CC BY
85
УДК [612.63:611.664]:599.323.4
ДОЛГИХ Ольга Васильевна, кандидат
биологических наук, старший преподаватель кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск). Автор 11 научных публикаций
АГАФОНОВ Юрий Витальевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск). Автор 140 научных публикаций, в т. ч. трех монографий и 15 учебных пособий
ЗАШИХИН Андрей Леонидович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск). Автор 240 научных публикаций, в т. ч. 9 монографий и 15 учебных пособий
СТРУКТУРНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ МИОМЕТРИЯ КРЫС В РАЗЛИЧНЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПЕРИОДЫ
Исследования гладкой мышечной ткани (ГМТ) матки крыс при беременности и после родов показали, что адаптация миометрия к повышению функциональной нагрузки характеризуется увеличением содержания цитоплазматического белка в гладких мышечных клетках, возрастанием доли малых миоцитов и сопровождается усилением пролиферативного потенциала во всех отделах матки. К концу гестации трансформация ГМТ разных отделов матки носит разнонаправленный характер. Послеродовая инволюция миометрия шейки протекает значительно медленнее, чем в рогах.
Ключевые слова: миометрий, изолированные гладкие миоциты, пролиферация, послеродовая инволюция, электронная микроскопия.
Гладкая мускулатура матки в процессе беременности и родов претерпевает существенные изменения. Физиологический рост матки во время беременности обеспечивается двумя механизмами: гиперплазией и гипертрофией гладких мышечных клеток (ГМК) [1, 2, 9, 11, 13]. Процесс структурной инволюции миометрия сопровождается возвращением структурных параметров матки к исходным величинам
© Долгих О.В., Агафонов Ю.В., Зашихин А.Л., 2013
(до беременности). Известно, что различные отделы матки различаются не только по анатомическому строению, соотношению тканевых компонентов, но и уровню функциональной активности [8, 13], так маточные рога являются местом имплантации зародыша, а шейка выполняет функцию сфинктера во время беременности. В ходе настоящего исследования был проведен сравнительный структурно-
метаболический анализ гладкомышечного компонента рогов и шейки матки интактных крыс на разных стадиях беременности и после родов. Целью данной работы являлось исследование структурно-функциональных закономерностей трансформации гладкой мышечной ткани рогов и шейки матки крыс в различные физиологические периоды.
Материалы и методы. Исследования проведены на 40 белых беспородных половозрелых крысах массой 200-250 г: первую (контрольную группу) составили небеременные крысы (n = 5), вторую - беременные самки (n = 35, по 5 особей на каждый период наблюдения). Экспериментальные исследования проводились в соответствии с «Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных» (1996) [7], а также с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Eutanasia IAVMA, 2001) [16]. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Образцы тканей рогов и шейки матки брали утром: у небеременных (интактных) крыс на стадии диэструса (контрольная группа), у беременных - на 4, 12 и 20-е сутки беременности и у родивших - на 1,
2, 4, 7-е сутки после родов.
Для морфометрического и цитофотометри-ческого анализа гладкой мышечной ткани отобранные фрагменты фиксировали при +5 °С в растворе 10-процентного формалина на фосфатном буфере при рН = 7,4 в течение 14-20 дней. Для анализа мышечной ткани использован метод прицельной клеточной диссоциации [5], позволяющий точно выделять фрагменты гладкой мускулатуры и осуществлять последующее разделение гладких мышечных клеток (ГМК). Выявление ДНК в ядрах клеток проводили по методу Фельгена с последующей цитоспектро-фотометрией на сканирующем цитофотометре МФТХ-2М (ЛОМО, Россия) при длине волны 546 нм. Контролем служили мазки, не подвергшиеся гидролизу в растворе соляной кислоты. Анализ содержания суммарного белка в цитоплазме проводили при окраске амидочерным. Препараты сканировали при длине волны 580 нм.
Окулярным микрометром измеряли длину и ширину клеток, малый и большой диаметры ядер. Объемы рассчитывали по формуле эллипсоида. Цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением среднего арифметического и его стандарной ошибки, коэффициента вариации, ассиметрии и эксцесса. Для сравнения двух независимых совокупностей по одному признаку при нормальном распределении количественных переменных использовали ^критерия Стьюдента. Обработка результатов проводилась с помощью программы «Statistica 6.0».
Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали в 2,5-процентном растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере с рН = 7,2-7,4 в течение 2 ч и последующей фиксацией в течение 1 ч в растворе 1-процентного тетраокисида осмия при t = +5 °С. Кусочки промывали в буфере, обезвоживали в спиртах с контрастированием в 70-градусном спирте и 1-процентном уранилацетатом в течение 12 ч. Заливали в смесь эпон-аралди-та. Для обеспечения прицельного электронномикроскопического анализа со всех блоков получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1-процентным раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов блоки затачивали и прицельные ультратонкие срезы готовили на ультратоме ГКВ-3, контрастировали в 2,5-процентном растворе уранилацетата и 0,3-процентном растворе цитрата свинца по Рейнольдсу. Просматривали в электронных микроскопах ШМ-100 СХ (Япония).
Результаты и обсуждение. Проведенное нами исследование структурно-метаболических параметров ГМК и структуры популяции мышечной ткани матки крыс показало неоднородность популяции по объемным показателям миоцитов, что позволило выделить в ГМТ матки 3 субпопуляции клеток: малые, средние и большие миоциты. Каждая субпопуляция миоцитов отличается уровнем синтеза ДНК и цитоплазматического белка. Основу популяции составляют средние миоциты.
При изучении механизмов трансформации ГМТ разных отделов матки крысы в ходе физиологической беременности получены следующие результаты. Анализ показателей изолированных миоцитов матки на 1-й неделе беременности показал статистически значимое снижение среднего клеточного объема ГМК всех отделов матки (р < 0,001), которое закономерно отразилось на структуре популяции. Это проявилось в увеличении доли малых миоцитов и уменьшении представительства больших клеток. К концу гестаци-онного периода средний клеточный объем ГМК в рогах матки увеличивался с 2721,77 до 5335,47 мкм3 (р < 0,001), а в шейке уменьшался до 2 525,12 мкм3 по сравнению с контрольной группой, где составлял 4192,67 мкм3 (р < 0,001). Выявленные изменения отражают структурные перестройки в популяции ГМК, которые в отделах имели разнонаправленный характер. Так, в рогах матки крыс отмечается снижение доли малых миоци-тов и возрастание количества больших до 44 %, а в шейке выявлено нарастание представительства средних клеток до 70 % (рис. 1).
Структурная перестройка сопровождалась увеличением синтеза ДНК в ядрах ГМК в ран-
ние сроки беременности во всех отделах матки (р < 0,001) (рис. 2), что выражалось в значительном увеличении содержания гипердипло-идных миоцитов. Перед родами наблюдается статистически значимое снижение доли гипер-диплоидных миоцитов (р = 0,013).
На протяжении всей беременности отмечалось увеличение показателя оптической плотности цитоплазмы (р < 0,001), отражающего содержание суммарного клеточного белка (рис. 2), при этом увеличение уровня цитоплазматического синтеза наблюдалось во всех клеточных субпопуляциях.
Изучение трансформации ГМТ рогов и шейки матки крыс при развитии беременности выявило различный характер изменений. В первую неделю происходит увеличение доли малых миоцитов и усиление синтеза ДНК в ГМК всех отделов матки, что является необходимым условием для поддержания структуры популяции и достаточного камбиального потенциала, обеспечивающего физиологическую трансформацию и адаптацию к изменяющимся функциональным нагрузкам.
Рис. 1. Структура популяции гладких мышечных клеток отделов матки в разные сроки беременности и после родов: 1 - небеременные животные, 2 - 4-е сутки беременности, 3 - 12-е сутки беременности, 4 - 20-е сутки беременности, 5 - 1-е сутки после родов, 6 - 2-е сутки после родов, 7 - 4-е сутки после родов, 8 - 7-е сутки после родов
Рис. 2. Относительная плотность ДНК в ядрах и относительная плотность суммарного белка в цитоплазме изолированных гладких миоцитов разных отделов матки: 1 - небеременные животные, 2 - 4-е сутки беременности, 3 - 12-е сутки беременности, 4 - 20-е сутки беременности, 5 - 1-е сутки после родов, 6 -2-е сутки после родов, 7 - 4-е сутки после родов, 8 - 7-е сутки после родов. Примечание: отличия статистически значимы: а - от величин параметров ГМК небеременных животных; Ь - от параметров ГМК на 20-е сутки беременности
Во второй половине беременности вследствие повышения функциональной нагрузки снижается уровень пролиферативной активности ГМК, активируются процессы цитоплазматического синтеза, увеличиваются объемные показатели миоцитов, что свидетельствует о функциональной зрелости контрактильной системы, необходимой для выполнения акта родовой деятельности. На поздних сроках мы наблюдали рост доли больших ГМК в рогах матки, а в шейке увеличивалось число средних
миоцитов - функционально-активной группы клеток, позволяющих выполнять шейке функцию сфинктера во время беременности.
