512,6 %) [9] и составляло 12,0±2,4 %, в то время, как у молодых число этих клеток было ниже - 6,2±0,12 %.
Уровень CD16+-лимфоцитов у молодых животных достоверно не повышался, а на 7-е и 20-е сутки резко снижался (рис. 3). Вероятно, это связано с низкими фоновыми показателями данных клеток в периферической крови молодых животных, что может способствовать усилению вирусной инфекции. Естественные киллеры подобно макрофагам способны вызывать гибель клеток-мишеней опсонизированных IgG (антителозависимая клеточно-опосредо-ванная цитотоксичность) [9]. Повышение уровня общих иммуноглобулинов класса
G на 7-е сутки после заражения привело к временному нарастанию числа эффектор-ных CD16+-клеток на 12-14-е сутки в 1-ой группе животных. Внутримышечное введение овцам крови инфицированной BLV коровы, по-видимому, не вызывает достаточной активации врожденного звена иммунитета в первые 10 суток после экспериментального заражения для подавления вирусной инфекции.
Заключение
В результате проведенных исследований, было показано, что клетки овец с фенотипом CD5+ / CD20+ являются наиболее уязвимыми мишенями BLV. Установлено, что развитие иммунного ответа при экспериментальном заражении овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота зависит от степени зрелости иммунной системы. Достоверных значений увеличения числа иммунокомпетентных клеток крови у молодых овец не было зарегистрировано. Параллельно было установлено значительное снижение числа В-, Т-, CD16+-клеток в первые сутки инфекции. Это может играть как отрицательную (недостаточность иммунного ответа), так и положительную роль (уменьшение иммунопатологических реакций) в иммуногенезе. При анализе данных о влиянии BLV на клетки взрослых животных не выявлено достоверного увеличения их количества в первые 10 суток иммунного ответа, кроме возрастания числа CD5+-клеток. Такая задержка ответа иммуно-компетентных клеток на инфекцию может в дальнейшем утяжелить лейкозный процесс. Вероятно, это следует рассматривать как результат адаптации вируса в клетках крови овец, экологической нишей которого является крупный рогатый скот.
Список литературы
1. Гулюкин М. И. Выявление специфических антител классов в и М к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотках крови / М. И. Гулюкин, О. В. Капустина, И. Ю. Ездакова, Т. В. Степанова, М. Аноятбеков // Вопросы вирусологии. №4, 2019. С. 173-177. Б01: 10.36233/0507-4088-2019-64-4173-177.
2. Григорьев А. Г. Динамика иммунного ответа при экспериментальном заражении овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота. /
17
А. Г. Григорьев // Ветеринария и кормление. №6, 2020. С. 16-18. DOI CrossRef:10.30917/ATT-VK-1814-9588-2020-6-4.
3. Ездакова И. Ю. Характеристика В1-клеток в процессе экспериментального лейкомогенеза / И. Ю. Ездакова, О. В. Капустина, М. И. Гулюкин, Т. В. Степанова// Вопросы вирусологии. Т. 65, №1, 2020. С. 35-40. DOI: 10.36233/0507-4088-2020-65-135-40.
4. Ездакова И. Ю. Определение В-клеток в крови крупного рогатого скота методом иммунопероксидаз-ного окрашивания / И. Ю. Ездакова, О. В. Капустина // Российская сельскохозяйственная наука. 2018. № 3. С. 40-43.
5. Ездакова И. Ю. Рецепторный профиль лимфоцитов крови вакцинированных овец / И. Ю. Ездакова, О. В. Капустина, С. В. Вальциферова // Ветеринария и кормление. 2019. № 4. С. 8-10. DOI: 10.30917/ATT-VK-1814-9588-2019-4-2.
6. Arnaud F. Emphasis on cell turnover in two hosts infected by bovine leukemia virus: A rationale for host susceptibility to disease / F. Arnaud, B. Mathieu, V. Fabian, O. Verlaeten [et al.] // Veterinary Immunology and Immunopathology. 2008. Vol. 125. № 1-2. P. 1-7. DOI: 10.1016/j.vetimm.2008.04.007.
7. Barez P.-Y. Recent Advances in BLV Research / P.-Y. Barez, D. A. Brogniez, A. Carpentier, H. Gazon, N. Gillet [et al.] // Recent Advances in BLV Research. Viruses. 2015, Vol. 7. P. 6080-6088. D01:10.3390/ v7112929.
8. Masahiko T. Ex vivo survival of peripheral blood mononuclear cells in sheep inducedby bovine leukemia virus (BLV) mainly occurs in CD5-B cells that express BLV / T. Masahiko, T. Shigeru, S.-N. Takeshima, K. Satoru, S. A. Yin, O. Kosuke, C. D. William, A. Yoko // Microbes and Infection. 2004. Vol. 6. № 6. P. 584-595.
9. Elhmouzi-Younes J. Ovine CD16+ / CD14- blood lymphocytes present all the major characteristics of natural killer cells / J. Elhmouzi-Younes, P. Boysen, D. Pende, A. K. Storset [et al.] // Vet. Res. 2010. Vol. 41. № 1. P. 1-12. DOI: 10.1051/vetres/2009052.
10. Porta N. G. Experimental infection of sheep with Bovine leukemia virus (BLV): Minimum dose of BLV-FLK cells and cell-free BLV and neutralization activity of natural antibodies / N. Gabriela Porta, I. Alvarez, G. Suarez Archilla [et al.] // Rev Argent Microbiol. 2019. Vol. 51. № 4. P. 316--323. D0I:10.1016/j.ram.2019.01.004.
11. Tizard I. Veterinary Immunology: An Introduction / I. Tizard // Philadelphia, W.B. Saunders Cp. Harcount Brace Jovanovich Inc. 2013. Vol. 1. P. 512.
^,\\1ИИ1Ш IIIIIIIIIIIII11111IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII11111IIIIIIIIIIIII11111IIIIIIIIII ШИШИ IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ШИШ IIIIIIIIII11111IIIIIIIIIIIIIIII N111IIIII11//^
I КАК ОФОРМИТЬ ПОДПИСКУ НА ЖУРНАЛ? !
= А. Через подписной каталог I
= Индекс в каталоге «Газеты. Журналы» Агентства «Роспечать» - 33184 =
| Б. Через редакцию журнала Ё
| Банковские реквизиты для оплаты подписки I
= по безналичному расчету для юридических лиц: =
1 ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» =
| ИНН 7802196720 КПП 781301001 }
| Р/с 40703810400000000022 в АО «Горбанк», г. Санкт-Петербург |
| К/с 30101810200000000814 БИК 044030814 |
| В поле «Назначение платежа» указать: =
= «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы =
| ветеринарной биологии» на 2022 г. согласно инф. письму б/н =
| от 03.09.18 г. НДС не облагается. Адрес подписки: ...» =
= Стоимость редакционной подписки на 2022 год: =
| 2400 рублей. I
Адрес редакции: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru
