СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СЕМЕННИКАХ КРЫС ВТОРОГО ПОКОЛЕНИЯ, ПОЛУЧЕННОГО ОТ ЖИВОТНЫХ, РАЗВИВАВШИХСЯ В УСЛОВИЯХ ХОЛЕСТАЗА У МАТЕРИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

# BIOMEDICAL AND BASIC RESEARCH

УДК 611.631.018:616.36-008.811.6-055.26]-092.9 _ _

Я. Р. МАЦЮК, Е. М. ФЕДИНА, Е. Ч. МИХАЛЬЧУК, Е. А. ПОПЛАВСКАЯ, С. А. АЧИЛОВА СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СЕМЕННИКАХ КРЫС ВТОРОГО ПОКОЛЕНИЯ, ПОЛУЧЕННОГО ОТ ЖИВОТНЫХ, РАЗВИВАВШИХСЯ В УСЛОВИЯХ ХОЛЕСТАЗА У МАТЕРИ

Гродненский государственный медицинский университет, Республика Беларусь

Y. R. MATSYUK, K. М. PHEDINA, E. C. MIKHALCHUK, E. A. POPLAVSKAJA, S. А. ACHILOVA

STRUCTURAL CHANGES IN TESTES OF SECOND GENERATION RATS RECEIVED FROM

ANIMALS DEVELOPED IN THE CONDITIONS OF MATERNAL CHOLESTASIS

Grodno State Medical University, Republic of Belarus

ш резюме

Введение. Клинически и экспериментально доказано отрицательное влияние холестаза матери на потомство первого поколения - его физическое развитие и органогенез. Особенно при этом страдают семенники.

Цель исследования - установление характера и выраженности структурных изменений семенников крыс второго поколения, рожденных от спаривания опытных самок и самцов первого поколения, которые развивались в условиях холестаза у матери.

Материал и методы. Исследование проведено на 36 крысятах второго поколения, из которых 24 получены от спаривания самцов и самок первого поколения, развивавшихся в условиях экспериментально моделируемого на 17-й день беременности подпе-ченочного обтурационного холестаза, остальные 12 крыс - интактные животные (контроль). Забор материала осуществляли на 15-е и 45-е сутки после рождения животных. В работе использовали хирургический, гистологический, морфометрический и статистический методы исследования.

Результаты. В семенниках 15- и 45-суточных опытных крысят второго поколения, полученного от животных первого поколения, развивавшегося в условиях холестаза у матери, имеет место отечность интерстиция семенников. В межканальцевой

строме изменяется число интерстициальных эндо-криноцитов, которые отличаются полиморфизмом. Их цитоплазма микровакуолизирована. На 5-е сутки постнатального развития семенные канальцы семенников опытных животных сужены, прямолинейны, их количество на единицу площади увеличено. На 45-е сутки число семенных канальцев снижено, встречаемость семенных канальцев с прямолинейным ходом меньше. Толщина эпителиосперматогенного слоя у крысят обеих возрастных категорий снижена.

Заключение. У крыс второго поколения, полученного от спаривания самцов и самок, которые развивались в условиях эндогенной интоксикации, обусловленной холестазом у матери, имеет место задержка развития семенников и становления их структурных свойств, приводящая к нарушению процессов сперматогенеза.

ключевые слова: СЕМЕННИК, ХОЛЕСТАЗ,

- „

ВТОРОЕ ПОКОЛЕНИЕ, ПОСТНАТАЛЬНЫИ ОНТОГЕНЕЗ.

и abstract

Introduction. It is clinically and experimentally proved the negative effect of maternal cholestasis on the first generation offspring: its physical development and organogenesis. Especially in this case, the testes suffer.

The aim of the study is to establish the nature and severity of structural changes in the second generation rat

testes, born from the mating of experienced females and males of the first generation, which developed in maternal cholestasis conditions.

Material and methods. The study was conducted on 36 second-generation rat pups. 24 rats were obtained from mating of males and first-generation females that developed under conditions of the subhepatic obstructive cholestasis experimentally modeled on the 17th pregnancy day. 12 rats were intact animals (control). Material was taken on the 15th and 45th day after the animal birth. Surgical, his-tological, morphometric and statistical research methods were used in the study.

Results. In the testes of 15- and 45-day-old experimental rats of the second generation, obtained from animals of the first generation, developed under maternal cholestasis conditions, there is swelling of the testes. In the intercanalicular stroma, the number of interstitial en-docrinocytes changes, which have polymorphism. Their cytoplasm is microvacuolized. On the 5th day of postnatal development, the seminiferous tubules of the experimental animal testes are narrowed, rectilinear; their number per unit area is increased. On the 45th day, the number of seminiferous tubules is reduced; the seminiferous tubules amount with a rectilinear course is less. The thickness of the epithelial spermatogenic layer in rats of both age categories is decreased.

Conclusion. In rats of the second generation, obtained from mating of males and females that developed under endogenous intoxication conditions due to maternal cholestasis, there is a delay in the testes development and their structural properties establishment, leading to sper-matogenesis disruption.

key words: TESTIS, CHOLESTASIS, SECOND

V -

GENERATION, POSTNATAL ONTOGENESIS.

введение

Клинически и экспериментально доказано отрицательное влияние холестаза матери на потомство первого поколения: его физическое развитие и органогенез [12, 10, 3, 7, 2]. Особенно при этом страдают семенники. Наблюдается задержка их структурного и цитохимического становления, в клетках эпителиосперматогенно-го слоя развиваются разнообразные деструктивные изменения, а оплодотворяющая способность самцов снижается до 42,9 % [5, 9]. Вызывает интерес тот факт,

что у потомства второго поколения, которое получено от спаривания самцов, рожденных от самок с холеста-зом, вызванным в период беременности, с интактными самками, в семенниках отмечаются такие же изменения: регистрируется отставание в приросте массы, а также деструкция клеток сперматогенного эпителия извитых семенных канальцев [8]. Аналогичные изменения выявляются в семенниках потомства второго поколения, рожденного от самок, развивавшихся в условиях холестаза матери [6], при спаривании их с интактными самцами. Какие изменения будут в семенниках у животных второго поколения, полученного от спаривания опытных самцов и самок первого поколения, развивавшихся в условиях холестаза матери, не изучено.

цель исследования - установление характера и выраженности структурных изменений семенников крыс второго поколения, рожденных от спаривания опытных самок и самцов первого поколения, которые развивались в условиях холестаза у матери.

материал и методы

Исследование проведено на 36 крысах второго поколения, из которых 24 получены от спаривания самцов и самок первого поколения, развивавшихся в условиях экспериментально моделируемого на 17-й день беременности подпеченочного обтурационного холестаза. При этом необходимо отметить сложность и многоэтапность эксперимента: хирургическим путем создать у беременных крыс подпеченочный обтурационный холестаз [4], получить потомство, по достижении им 90-дневного возраста произвести спаривание (исключив близкородственное скрещивание) и у полученного потомства - забор материала для исследования. Остальные 12 крыс - интактные животные (контроль). Эксперимент проводился в соответствии с принципами биоэтики и требованиями Директивы Европейского Парламента и Совета № 2010/63/ EU от 22.09.2010 г о защите животных, использующихся для научных целей [13].

По достижении 15- и 45-суточного возраста крыс взвешивали и усыпляли парами эфира с последующей декапитацией. Животных вскрывали и выделяли семенники, которые после взвешивания фиксировали в жидкости Карнуа и заключали в парафин. На микротоме (Leica RM 2125 RTS) готовили парафиновые срезы толщиной 5 и 10 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином и по Шабадашу (для выявления в структурах семенников гликопротеинов с последующей визуальной оценкой их

содержания) [11]. На окрашенных препаратах проводили гистологический и морфометрический анализы. Изучение препаратов, их морфометрию и фотографирование осуществляли с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Carl Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы анализа изображений Image Warp (Bit Flow, США).

Полученные данные подвергали параметрической статистической обработке, используя пакет программ Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный номер 31415926535897). При проведении описательной статистики рассчитывали показатели: М - средняя арифметическая, m - ошибка средней арифметической. Сравнение групп по одному признаку выполняли с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5 % (p < 0,05) [1].

результаты и обсуждение

Абсолютная масса 15-суточных крысят, полученных от спаривания животных, развивавшихся в условиях хо-лестаза у матери, снижена (16,9 ± 0,2 г при 18,6 ± 0,3 г в контроле, р < 0,001). Аналогичным изменениям подвержена масса их семенников. К 45-му дню после рождения показатели не только не нормализовались, а даже проявляли тенденцию к увеличению.