По данным морфометрического исследования мазков изолированных гладких миоцитов матки крыс в период беременности отмечалась тенденция к увеличению отро стчатых ГМК и клеток с вакуолизированной цитоплазмой (рис. 3). После родов количество клеток с признаками дегенерации увеличивается, что подтверждается также результатами электронно-микроскопи-
Рис. 3. Деструктивно измененные ГМК рогов матки крыс при развитии беременности. Вакуоли (стрелки). Окраска гематоксилин-эритрозин. Ув. *400
ческого исследования. Среди миоцитов были выявлены клетки с признаками дегенерации. В цитоплазме этих клеток наблюдались участки деструкции миофиламентов, образование многочисленных вакуолей, содержащих лизируе-мые компоненты клетки (рис. 4).
В первые дни после родов характер изменения структуры популяции ГМК в разных отделах был также различным. В рогах матки с 1-го по 4-й день после родов наблюдалось уменьшение среднего объема ГМК с 3043,47 до 2307,11 мкм3, что отразилось на структуре популяции и про-
Рис. 4. Ультраструктура гладкой мышечной ткани шейки матки крысы в период ранней послеродовой инволюции: ГМК - гладкий миоцит, МФ - миофиламенты, ДМ - участки деструкции миофиламентов, МТ - миелиновые тельца. Ув. *33000
Дистрофически измененные миоциты могут быть причиной различных осложнений, связанных с нарушением сократительной деятельности миометрия в акте родов (слабость родовых сил) и в послеродовом периоде (атонические кровотечения) [1]. В работе В.И. Цир-кина с соавт. [6] описывается повреждение миоцитов матки женщин в процессе родов (особенно затяжных), что очевидно может приводить к изменению функционального состояния миометрия. Наши данные подтверждают мнение ряда авторов о том, что в миометрии перед родами и в послеродовой период определяются апоптотически измененные миоциты [10, 14].
явилось ростом доли малых миоцитов до 14 %. В шейке матки в 1-й день послеродовой инволюции наблюдалось увеличение показателя среднего объема миоцитов (6067,16 мкм3), что обусловило рост числа больших миоцитов до 50 %, в последующие дни наблюдалось уменьшение среднего объема клеток (до 3627,69 мкм3) и увеличение доли малых клеток. К 7-му дню структура популяции гладких миоцитов рогов близка к параметрам дородовой матки, в шейке преобладают малые клетки. Структурные перестройки сопровождаются увеличением уровня синтеза ДНК и возрастанием доли гиперди-плоидных клеток во всех отделах матки в 1-й день после родов. К 7-му дню наблюдается
угнетение синтеза ДНК в рогах, в то же время в ГМК шейки матки наблюдается повышение уровня синтеза ДНК.
В период ранней послеродовой инволюции матки происходит быстрый возврат массы органа к его состоянию до беременности, который обеспечивается, с одной стороны, уменьшением размеров миоцитов, а с другой - массовой элиминацией ГМК посредством апоптоза [9,
10, 15]. Увеличение интенсивности апоптоза связано с ростом числа клеток с признаками их терминальной дифференцировки [4].
К 7-м суткам послеродовой инволюции миометрий рогов имеет популяционные по-
казатели, близкие к параметрам контрольной группы (небеременные животные), что говорит
о завершении в ней инволютивных преобразований. В то же время в ГМК шейки матки наблюдается повышение уровня синтеза ДНК, активируются процессы пролиферации, которые имеют адаптивный характер, что сопровождается увеличением представительства малых миоцитов в структуре популяции. Полученные нами результаты подтверждают данные других исследователей о том, что инволютивные пре-образования в миометрии шейки протекают значительно медленнее, чем в рогах матки [3].
Список литературы
1. Бесков В.Н. Морфологические и гистохимические изменения миометрия в процессе беременности: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Караганда, 1973. 35 с.
2. Дубинин Е.В. Морфологические преобразования в миометрии крыс во время беременности и в раннем послеродовом периоде: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Новосибирск, 2005. 30 с.
3. Колпакова Е.В. Прогнозирование темпа послеродовой инволюции матки: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Томск, 2007. 26с.
4. Мышечные ткани / Е.А. Шубникова, Н.А. Юрина, Н.Б. Гусев и др. М., 2001. 240 с.
5. Пат. 2104524 РФ, RU С1. Способ получения препаратов изолированных клеток / Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., Лисишников Л.В. (РФ). № 94018751/14. Заявл. 23.05.1994; Опубл. 10.02.98. Бюл. № 4.
6. Повреждение гладкомышечных клеток матки женщин в родах / В.И. Циркин, Б.И. Медведев, Н.Г. Гребенюк и др. // Акушерство и гинекология. 1986. № 12. С. 25-28.
7. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Вашингтон, 1996. 138 с.
8. Савицкий Г.А., Савицкий А.Г. Миома матки (проблемы патогенеза и патогенетической терапии). 3-е изд. СПб., 2003. 236 с.
9. Шкурупий В.А., Дубинин Е.В., Дубинина H.H. Динамика миоцитов разных типов в миометрии крыс в периоды беременности и ранней послеродовой инволюции // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2008. Прил. 1. С. 101-104.
10. Шкурупий В.А., Дубинин Е.В., Дубинина H.H. Структурные преобразования миоцитов в периоды беременности и ранней послеродовой инволюции матки // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2008. Прил. 1. С. 97-100.
11. Afting E.G., Elce J.S. DNA in the Rat Uterus Myometrium during Pregnancy and Postpartum Involution. Measurement of DNA in small pieces of mammalian tissue // Analyt. Biochem. 1978. V. 86, № 1. P. 90-99.
12. Expression and Localization of Alpha-smooth Muscle and Gamma-actins in the Pregnant Rat Myometrium / O. Shynlova, P. Tsui, A. Dorogin et al. // Biology of Reproduction. 2005. V. 73, № 4. P. 773-780.
13. Leppert P.C. Proliferation and Apoptosis of Fibroblasts and Smooth Muscle Cells in Rat uterine Cervix Throughout Gestation and the Effect of the Antiprogesterone Onapristone // Am. J. Obstet. Gynecol. 1998. V. 178. P. 713-725.
14. Lye S.J. Initiation of Parturition // Anim. Reprod. Sci. 1996. V 42. P. 495-503.
15. Myometrial Apoptosis: Activation of the Caspase Cascade in the Pregnant Rat Myometrium at Midgestation /
O. Shynlova, A. Olde^of, A. Dorogin et al. // Biology of Reproduction. 2006. V. 74, № 5. P. 839-849.
16. Report of the AVMA Panel on Euthanasia // JAVMA. 2001. V. 218, № 5. Р. 669-696.
References
1. Beskov VN. Morfologicheskie i gistokhimicheskie izmeneniya miometriya vprotsesse beremennosti: avtoref. dis. ... kand. med. nauk [Morphological and Histochemical Changes in the Myometrium During Pregnancy: Cand. Med. Sci. Diss. Abs.]. Karaganda, 1973. 35 p.
2. Dubinin E.V. Morfologicheskie preobrazovaniya v miometrii krys vo vremya beremennosti i v rannem poslerodovom periode: avtoref. dis. ... kand. med. nauk [Morphological Changes in the Rat Myometrium During Pregnancy and Early Postpartum Period: Cand. Med. Sci. Diss. Abs.]. Novosibirsk, 2005. 30 p.
3. Kolpakova E.V. Prognozirovanie tempa poslerodovoy involyutsii matki: avtoref. dis. ... kand. med. nauk [Predicting the Rate of Postpartum Involution of Uterus: Cand. Med. Sci. Diss. Abs.]. Tomsk, 2007. 26 p.
4. Shubnikova E.A., Yurina N.A., Gusev N.B., et al. Myshechnye tkani [Muscle Tissue]. Moscow, 2001. 240 p.
5. Zashikhin A.L., Agafonov Yu.V., Lisishnikov L.V. Sposobpolucheniyapreparatov izolirovannykh kletok [Method of Obtaining Isolated Cell Preparations]. Patent RF, no. 2104524 RU C1. Byul, 1998. no. 4.
