CC BY
279
ОБЗОРЫ
СтволовыЕ клетки растений и животных: две стороны одной медали. часть 1
ДА. Зубов
Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина Биотехнологическая лаборатория ilaya.regeneration, Медицинская компания ilaya®, Киев, Украина
Plant and animal stem cells: two sides of the same medal
D.A. Zubov
State Institute of Genetic and Regenerative Medicine, National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kiev, Ukraine
Biotechnology laboratory ilaya.regeneration, Medical company ilaya®, Kiev, Ukraine
В обзоре представлен современный анализ данных по биологии стволовых клеток растений, функционированию меристем, механизмам регенерации и процессам опухолеобразования, а также биотехнологическим методам культуры растительных тканей. Сравниваются стволовые клетки растений и животных, рассматривается их возможное полифилетическое происхождение в аспекте концепции дивергентной эволюции многоклеточных модулярных и унитарных организмов в обоих царствах.
Ключевые слова: модулярные и унитарные организмы, стволовые клетки растений, меристемы, клональное микроразмножение, каллус, многоклеточность, растительные опухоли, фитогормоны, Arabidopsis thaliana, Agrobacterium tumefaciens.
введение
Многоклеточные организмы, растительные и животные, представляют собой сложные открытые живые системы, которые для поддержания своей структуры, уровня обмена веществ, энергии и процессов жизнедеятельности требуют, в числе прочего, строгого соблюдения баланса элиминации поврежденных, погибших, измененных клеток и их замещения новообразованными клетками в результате процессов физиологической и репаративной регенерации, протекающих под контролем иммунной системы. Способность к репарации тканей и систем поддержания гомеостаза у многоклеточного организма является важным эволюционным преимуществом, которое выражается как в эффективном выживании в пределах популяции и в условиях определенных местообитаний (жизненных эколого-социальных ниш) отдельной особи, так и в процветании биологического вида в целом. Внутренним залогом нормальной жизнедеятельности и самовоспроизведения отдельного организма, его роста, регенерации, размножения и старения, являются малочисленные популяции недифференцированных клеток — стволовых, способных как к самообновлению, так и к дифференцировке в различные дефинитивные клеточные типы, в целом формирующие клеточный дифферон, или, как говорят ботаники, гистоген, — интегральную единицу любой ткани многоклеточного организма, будь то растительного, или животного происхождения.
Целью обзора является современный анализ накопившихся данных по биологии стволовой клетки растений, в том числе механизмам регенерации,
e-mail: [email protected]
The review offers up-to-date analysis on plant stem cell biology, meristems functioning, including plant regeneration mechanisms and tumorigenesis, as well as biotechnology methods of plant tissue culture. There were also compared the plant and animal stem cells, their probable polyphyletic origin in aspect of divergent evolution of modular and unitary organisms in both plant and animal kingdoms.
Keywords: modular and unitary organisms, plant stem cells, meristems, clonal micropropagation, callus, multicellularity, plant tumors, phytohormones, Arabidopsis thaliana, Agrobacterium tumefaciens.
биотехнологическим методам культуры тканей, процессам опухолеобразования у растений.
ключевые различия растительного
и животного организмов
Растениям и животным присущи такие свойства живого, как рост (обеспечивается за счет митоти-ческого деления клеток), развитие, обмен веществ, раздражимость, половое размножение, способность в разной степени к физиологической и репаративной регенерации.
Животные, в основном, являются унитарными организмами, а растения — модулярными [1]. Так, например, человек, как унитарный организм, уже на ранних стадиях эмбриогенеза имеет черты внешнего строения взрослого индивида, которые сохраняются до самой его смерти. Строение такого унитарного организма строго детерминировано генетически.
Для модулярных растительных организмов характерно развитие из зиготы некоего модуля, определенной единицы строения, последовательно порождающей всё новые модули, схожие с первоначальными. То есть эмбрион модулярного организма не дифференцирован на органы. И только в результате его развития образуется неподвижный разветвленный организм. Развитие модулярных организмов строго не предопределено генетической программой и значительно зависит от их взаимодействий с окружающей средой. Между модулярными и унитарными организмами существуют следующие различия: 1) систематические признаки у разных видов модулярных организмов — это, как правило, признаки не целых организмов, а их модулей;
и 2) характер взаимодействия модулярных организмов с местообитанием определяется тем, как их модули размещены по отношению к модулям других организмов. Для перемещения модулярному организму нужно «перерастать» с места на место, или генерировать и отделять специализированные модули расселения, то есть растительный организм сам по себе неподвижен. Такой модулярный план строения позволяет растениям переносить существенные повреждения своей структуры посредством возобновления продолжительного и повторяющегося формирования (регенерации) новых структур и органов. По этой причине долгожителями среди всех ныне живущих организмов являются представители именно растительного царства. Так, возраст самых старых деревьев на Земле, согласно радиоуглеродному анализу, составляет 4,9 тыс. лет (единичные экземпляры) — это Сосна остистая (Р1пив aristata Епдв1т.), произрастающая в горах штата Невада в США и являющаяся его деревом-символом [2].
Кроме того, расселение животных и растений происходит в разные периоды онтогенеза. Животные расселяются в личиночном или во взрослом состоянии, а растения осваивают новые местообитания посредством абиотических (воздух, вода, огонь) или биотических (животные, человек) агентов распространения своих покоящихся зачатков — диаспор (спор, семян) [1].
Растениям присуще как половое, так и бесполое (вегетативное, спорами) размножение, а также их чередование. Однако одноклеточные низшие растения и простейшие животные порою морфологически трудно различимы. Рост растений практически непрерывен, а у большинства животных он ограничен определенным периодом онтогенеза.
Стереотипной реакцией на раздражитель у многоклеточных животных является рефлекс, а у растений — тропизмы и настии.
Более того, общее сходство строения и химического состава растительной и животной клетки указывает на общность их происхождения, вероятнее всего, от каких-либо водных одноклеточных или колониальных форм эукариот. Общим для обеих клеток является принципиальное единство их плана строения: плазмалемма с интегральными и поверхностными белками, цитоплазма, ядро, а также сходство протекания многих биохимических процессов в цитоплазме и ядре, единство принципа передачи наследственной информации при делении клетки — митотическом или редукционном, сходство строения и состава клеточных мембран. Ключевым отличием и наиболее ранним ароморфозом является наличие у растительной клетки клеточной стенки, в основном из целлюлозы, а также фотосинтезирующих пигментов, в основном различных модификаций хлоро-филлов. Далее, растительные клетки отличаются от животных наличием пластид с многокопийной кольцевой двуцепочечной ДНК, которые наследуются по материнской линии, а также наличием развитой сети крупных вакуолей, в значительной мере обусловливающих осмотические свойства этих клеток. Имеются различия и в механизмах обмена веществ и энергии у растений. Так, у клеток растений каналы эндоплазматической сети (десмотубулы) через поры в клеточной стенке сообщаются друг с другом. Для растительных клеток и тканей присущ энергозависимый симпластический транспорт пластических веществ через плазмодесмы — прямые цитоплазма-
тические межклеточные контакты (сравните с десмо-сомами животной клетки, обеспечивающие прочные механические межклеточные связи) и энергонезависимый апопластический транспорт минеральных веществ и воды через элементы клеточной стенки и межклетники. Запасными питательными углеводами (основной формой хранения глюкозы) животной клетки является гликоген, а растительной — крахмал и его модификации. Хлоропластам растительной клетки (одной из разновидностей пластид) присущ процесс фотосинтеза, определяющий автотрофный тип питания растений (животные — гетеротрофы). Синтез АТФ происходит в хлоропластах и митохондриях (у животных — в митохондриях). У высших растений и грибов отсутствуют центриоли [3].
Очевидны существенные различия и в механизмах защиты целостности организма у животных и растений от проникновения патогенов (чужеродных антигенов). Так, иммунная система долгоживущих многоклеточных организмов требует развития высокоспецифичных реакций иммунитета, формирования аутотолерантности к собственным антигенам и иммунологической памяти. Наиболее оптимального и невероятно сложного развития иммунная система достигла у челюстноротых позвоночных животных (Gnathostomata). У них относительно неспецифические реакции врожденного иммунитета эффективно дополняются совершенными реакциями адаптивного иммунного ответа. В сравнении с Gnathostomata, иммунная система растений, кажется, устроена менее сложно. Поскольку у растений отсутствуют мобильные иммунные клетки и секретируемые опсонины (антитела), то они не могут воспользоваться иммунными рецепторами (например, BCRs/TCRs рецепторами лимфоцитов) для обнаружения и последующей элиминации из своего организма чужеродных агентов. Тем не менее, растения способны формировать высокоспецифичный иммунный ответ с ограниченной аутореактивностью, и способны генерировать длительную память о проникших фитопатогенах [4]. Таким образом, ключевые свойства иммунитета позвоночных животных могут быть реализованы и в растениях, но с привлечением несколько иной иммунной стратегии в отсутствие специализированных иммунных клеток.
Кроме того следует отметить тот факт, что если для изучения генетики и биологии развития животных ключевым модельным организмом является Дрозофила фруктовая (Drosophila melanogaster Meigen, 1830), то подобным модельным объектом у растений, впервые предложенным для этих целей Фридрихом Лайбахом в 1943 г., является Ре-зушка Та ля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., 1842) из семейства Капустные (Brassicаceae). Растение-монокарпик, полностью заканчивающее свой цикл, от прорастания семени до созревания семян в плодах, за пару недель (рис. 1). Малый размер генома (около 157 млн. п.н.), ставшего первым полностью секвенированным геномом растения в 2000 г., делает A. thaliana удобным объектом для картирования генов и секвенирования [5]. В 1982 г. Светлана Савицкая, прибывшая на станцию «Салют-7», получила в дар от космонавтов биоблок с цветущими растениями резушки. Они впервые зацвели в космосе и в дальнейшем произвели на станции еще три поколения растений посредством семенного размножения. Затем их семена (около 200 шт.) были возвращены на Землю для дальнейших исследований.
Рис. 1. Arabidopsis thaliana (Резушка Таля) — модельный организм для изучения генетики и биологии развития высших растений; Краснодарский край, Абинский район, окр. пос. Ахтырский, (фото — Г. Окатов)
образовательные (меристематические)
ткани растений. Стволовые клетки растений
В каких же компартментах организма высших растений (подцарство Embryophyta) находятся стволовые клетки и как они функционируют? Для ответа на этот вопрос затронем некоторые аспекты индивидуального развития растительного организма.
Оплодотворение и развитие зародыша у цветковых растений. У цветковых растений (отдел Magnoliophyta) процесс оплодотворения делится на три фазы: опыление; прорастание пыльцы и рост пыльцевой трубки в тканях пестика; собственно оплодотворение с образованием зиготы. Зигота образуется при слиянии спермия пыльцевой трубки (мужской гаметофит) с яйцеклеткой зародышевого мешка (женский гаметофит). В зародышевом мешке происходит двойное оплодотворение (следующий ароморфоз): один из спермиев сливается с яйцеклеткой, дав начало диплоидному зародышу, другой — с центральной диплоидной клеткой с образованием триплоидной клетки, из которой возникнет эндосперм (расходуемая питающая ткань для развивающегося зародыша). Это уникальное явление впервые описал в 1898 г. русский цитолог и эмбриолог растений Сергей Гаврилович Навашин (1857-1930) [3].
После оплодотворения процесс зиготического эмбриогенеза (развития зародыша в оплодотворённой семяпочке/семени) у растений начинается с того, что расположенная в семязачатке зигота вытягивается и делится поперек с образованием апикальной и базальной клетки. Апикальная клетка формирует структуру — подвесок (суспензор), который по своему функциональному назначению аналогичен плаценте
млекопитающих. Подвесок способствует питанию зародыша, погружая его в эндосперм, и нередко приобретает свойства гаустории-присоски. Базальная клетка многократно делится и образует зародыш. В нем уже заложены основные структуры будущего растения: точка роста побега; гипокотиль — нижняя часть стебля зародыша, имеющего признаки корня; семядоли; зародышевый корешок. На последнем этапе созревания семена теряют значительное количество воды и переходят в состояние покоя, когда в тканях уменьшается содержание стимуляторов роста и увеличивается количество фитогормона-ин-гибитора (абсцизовой кислоты). Зародыш находится в состоянии покоя до прорастания. Во влажной среде начинается его рост, одновременно с которым происходит развитие первичных органов. В эмбриогенезе и раннем онтогенезе все ткани растения происходят из первичных меристем, вначале семени, затем формирующихся осевых органов, которые в дальнейшем образуют три первичные системы растительных тканей: покровную ткань (протодерму), проводящую ткань (прокамбий) и систему основных тканей (основную меристему) [3].
Меристемы у высших растений и органогенез. Органогенез взрослого растительного организма обеспечивается функционированием образовательных (меристематических) тканей, или меристем — от др.-греч. «меристос» (^spicxôç) — делящийся. Собственно меристемы формируют определенные функциональные центры — ниши, в которых находятся стволовые клетки, участвующие в процессах роста, физиологической и репаративной регенерации растительного организма. Определение стволовой клетки у растений близко перекликается с таковым у животных и человека. Это недифференцированные клетки, способные к симметричному и ассиме-тричному делению, длительному самообновлению и дифференцировке в один или несколько специализированных клеточных типов. Практически они могут дать начало не только определённой ткани, органу, но и целому растительному организму. Именно поэтому стволовые клетки всех типов меристем растений тотипотентны, — свойство, характерное исключительно для первых клеток дробления зиготы у животного организма.
Рассмотрим строение растительных меристем по Л.И. Лотовой [3]. Согласно генетической классификации выделяют первичные и вторичные меристемы (рис. 2).
Рис. 2.
Расположение меристем у растения на разных стадиях онтогенеза (по Л.И. Лотовой): А — зародыш; Б — зародыш на более поздней стадии развития; В — проросток с семядолями; Г — взрослое растение: первичные меристемы:
1) апикальная;
2) боковая;
3) вставочная;
вторичные меристемы:
4 — камбий,
5 — феллоген;
6 — семядоли
Первичные меристемы связаны с меристемами зародыша (семени) и апикальными меристемами осевых органов — побега и корня (эумеристемы взрослого растения), которые сформированы в конусах нарастания побега и корня. Первичные меристемы сохраняются на верхушках побегов, почек и корней, а у растений с отсутствием верхушечного роста — в основании междоузлий. Эти меристемы называются верхушечными и вставочными, соответственно.
Митотическая активность клеток меристемы различна. Наиболее активные в этом отношении мери-стематические инициальные клетки, или инициалии, которые, собственно, и являются sensu stricto истинными тотипотентными стволовыми клетками. Они могут делиться ассиметрично и давать начало не только стволовым (инициальным), но и производным от них транзиторным амплифицирующим клеткам. Транзиторные амплифицирующие клетки могут отличаться от инициальных формой, размерами, количеством вакуолей. Таким образом, увеличение общего объёма меристемы может быть следствием деления не только инициальных клеток, как это происходит в талломах некоторых бурых водорослей (отдел Phaeophyta), но и посредством чередующихся делений инициальной клетки и производных, причём большее количество делений приходится на производные клетки. Такая периодичность свойственна конусам нарастания большинства высших споровых растений. У семенных же растений инициальная клетка и производные морфологически неразличимы в меристеме [3].
Верхушечная (апикальная) меристема побега (АМП) состоит из центральной зоны, содержащей стволовые клетки — инициалии, туники — одного или нескольких слоев клеток, образующих периферическую зону меристемы — нишу, и корпуса — группы транзиторных амплифицирующих клеток, составляющих внутреннюю массу меристемы — колончатую (стержневую) зону. Клетки верхушечной меристемы дают начало листовым и почечным зачаткам (при-мордиям). Верхушечные меристемы, в том числе и прокамбий, обеспечивают первичный рост растения (вытягивание).
Верхушечная (апикальная) меристема корня (АМК) состоит из апикальной меристемы, представленной клетками-инициалиями, и прилегающей к ней части, которая состоит из производных инициалиями клеток — транзиторных амплифицирующих. Транзиторные амплифицирующие клетки образуют три четко различимых блока меристемы, или гистогенов, — дерматоген, периблему и плерому. Клетки плеромы уже на ранних стадиях роста корня вытягиваются, меняя паренхимную форму на прозенхимную, и деление их принимает упорядоченный характер, т.е. делятся только продольно, занимая при этом объем плеромы. В результате этого процесса появляется новый вид меристемы — прокамбий. После достаточного накопления клеточной массы в районе верхушечной меристемы, клетки прокамбия начинают делиться поперек, вытягиваются и образуют тяж, выходящий за пределы верхушечной меристемы [3].
АМП и АМК являются на настоящий момент наиболее изученными в плане генетического контроля их деятельности и имеют сходную структуру: они содержат пул стволовых клеток в центральной зоне (у резушки их около 100) и дифференцирующиеся клетки на периферии, которые дают начало разным типам тканей. Необходимым структурным элемен-
том апикальных меристем является организующий центр (ОЦ) в АМП и центр покоя (ЦП) в АМК. Это малочисленные группы клеток, митотически малоактивные, в отличие от остальных клеток меристемы. Так, известно, что ЦП у резушки состоит всего из четырех редко делящихся стволовых клеток [6].
Вставочные (интеркалярные) меристемы расположены между участками постоянных тканей в основании междоузлий. Инициальные клетки — парен-химные. Производные клетки вставочных меристем могут дифференцироваться в клетки всех типов постоянных тканей. Эти меристемы обеспечивают интеркалярный, или вставочный рост растений, что свойственно всем представителям семейства злаков (Poaceae), которые обладают полым стеблем — соломиной. У этих растений в узлах находится вставочная меристема, за счет чего стебель довольно быстро телескопически нарастает не только верхушкой, но и каждым узлом [3].
Вторичные меристемы развиваются позже, когда начинается вторичный рост — утолщение осевых органов (рост растения в толщину). Вторичный рост происходит после окончания первичного роста растительного организма и зависит от активности латеральных (боковых) меристем — камбия и фелло-гена. У большинства однодольных растений (класс Liliopsida) вторичные меристемы отсутствуют, следовательно, отсутствует и вторичный рост.
Камбий состоит из веретеновидных инициалей — узких, вытянутых клеток, и лучевых инициалей — клеток почти шаровидной формы. Инициальные клетки камбия возникают из производных клеток прокамбия, который, напомним, является первичной верхушечной меристемой стебля. Феллоген, или пробковый камбий, образуется из меристематически активных клеток, находящихся на поверхности или в толще органов растения.
Вторичными являются и раневые меристемы, которые образуются при повреждении тканей и органов взрослого растения. Клетки при этом начинают дедифференцироваться и активно делиться (явление соматического эмбриогенеза), образуя вторичную меристему — каллус, плотную ткань желтоватого цвета, состоящую из хаотично расположенных паренхимных клеток. Как у млекопитающих провизорная грануляционная ткань появляется в ответ на повреждение тканевой структуры (ранение), так и каллус заполняет рану, нанесенную растительному организму. Из каллуса может возникнуть любая ткань или орган. Каллус широко используется для клонального микроразмножения растений in vitro.
Производными апикальных меристем осевых органов являются меристемы специальные:
— протодерма — сформирована наружным слоем клеток верхушечной меристемы побега и корня; клетки протодермы в процессе развития дифференцируются в эпидерму на побеге или ризодерму на корне);
— основная меристема, дающая начало тканям паренхимы (основной ткани, выполняющей функцию хранения питательных веществ; обычно формируется в сердцевине многолетних стеблей, в луковицах, клубнях и корневищах, в плодах и семенах);
— прокамбий — сосудистая меристема, дающая начало первичным проводящим тканям — флоэме и ксилеме, а также камбию, из которого развиваются вторичные проводящие ткани (вторичные флоэма и ксилема) [3].
Фитогормоны, как регуляторы
морфогенетических и физиологических
процессов
Большинство физиологических процессов, в первую очередь рост и морфогенез растений, регулируется фитогормонами, в основном с аутокринным механизмом и низкой специфичностью действия, которые играют ведущую роль в адаптации растений к условиям среды. Иными словами, фитогормоны — это биологические активные вещества, регулирующие рост и развитие растения. Они осуществляют регуляцию морфогенетических и физиологических процессов на клеточном, тканевом и системном уровнях растительного организма. Все фитогормо-ны, в отличие от большинства гормонов животных, являются небелковыми и нелипидными низкомолекулярными веществами разной химической природы. Синтезировать фитогормоны потенциально способны любые клетки растительного организма. Известны следующие пять групп фитогормонов, выделяемых по функциональному действию: ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовая кислота, этилен и брассины (брассиностероиды). Условно, первые три группы фитогормонов, — ауксины, гиб-береллины и цитокинины и, частично, брассины, — можно отнести к веществам, стимулирующим рост и морфогенез, но абсцизовую кислоту и этилен относят к ингибиторам физиологических реакций. Гормоны растений можно разделить на производные мевалоновой кислоты: гиббереллины, абсцизины, фузикокцин и цитокинины; и производные аминокислот — ауксины (из триптофана) и этилен (из ме-тионина и аланина). Брассины являются веществами стероидной природы (С28Н48О6) и аналогами половых гормонов позвоночных животных [7, 8].
Биосинтез фитогормонов происходит в определенных частях растений: в конусах нарастания побегов продуцируется ауксин — индолил-3-уксусная кислота (ИУК), который близок по химическому строению к серотонину и мелатонину позвоночных. В тканях листовой пластинки вырабатывается кау-рен — основная молекула-предшественник синтеза гиббереллинов и абсцизовой кислоты, в апексах корней вырабатывается цитокинин кинетин, а в зоне растяжения корня — гиббереллины. Источником цитокинина зеатина является эндосперм прорастающих семян. Жасминовая кислота и жасмо-наты, вырабатывающиеся растениями в ответ на повреждение, имеют структурное сходство с про-стагландином Е у позвоночных. Абсцизовая кислота является также эндогенным провоспалительным цитокином и секретируется клетками млекопитаю-щий в ответ на стресс, например, при УФ-облучении культуры кератиноцитов [8]. Действующие концентрации гормонов растений находятся в пределах до 10-11 М [7].
Ауксины в культуре растительных тканей регулируют рост клеток растяжением, при повышенных концентрациях — деление клеток. В сочетании с цито-кининами они стимулируют органогенез и пролиферацию клеток. При клональном микроразмножении растений используют как природные ауксины (ИУК), так и их синтетические аналоги: ИМК (индолил-3-масляная кислота), ИПК (индолил-3-пропионовая кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК (нафтилуксусная кислота). К природным цитокининам относятся зеатин, кинетин (6-фурфури-
ламинопурин) и NN-дифенилмочевина (обнаружена в кокосовом молоке), а к синтетическим — 6-БАП (6-бензиламинопурин) [7].
Гиббереллины (около 60 соединений) стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. Наиболее известна гибберелло-вая кислота.
Абсцизины (абсцизовая кислота, АБК) и этилен ингибируют ростовые процессы и клеточную пролиферацию, а в сочетании с цитокининами и хлорхо-линхлоридом индуцируют органогенез [7].
Искусственно регулируя сочетание и концентрацию экзогенных фитогормонов можно контролировать выработку растительными культурами эндогенных гормонов с проявлением желаемых морфогенетических реакций каллуса. Существует даже правило Скуга — Миллера: если концентрации ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокини-нов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно ниже концентрации цитокининов, то образуются почки и побеги [9]. Иными словами, главная функция фитогормонов, реализуемая посредством контроля самообновления и дифферен-цировки растительных тканей и органогенеза, тесно связана с фитогормональной регуляцией развития и поддержания меристем.
Также известно, что фитогормоны не являются нейтральными веществами по отношению к клеткам животного происхождения, и реакция на них со стороны организма животного может быть как благоприятной, так и негативной, выражающейся в туморогенном действии, запуске оксидативного стресса, индукции воспалительных и аллергических реакций, а также усилении секреции определенных метаболитов [8].
Биотехнологические аспекты культуры
растительной ткани и методы клонального
микроразмножения
История вопроса. Историю становления культуры тканей и клеток растений можно проследить в обзоре R.J. Gautheret [10]. Впервые апикальную меристему побега растения описал немецкий физиолог и один из отцов эмбриологии Caspar Wolff в 1759 г.
[11]. Спонтанный процесс каллусообразования при заживлении ран коры у деревьев вяза (Ulmus glabra Huds.) в 1756 г. экспериментально выявил французский ботаник Henri-Louis Duhamel du Monceau [10]. После него процессы заживления ран у различных видов растений были описаны А. Trecul в 1853 г.
[12]. Два года спустя, J. Sachs (1880-1882) обобщил результаты, полученные при изучении формирования каллуса, образующегося при заживлении ран у растений [13]. Он предположил существование органоформирующих веществ, которые распределяются в растении полярно: в корне и стебле. Та же точка зрения была высказана и J. Wiesner в 1884 г., который обратил внимание на феномен перехода покоящихся клеток в делящиеся при заживлении ран у растений [14].
С. Rechinger в 1893 г. попытался определить экспериментально предел делимости растительных фрагментов, при котором все еще возможна пролиферация клеток в тканях. Он использовал
изолированные почки, фрагменты корней, стеблей и другие части растений. Такие эксплантаты помещались на поверхность песка, смоченного водопроводной водой. Он пришел к выводу, что развиваются только фрагменты толщиной более 1,5 мм. Он не использовал питательных веществ и не создавал асептических условий, поэтому его культуры вряд ли можно назвать культурой тканей в современном понимании. Тем не менее, пионерские эксперименты С. Rechinger отражали саму возможность получения культуры растительных тканей [15].
Впервые принципы культуры клеток растений были четко сформулированы G. Haberlandt в 1902 г. в его концепции культуры клеток in vitro, то есть вне организма растения [16]. В то время как C. Rechinger стремился определить пределы делимости растительных фрагментов, G. Haberlandt предположил, что пределов делимости не существует. Поэтому он выбрал для себя работу с единичными клетками, культивированными в питательном растворе Кнопа (Knops nutrient solution), где сахароза, аспарагин и пептон служили питательными веществами. Клетки сохранялись живыми в такой среде в течение 20—27 суток, но без образования каллуса. Он также показал, что клеточные деления происходят только в тонких срезах клубня картофеля и только в тех, что содержали сосудистый пучок. Однако G. Haberlandt так и не удалось получить каллусную культуру. Далее S. Simon в 1908 г. наблюдал развитие сегментов ствола тополя, которые формировали каллус, корни и почки. Таким образом, им была создана основа каллусной культуры и микроразмножения растений. Но его культуры существовали не в асептических условиях [17].
В то же самое время, в мире были достигнуты значительные успехи в культуре тканей животного происхождения. Наравне с работами R.G. Harrison (1907 г.), которому впервые удалось культивировать нейробласты лягушки в свернувшейся лимфе [18], французский хирург и биолог, лауреат Нобелевской премии в области медицины (1912 г.), почетный член Академии наук СССР Alexis Carrel и его сотрудники в 1912 г. разработали способ культивирования механически измельченных тканей животных в питательной среде из плазмы крови и фетальной сыворотки [19].
Только в 1939 г. произошел качественно новый скачок в культивировании растительных тканей — от концепции G. Haberlandt [16] до работ R.J. Gautheret, P.R. White и P. Nobecourt [20-22], которые независимо друг от друга получили бесконечную пролиферацию каллусных культур. Далее в 1957 г. F. Skoog и C. Miller привели концепцию гормонального контроля органогенеза [9], а в 1962 г. T. Murasige и F. Skoog разработали свою знаменитую MS среду с повышенным содержанием солей [23]. Новаторский подход к получению клеточных культур у растений, который состоит в изолировании и культивировании растительных протопластов (клеток с ферментативно удаленными клеточными стенками в питательных средах, содержащих ингибиторы биосинтеза клеточной стенки), предложил E.C. Cocking в 1960 г. [24]. В 1966 г. F.C. Steward et al. доказали тотипотентность стволовых клеток взрослых растений посредством регенерации полноценных растений моркови (Daucus carota L.) из единичной клетки [25]. А в 1984 г. R.B. Horsh et al. впервые получили трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum L.)
при помощи Т-ДНК Agmbacterium tumefaciens Smith & Townsend, 1907 [26].
Методы культуры растительных тканей. Одним из видов вегетативно размножения растений является клональное микроразмножение. Клональное микроразмножение — получение неполовым путем in vitro генетически идентичных исходному экземпляру особей. В основе метода лежит уникальная способность соматической растительной клетки реализовывать свою тотипотентность. Первоначально (с 1903 г.) термин «клон» (от др.-греч. KXœv — веточка, побег, отпрыск) относился к группе генетически идентичных растений, полученных не семенным (вегетативным) способом. Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Georges Morel, который в 50-60-х годах двадцатого века получил первые растения-регенеранты георгин, картофеля и орхидей [27, 28]. Благодаря его разработкам, виды и культивары орхидей стали общедоступными для комнатной культуры, а биотехнологические методы оздоровления культурных растений от фитовирусов до сих пор остаются актуальными.
Регенерацию растений из культуры ткани получают с использованием одного из трех методов: культуры зародыша, органогенеза, соматического эмбриогенеза. Согласно классификации Т. Murasige [23], процесс клонального микроразмножения можно осуществлять посредством: 1) активации пазушных меристем; 2) образования адвентивных почек/ побегов (почки/побеги, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих) тканями эксплантата; 3) формирования адвентивных побегов в каллусе; 4) индукции соматического эмбриогенеза в клетках эксплантата; 5) индукции соматического эмбриогенеза в каллусной ткани; 6) формирования придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).
Соматический эмбриогенез в культуре каллусной ткани. Наиболее активно на сегодняшний день используется техника индукции соматического эмбриогенеза в каллусной ткани. Каллусная ткань (каллус) возникает в месте ранения растения путем неорганизованной пролиферации предположительно де-дифференцированных клеток и является вторичной раневой меристемой, которая функционирует непродолжительное время. Каллус заполняет рану (замещает область дефекта), аккумулируя в своей массе питательные вещества для протекания процессов анатомической регенерации утраченного органа (модуля).
Культура каллуса in vitro осуществляется двумя способами: суспензионная культура в жидкой питательной среде; и культура на поверхности твердой агаризованной питательной среды в виде недифференцированного каллуса (рис. 3). В то время как культуры каллуса на твердой среде используется для получения растений-регенерантов (клональное микроразмножение), суспензионные культуры клеток растений активно используются в качестве биохимических модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, а также для изучения экспрессии генов. Их получают путем переноса микрофрагментов каллуса (инокулюма) в перемешиваемую жидкую питательную среду того же состава, что и среда, на которой выращивался каллус, но без добавления агара. Суспензии клеток-продуцентов используют для получения метаболитов — органических кислот, ферментов, алкалоидов, пигментов, белков,
аминокислот для различных отраслей промышленности и, что особенно ценно, для фармакологии. Например, самым известным веществом, вырабатываемым суспензионными культурами Тиса ягодного (Taxus baccata L.), является паклитаксель, обладающий выраженной противоопухолевой активностью в отношении рака молочной железы, яичников, легких и др. Суспензионные культуры являются также незаменимым объектом изучения в генетике и молекулярной биологии. Из них получают культуры изолированных протопластов для изучения метаболизма, поглотительной активности, соматической гибридизации и генетической инженерии растений [7, 24].
ЗЬ .-¿а
Рис. 3. Культура стволовых клеток растений: культура недифференцированной каллусной ткани проса обыкновенного (Panicum miliaceum L.), состоящая из тотипотентных стволовых клеток (высокорегенеративный морфотип — плотный, матовый, узловатый каллус желтоватого цвета с белыми вкраплениями диаметром 0,5 см); фото — А.И. Емец
Для получения первичных каллусных культур и индукции морфогенеза эксплантаты (фрагменты тканей различных органов высших растений: корни, листья, черешки, стебли, пыльники, зиготические зародыши) высаживают в пробирки, колбы, чашки Петри на базовые твердые агаризованные (0,7—0,8% агара) твердые питательные среды Мурасиге и Скуга (MS), Гамборга и Эвелега (В5), Лина и Стабы (LS), которые модифицируют по составу регуляторов роста и органических компонентов. Так, для регенерации растения из эксплантата/каллуса in vitro используют вышеперечисленные среды с высоким содержанием цитокининов: 6-бензиламинопурина (БАП), зеатина, 6-фурфуриламинопурина (кинетина) [7].
Иными словами, если, например, эксплантат черешка листа подвергнуть процедуре каллусогенеза путем культивирования с различными растительными гормонами и веществами, то клетки эксплантата могут сформировать in vitro зародышеподобную структуру — «соматический эмбриоид». Предположительно, формирование соматических эмбриоидов происходит либо за счет процесса дедифференци-ровки зрелых клеток из тканей эксплантата, либо за счет малодифференцированных клеточных элементов проводящей системы черешка листа (в других случаях это могут быть клетки камбия, коры, сердцевинной паренхимы). В итоге такого культивирования из эмбриоида, возникшего неполовым путем,
то есть не через стадию зиготического зародыша, можно получить полноценное растение-регенерант. В природе такие процессы происходят только внутри семяпочки [29].
В данном случае мы имеем дело с соматическим (неполовым) эмбриогенезом — искусственно индуцированным развитием зародыша практически из любой дифференцированной соматической клетки растительной ткани, в том числе из ткани эксплантата (прямой соматический эмбриогенез) или каллуса (непрямой соматический эмбриогенез). То есть, соматический зародыш — это обособленная двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой она происходит. Такие зародыши в дальнейшем могут развиваться и образовывать регенеранты через стадии развития нормальной зиготы [7, 29].
Для того чтобы искусственно инициировать соматический эмбриогенез в эксплантате/каллусе в питательную среду достаточно внести аналог ауксина — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д). Под действием этого фактора соматические клетки репрограммируются в эмбриональное состояние. Инициированная таким образом клетка ведет себя как зигота и в процессе формирования первичных структур зародыша формируются два меристемных очага — апикальные меристемы побега и корня. Возникшую биполярную структуру переносят в среду без гормонов. В точках меристемного роста активно синтезируются ауксины и цитокинины. Такой соматический зародыш проходит 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную и торпедовидную с конечной тенденцией развития в проросток, что совпадает со стадиями развития зиготического зародыша [7]. То есть, в процессе направленной индукции соматического эмбриогенеза in vitro эм-бриоиды развиваются в питательной среде, а не в семяпочке; они не переходят в состояние покоя, как это происходит в нормальном созревшем семени с зиготическим эмбриогенезом, а дают начало проростку.
Криохранение культур растительных клеток. Основным подходом к хранению культур растительных клеток является их криохранение при сверхнизких температурах жидкого азота с предварительным этапом замедления роста и подготовки к замораживанию. В общих чертах, отличительной особенностью процесса криохранения культур растительных клеток от такового культивированных клеток животных, является наличие этапа предварительного культивирования клеток в определенных условиях. При этом в питательную среду перед замораживанием добавляют различные вещества: 2—6% маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей; аминокислоты, такие как пролин (1 М, служит для связывания воды в клетке), аспарагин, у-аминомасляную кислоту; криопротектор диметилсульфоксид, который добавляют к среде в концентрации 2,5—10% на 48 ч. Кроме того, для растений умеренного климата перед криохранением применяют технику искусственного закаливания (адаптации к холоду), когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный процесс подготовки к периоду зимнего покоя. При этом клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8... +10°C, а затем при +2...+5°C в течение 1—6 нед. Также как и культивированные клетки животных, растительные клетки замораживаются с использованием извест-
ных криопротекторов (сахароза, ДМСО, глицерин и пр.) с определенным временем эквилибрации с ними и скоростью заморозки минус 1°С в мин. [7].
Искусственные семена. С развитием метода соматического эмбриогенеза, как способа размножения растений in vitro, появилась необходимость и в длительном сохранении получаемых эмбриоидов. С практической точки зрения интересной является технология использования таких соматических зародышей в качестве «искусственных семян», разработанная для разных видов растений, размножающихся исключительно вегетативно [29]. Ведь растения с желаемыми свойствами зачастую являются стерильными, а некоторые виды образуют семена с небольшим периодом жизнеспособности, которые трудно высушивать и продолжительно хранить в специализированных банках семян [30].
Прогрессивная технология инкапсуляции-дегидратации эмбриоидов в альгинатах позволила защитить соматические зародыши от механических повреждений. Помещенные в альгинат обезвоженные зародыши (не выше 20% воды) могут сохраняться при ультранизких температурах продолжительное время. Кроме того, альгинатная технология обеспечивает необходимый контроль водного баланса, питательных веществ и защиту от механических повреждений искусственных семян. Также известно, что высушивание неинкапсулированных соматических зародышей вызывает негативные изменения в метаболизме углеводов, которые ведут к крайне низкой выживаемости эмбриоидов после криохране-ния [29, 30].
Глоссарий
Адаптивная радиация — разветвление предкового ствола группы организмов в ходе приспособительной эволюции на обособленные ветви (филетические линии), связанное с развитием адаптации к разным условиям внешней среды и способам использования её ресурсов.
Антиклинальное деление клеток — митотическое деление, при котором делящиеся клетки в меристеме располагаются перпендикулярно основной оси побега/корня.
Ароморфоз (др.-греч. агрю — поднимаю, и рорф— — форма) — прогрессивное эволюционное изменение строения, приводящее к общему повышению уровня организации организмов; ароморфоз — это расширение жизненных условий, связанное с усложнением организации и повышением жизнедеятельности.
Биота — исторически сложившаяся совокупность видов живых организмов, объединённых общей областью распространения в настоящее время или в прошедшие геологические эпохи.
Геммула — покоящаяся внутренняя почка организма губок, представляющей собой шаровидное скопление тотипотентных стволовых клеток-тезоцитов.
Гетеробатмия — неодинаковый уровень специализации различных частей одного целого (организма, например), достигнутый в процессе биологической эволюции.
Гистоген(-ы) — слои, участки или зоны меристем в точках роста растения, предопределяющие формирование его первичной структуры или образование каких-либо специализированных тканей растения.
Диаспора — часть растения различной морфологической природы (спора, семя, плод, клубень и т.п.),
естественно отделяющаяся от материнского организма и служащая для размножения и расселения.
Зиготический зародыш — нормальный (половой) зародыш растения, развивающийся из зиготы.
Инициалии, или инициальные клетки — стволовые клетки апикальной меристемы побега и корня.
Искусственные семена — инкапсулированные и дегидратированные соматические эмбриоиды, которые можно хранить при ультранизких температурах в специализированных банках семян.
Каллус — вторичная раневая меристема, возникающая в месте травмирования ткани растения; широко используется для клонального микроразмножения растений in vitro.
Камбий — образовательная ткань (вторичная меристема) в стеблях и корнях преимущественно у двудольных покрытосеменных и голосеменных растений, дающая начало вторичным проводящим тканям и обеспечивающая их прирост в толщину.
Клональное микроразмножение — получение неполовым путем in vitro генетически идентичных исходному экземпляру особей.
Колумелла — специализированная ткань корня растения, вовлечённая в механизмы восприятия гравитации.
Культура ткани/клеток in vitro — метод сохранения жизнеспособности тканей или отдельных клеток вне организма in vitro (лат. — «в стекле») с созданием условий, обеспечивающих питание, газообмен и удаление продуктов метаболизма, а также асептических условий.
Неклеточные растения — это низшие растения, тело которых не разделено на отдельные клетки, а представляет собой одну гигантскую клетку со множеством ядер, например как у зеленых водорослей рода Caulerpa.
Опины — вещества-производные аминокислот, которые продуцируются аберрантно развитыми тканями растений и используются агробактериями в качестве источника питания.
Палинтомия — процесс последовательных клеточных делений без стадий роста и увеличения объема получающихся клеток; характерен для водорослей и простейших.
Параллельная эволюция или параллелизм — независимое развитие сходных признаков в эволюции близкородственных, но выделившихся групп организмов, протекающее в одном направлении; если организмы не близкородственны, то эволюция является конвергентной.
Парафилия — принцип эволюции групп организмов, заключающийся в независимом приобретении ними сходных черт строения на основании особенностей, унаследованных от общих предков; парафиле-тическими группами называют группы, включающие лишь часть потомков общего предка; в такую группу входит её общий предок, но не все его потомки ей принадлежат.
Партеногонидии — тотипотентные клетки, образующиеся в результате неполового размножения, путем многократных делений, которые затем развиваются во взрослую особь.
Плазмодий — любая многоядерная клетка, образовавшаяся не путём слияния нескольких клеток, а путём деления ядра исходной одноядерной клетки.
Полифилия — принцип эволюции групп организмов/таксонов, происходящих от разных предков, не
связанных близким родством; полифилетической в биологической систематике называют группу, в отношении которой считается доказанным более близкое родство составляющих её подгрупп с другими группами, не входящими в данную.
Примордии — листовые и почечные зачатки, генерируемые апикальной меристемой побега.
Растение-регенерант — растение, сформировавшееся в результате морфогенеза в культуре изолированных клеток или тканей растений.
Соматический эмбриоид — зародыш растения, развивающийся не из зиготы, а из соматической клетки растительной ткани.
Таллом, или слоевище — тело водоросли определённого строения.
Т-ДНК — одноцепочечный участок ДНК в виде опу-холь-индуцирующей вирулентной плазмиды (tumour-inducing (Ti) plasmid) у агробактерий, содержащая ключевые гены для индукции опухоли, интегрируется в геном клетки растения-хозяина.
Фитогормоны — это биологические активные вещества, регулирующие рост и развитие растения.
Фитопатоген — любой фактор, обычно живой организм, вызывающий болезни у растений.
Экологическая ниша — совокупность всех факторов природной среды, в пределах которых возможно существование того или иного вида организмов.
LECA-клетки (last eukaryotic common ancestor) — предполагаемый последний общий предок для всех эукариот.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Некое В.Е. Основы общей экологии и неоэкологии: учебное пособие. Ч. 2. Харьков: ХГУ; 1998: 156.
2. Weigel D., Jürgens G. Stem cells that make stems. Nature 2002; 415: 751-4.
3. Лотова Л.И. Морфология и анатомия высших растений. Москва: Эдиториал УРСС; 2001: 528.
4. Spoel S.H., Dong X. How do plants achieve immunity? Defence without specialized immune cells. Nature Reviews. Immunology 2012; 12: 89-100.
5. Meyerowitz E.M. Prehistory and history of Arabidopsis research. Plant Physiology 2001; 125: 15-9.
6. van den Berg C., Willemsen V., Hendriks G. et al. Short-range control of cell differentiation in the Arabidopsis root meristem. Nature 1997; 390: 287-9.
7. Широков А.И., Крюков Л.А. Основы биотехнологии растений. Электронное учебно-методическое пособие. Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет; 2012: 49.
8. Вильданова М.С., Смирнова Е.А. Характер влияния и специфичность действия растительных гормонов на клетки животных. Цитология 2016; 58(1): 5-15.
9. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology 1957; 54: 118-30.
10. Gautheret R.J. Plant tissue culture: a history. Bot. Mat. Tokyo 1983; 96: 393-410.
11. Cutter E.G. Recent experimental studies of the shoot apex and shoot morphogenesis. Bot. Rev. 1965; 31: 7-113.
12. Trecul A. Accroissement des vegetaux dicotyledones ligneux (reproduction du bois et de l'ecorce par le bois decortique). Ann. Sc. Nat. 1853; 19: 157-92.
13. Sacks J. Stoff und der Pflanzenorgane. Arch. Rot. Inst. Wurzburg. 1880-82; 2: 453, 689.
14. Wiesner J. Untersuchungen uber die Wachstumsbewegungen der Wurzel. Sitz. Akad. Wiss. Wien 1884; 89: 223.
15. Rechinger C. Untersuchungen uber die Grenzen der Teilbarkeit im Pflanzenreich. Abh. d. Zool. Bot. Ges. Wien 1893; 43: 310-34.
16. Haberlandt G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitz. Akad. Wiss. Wien 1902; 111: 69-92.
17. Simon S. Experimentelle Untersuchungen uber die Differezierungsvorgange im Callusgewebe von Holzgewachsen. Jahrb. f. Wiss. Bot. 1908; 45: 351-478.
18. Harrison R.G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1907; 4: 140-3.
19. Carrel A. On the permanent life of tissues outside of the organism. J. Exp. Med. 1912; 15: 516-28.
20. Gautheret R.J. Investigations on the root formation in the tissues of Helianthus tuberosus cultured in vitro. Amer. J. Bot. 1969; 56: 702-17.
21. White P.R. Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial medium. Amer. J. Bot. 1939; 26: 59-64.
22. Nobecourt P. Sur la perennite et l'augmentation de volume des cultures de tissus vegetaux. C.R. Soc. Biol. 1939; 130: 1270-1.
23. Murasige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962; 15: 473-97.
24. Cocking E.C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature 1960; 187: 927-9.
25. Steward F.C., Kent A.E., Mapes M.O. The culture of free plant cells and its signification for embryology and morphogenesis. Curr. Top. Dev. Biol. NY: Academic Press; 1966: 113-54.
26. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G., Sanders P.R., Lloyd A., Hoffmann N. Inheritance of functional genes in plants. Science 1984; 223: 496-8.
27. Morel G. Sur la culture des tissus de deux Monocotylédones. C.R. Ac. Sc. 1950; 230: 1099- 1101.
28. Morel G. La culture in vitro du méristème apical de certaines Orchidées. C.R. Ac. Sc. 1963; 256: 4955-7.
29. Gray D.J., Purohit A. Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology. Crit. Rev. Plant Sci. 1991; 10: 33-61.
30. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез как система in vitro размножения культурных растений. Физиология и биохимия культ. растений 2009; 41(6): 496-509.
Поступила: 10.08.2016