В семенниках 15-суточных опытных крысят имеет место незначительная по выраженности отечность ин-терстиция, особенно в центральной части органа. Число интерстициальных эндокриноцитов в межканальцевой строме семенников опытных животных значительно больше, чем у крыс такого возраста контрольной группы (табл.). Эндокриноциты отличались выраженным полиморфизмом, при этом среди них, как правило, преобладали малые формы. Их цитоплазма слабо оксифильна, характеризуется наличием микровакуолизации, содержание в ней оксифильной зернистости значительно снижено. Ядра многих интерстициальных клеток подвержены пикно-зу, что свидетельствует о продолжающейся инволюции. Исследуемые клетки у этих животных располагались в основном вблизи кровеносных капилляров, просвет которых сужен, поэтому многие из них слабо различимы на гистологических препаратах. Семенные канальцы также сужены, прямолинейны, особенно в периферической части органа, их число на единицу площади среза увеличено по сравнению с таковым в контроле (рис. 1).

Рисунок 1 - Общий вид семенных канальцев 15-суточных крысят контрольной (А) и опытной (Б) групп.

Семенные канальцы опытной группы меньшего диаметра, практически лишены первичных сперматоцитов, отечность интерстиция. Цифровая микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200

Толщина эпителиосперматогенного слоя снижена, несмотря на то, что количество сперматогоний - в пределах контрольных значений (табл.).

Первичные сперматоциты единичны (рис. 1Б). Размеры их ядер, как и у сперматогоний, проявляли тенденцию к уменьшению. Вторичные сперматоциты, как и в группе контроля (рис. 1А), отсутствовали. Число поддерживающих клеток в канальцах незначительно уменьшено, при этом размеры их ядер существенно не менялись. Незначительно снижалась фоновая окраска соединительнотканных оболочек семенных канальцев, стенок перитубулярных артериол и цитоплазмы интерстициальных клеток при обработке срезов на выявление в них гликопротеинов.

У 45-суточных опытных крысят второго поколения, полученного от животных первого поколения, развивавшегося в условиях холестаза, имела место отечность

Таблица - Морфометрические показатели семенников крыс второго поколения, полученного от животных первого поколения, развивавшегося в условиях холестаза у матери (М ± т)

Показатели 15-е сутки 45-е сутки |

Контроль Опыт Контроль Опыт

Число интерстициальных клеток (40 * 10) 1,54 ± 0,23 4,36 ± 0,19 * 6,48 ± 0,24 2,82 ± 0,30 *

Число перитубулярных кровеносных капилляров (40 * 10) 5,39 ± 0,29 4,05 ± 0,62 3,84 ± 0,19 1,89 ± 0,19 *

Их диаметр (мкм) 4,45 ± 0,21 2,81 ± 0,69 * 7,04 ± 0,36 3,46 ± 0,75 *

Число семенных канальцев в поле зрения (20 * 16) 38,67 ± 0,69 60,60 ± 7,03 * 12,13 ± 0,38 9,04 ± 0,19 *

Толщина эпителио-сперматогенного слоя в канальце (мкм) 19,43 ± 0,59 17,35 ± 0,44 47,33 ± 0,83 33,39 ± 2,58 *

Количество ярусов сперматогенных клеток в канальце 3,00 ± 0,13 2,22 ± 0,64 5,40 ± 0,15 4,04 ± 0,19 *

Число сперматогоний в канальце 35,08 ± 1,07 37,35 ± 2,45 49,93 ± 1,61 38,57 ± 1,44 *

Число сперматоцитов первого порядка 1,75 ± 0,28 1,33 ± 0,23 32,05 ± 0,47 32,22 ± 0,48

Диаметр их ядер (мкм) 5,13 ± 0,19 4,97 ± 0,66 6,96 ± 0,13 7,06 ± 0,16

Число сперматоцитов второго порядка — — 29,93 ± 1,29 25,78 ± 1,26 *

Диаметр их ядер (мкм) — — 4,61 ± 0,10 4,96 ± 0,11 *

Число поддерживающих клеток в канальце 5,74 ± 0,18 4,71 ± 0,98 * 7,40 ± 0,17 4,42 ± 0,26 *

Диаметр их ядер (мкм) 6,55 ± 0,11 6,70 ± 0,77 7,00 ± 0,19 5,28 ± 0,10 *

Примечание - показатели достоверности: * - < 0,0001, * - < 0,02 при сравнении опытной группы с контрольной.

Б

w л л # '.V * ¿1

К 1

В.*

«л * V v f

V:; * »VI

Рисунок 2

■ Общий вид фрагментов семенных канальцев 45-суточных опытных (А, Б, Г) и контрольных (В) крысят.

А - Семенной каналец с расширенными просветами между сперматогенными клетками, их десквамация и скопление в просвете. Б - Вакуолизация цитоплазмы поддерживающих и сперматогенных клеток. В, Г - Формирующиеся спермии в семенных канальцах. Цифровая микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400

межканальцевого интерстиция семенников, при этом менее выраженная и у разных животных неодинаковая. Численная плотность интерстициальных клеток в поле зрения ниже, чем у животных контрольной группы (табл.). Интерстициальные эндокриноциты отличались полиморфизмом и напоминали клетки «химеры»: цитоплазма микровакуолизирована, клеточные границы размыты, тинкториальные свойства ядер и цитоплазмы снижены. Иногда среди них встречались крупные клетки с весьма четкой оксифильной зернистостью. Ядра интерстициальных эндокриноцитов уменьшены в размере. Наблюдалось уменьшение количества и диаметра перитубулярных гемокапилляров. Число семенных канальцев в поле зрения (20 х 10) снижено. При этом встречаемость семенных канальцев с прямолинейным ходом была меньшей. Толщина эпителиосперматоген-ного слоя и число ярусов сперматогенных клеток в нем меньше преимущественно за счет сперматогоний и вторичных сперматоцитов, что подтверждается данными морфометрии (табл.). Однако уменьшение клеток спер-матогенного эпителия неодинаковое у разных, даже рядом расположенных, канальцев, что свидетельствует о проходящем сперматогенезе, имеющем волнообразный характер. Нередко встречались канальцы с отсутствующими в некоторых участках сперматогониями и расширенным межклеточным пространством. Последнее способствовало десквамации сперматогенных клеток на разных стадиях сперматогенеза и скоплению их в просвете канальцев, где они подвергались деструкции (рис. 2А). Иногда наблюдалась выраженная очаговая вакуолизация цитоплазмы поддерживающих клеток со стороны стенки семенных канальцев (рис. 2Б). В этих областях чаще выявлялась микровакуолизация цитоплазмы сперматогенных клеток. В канальцах семенников опытных 45-суточных крысят реже встречались

формирующиеся спермии по сравнению с таковыми у животных контрольной группы (рис. 2В, Г).

заключение

Таким образом, проведенными исследованиями установлено, что у крыс второго поколения, полученного от спаривания самцов и самок, которые развивались в условиях эндогенной интоксикации, обусловленной холестазом у матери, имеет место задержка развития семенников и становления их структурных свойств, приводящая к нарушению процессов сперматогенеза. Эти изменения носят четко выраженный характер как у семенников животных первого поколения, развившегося в условиях холестаза, так и у второго, полученного при спаривании крыс первого поколения с интактными животными. Патогенетическим фактором выявленных нарушений, надо полагать, может являться не только наследственный фактор, но и трофический, в котором непосредственное участие принимает гематотестикулярный барьер. Косвенным подтверждением вышесказанного является уменьшение фоновой гликопротеиновой окраски основного вещества соединительнотканной оболочки семенных канальцев, стенки перитубулярных гемокапилляров. При этом имеет место снижение тинкториальных свойств интерстициальных и поддерживающих клеток. Кроме того, в последних со стороны базального отдела, прилежащего к соединительнотканной оболочке семенных канальцев, отмечается вакуолизация цитоплазмы. Все вышеперечисленное уменьшает транспорт тестостерона и трофических веществ в канальцы, что тормозит развитие мужских половых клеток. Данные изменения выявляются у крыс не только на 15-е, но и на 45-е сутки постнатального развития. В семенных канальцах семенников контрольной группы наблюдается большое количество формирующихся спермиев, чего нельзя сказать о таковых в опытной группе.

ш литература:

1. Батин, Н. В. Компьютерный статистический анализ данных: учебно-методическое пособие / И. В. Батин. - Минск : Институт подготовки научных кадров Национальной академии наук Беларуси, 2008. - 235 с. - ISBN 978-985-6820-138. - Текст: непосредственный

2. Зиматкин, С. М. Структурно-метаболические последствия холестаза для взрослого и развивающегося организма / С. М. Зиматкин, Я. Р. Мацюк, Л. С. Кизюкевич [и др.]. - Текст: непосредственный//Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2008. - № 4. - С. 7-9.

3. Карнюшко, О. А. Нарушение морфогенеза коры мозжечка потомства крыс с экспериментальным холестазом и их корк рекция/ О. А. Карнюшко, С. М. Зиматкин. - Текст: непосредственный //Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. - 2015. - № 3. - С. 95-101.

4. Кизюкевич, Л. С. Реактивные изменения в почках при экспериментальном холестазе / Л. С. Кизюкевич. - Гродно : ГрГМУ, 2005. - 239 с. - ISBN 985-6727-74-Х. - Текст: непосредственный.

5. Мацюк, Я. Р. Воздействие холестаза у беременных крыс на морфо-функциональные свойства семенников потомства / Я. Р. Мацюк, О. В. Барабан, С. В. Емельянчик. - Текст: непосредственный// Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. - 2010. - № 1. - С. 11-17.

6. Мацюк, Я. Р. Возрастные особенности структуры семенников крыс второго поколения, полученного от самок, развивавз шихся в условиях холестаза матери /Я. Р. Мацюк, Ю. Н. Вороник, Е. Ч. Михальчук. - Текст: непосредственный // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2018. - Т. 17, № 1. - С. 63-68.

7. Мацюк, Я. Р. Морфофункциональные особенности женской репродуктивной системы 15-суточных крысят, родившихс ся в условиях холестаза, вызванного в период фетогенеза / Я. Р. Мацюк, С. Я. Гудинович, Л. С. Кизюкевич. - Текст: непоу средственный // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. - 2008. - № 2. - С. 99-104.

8. Мацюк, Я. Р. Особенности органогенеза у потомства крыс развившихся в условиях холестаза у матери / Я. Р. Мацюк, С. М. Зиматкин, Е. Ч. Михальчук [и др.]. - Текст: непосредственный //Актуальные проблемы медицины: материалы ежегодной научно-практической конференции. - Гродно: ГрГМУ, 2018. - С. 515-518.

9. Мацюк, Я. Р. Структура семенников крыс, развивавшихся в условиях холестаза у матери, особенности их репродуктивных характеристик и развития потомства / Я. Р. Мацюк, Е. Ч. Михальчук, Л. С. Кизюкевич. - Текст: непосредственный // Морфология. - 2017. - Т. 151, № 2. - С. 76-81.

10. Михальчук, Е. Ч. Влияние обтурационного холестаза матери, вызванного в период фетогенеза, на течение беременноВ сти, плодовитость, физическое развитие потомства и его жизнеспособность / Е. Ч. Михальчук, Я. Р. Мацюк. - Текст: непосредственный //Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2007. - № 2. - С. 43-45.

11. Пирс, Э. Гистохимия теоретическая и прикладная /Э. Пирс. - Москва: Издательство иностранной литературы, 1962. -962 с. - Текст: непосредственный

12. Шумскене, Й Гепатологические и акушерские аспекты внутрипеченочного холестаза беременных/Й. Шумскене, Л. Купчинскас, Ю. Кондрацкене. - Текст: непосредственный//Гастробюллетень. - 2001. - № 1. - С. 12-14.

13. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientife ic purposes: text with EEA relevance 20.10.2010. - Strasbourg: Official Journal of the European Union, 2010. - 46 p. - Text: immediate.

И. В. МИХАЙЛОВА, Н. В. ВИНОКУРОВА, Н. А. КУЗЬМИЧЕВА, И. П. ВОРОНКОВА, Е. В. ИВАНОВА, Е. И. ШОСТАК, Ю. В. ФИЛИППОВА, И. В. ТАРЕНКОВА

ЧЕРЕМУХА ВИРГИНСКАЯ КАК ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России

I. V. MIKHAILOVA, N. V. VINOKUROVA, N. A. KUZMICHEVA, I. P. VORONKOVA, E. V. IVANOVA, E. I. SHOSTAK, JU. V. FILIPPOVA, I. V. TARENKOVA

PADUS VIRGINIANA AS A SOURCE OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES

FSBEI HE «Orenburg State Medical University» of the Ministry of Health of Russia

резюме

В статье представлены результаты исследования содержания биологически активных веществ в черемухе виргинской (Padus virginiana), произрастающей на территории Оренбургской области. Микроскопический анализ плодов черемухи виргинской и плодов черемухи обыкновенной установил однотипные

анатомо-морфологические признаки. Качественный анализ установил наличие флавоноидов, в том числе антоцианов, и дубильных веществ (конденсируемой природы). Анализ количественного содержания биологически активных веществ в плодах черемухи виргинской выявил, что максимальная концентрация суммы флавоноидов и дубильных веществ установлена