6. Tsirkin VI., Medvedev B.I., Grebenyuk N.G., et al. Povrezhdenie gladkomyshechnykh kletok matki zhenshchin v rodakh [Damage to the Smooth Muscle Cells of the Uterus of Women During Labour]. Akusherstvo i ginekologiya, 1986, no. 12, pp. 25-28.
7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington, D.C., 1996. 137 p.
8. Savitskiy G.A., Savitskiy A.G. Mioma matki (problemypatogeneza ipatogeneticheskoy terapii) [Uterine Fibroid (Pathogenesis and Pathogenetic Therapy)]. 3rd ed. St. Petersburg, 2003. 236 p.
9. Shkurupiy V.A., Dubinin E.V., Dubinina H.H. Dinamika miotsitov raznykh tipov v miometrii krys v periody beremennosti i ranney poslerodovoy involyutsii [Dynamics of Different Types of Myocytes in the Rat Myometrium During Pregnancy and Early Postpartum Involution]. Byulleten’ eksperimental’noy biologii i meditsiny, 2008, suppl. no.1, pp. 101-104.
10. Shkurupiy V.A., Dubinin E.V., Dubinina H.H. Strukturnye preobrazovaniya miotsitov v periody beremennosti
i ranney poslerodovoy involyutsii matki [Structural Changes in Myocytes During Pregnancy and Early Postpartum Involution of Uterus]. Byulleten ’eksperimental’noy biologii i meditsiny, 2008, suppl. no. 1, pp. 97-100.
11. Afting E.G., Elce J.S. DNA in the Rat Uterus Myometrium During Pregnancy and Postpartum Involution. Measurement of DNA in Small Pieces of Mammalian Tissue. Analyt. Biochem., 1978, vol. 86, no. 1, pp. 90-99.
12. Shynlova O., Tsui P., Dorogin A., et al. Expression and Localization of Alpha-Smooth Muscle and Gamma-Actins in the Pregnant Rat Myometrium. Biology of Reproduction, 2005, vol. 73, no. 4, pp. 773-780.
13. Leppert P.C. Proliferation and Apoptosis of Fibroblasts and Smooth Muscle Cells in Rat Uterine Cervix Throughout Gestation and the Effect of the Antiprogesterone Onapristone. Am. J. Obstet. Gynecol., 1998, vol. 178, pp. 713-725.
14. Lye S.J. Initiation of Parturition. Anim Reprod Sci., 1996, vol. 42, pp. 495-503.
15. Shynlova O., Oldenhof A., Dorogin A., et al. Myometrial Apoptosis: Activation of the Caspase Cascade in the Pregnant Rat Myometrium at Midgestation. Biology of Reproduction, 2006, vol. 74, no. 5, pp. 839-849.
16. Report of the AVMA Panel on Euthanasia. JAVMA, 2001, vol. 218, no. 5, pp. 669-696.
Dolgikh Olga Vasilyevna
Department of Histology, Cytology and Embryology, Northern State Medical University (Arkhangelsk, Russia)
Agafonov Yury Vitalyevich
Department of Histology, Cytology and Embryology, Northern State Medical University (Arkhangelsk, Russia)
Zashikhin Andrey Leonidovich
Department of Histology, Cytology and Embryology, Northern State Medical University (Arkhangelsk, Russia)
STRUCTURAL TRANSFORMATION OF RAT MYOMETRIUM IN VARIOUS PHYSIOLOGICAL PERIODS
Investigations of smooth muscular tissue (SMT) of rat uterus during the period of pregnancy and post partum showed that myometrium adaptation to the increasing function load was characterized by increased content of cytoplasmic protein in the smooth muscular cells. At the same time small myocytes increased in number, and proliferation potential in all parts of the uterus was enhanced. By the end of gestation, transformation of SMT in different parts of uterus was multidirectional. We found that postpartum involution of cervix myometrium is much slower than that in the horns.
Keywords: myometrium, isolated smooth myocytes, proliferation, postpartum involution, electron microscopy.
Контактная информация: Долгих Ольга Васильевна адрес: 163000, г. Архангельск, просп. Троицкий, д. 51;
e-mail: olvado@mail.ru; Агафонов Юрий Витальевич адрес: 163000, г. Архангельск, просп. Троицкий, д. 51;
e-mail: agafonov-y@mail.ru; Зашихин Андрей Леонидович адрес: 163000, г. Архангельск, просп. Троицкий, д. 51;
e-mail: kafgist@nsmu.ru
Рецензент - Циркин В.И., доктор медицинских наук, профессор кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета
