CC BY
32
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНАХ МЫШЕЙ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ГРИППА ПТИЦ ШШ-СУБТИПА A/GOOSE/KRASNOOZERSKOYE/627/05
Оксана Валентиновна ПОТАПОВА1, Вячеслав Алексеевич ШКУРУПИЙ1, Наталья Геннадьевна ЛУЗГИНА1, Александр Михайлович ШЕСТОПАЛОВ2, Игорь Геннадьевич ДРОЗДОВ2, Ирина Васильевна ОДАРЧЕНКО1, Лидия Владимировна ШЕСТОПАЛОВА3
1ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2
2ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора,
630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово
3Новосибирский государственный университет 630090, г. Новосибирск, ул.Пирогова, 2
У беспородных мышей-самцов, инфицированных интраназально изолятом вируса гриппа А субтипа Н5Ш (A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05), выделенного на территории Новосибирской области, выявлен высокий процент летальности. При морфологическом исследовании образцов органов иммуногенеза (селезенки, тимуса) от данных животных обнаружены следующие морфологические изменения: истощение лимфоидной ткани, синусовую макрофагальную гиперплазию с формированием из них многоядерных клеток, связанных с цито-киновой дисрегуляцией и задержкой каспазо-зависимого апоптоза клеток макрофагального ряда.
Ключевые слова: вирус гриппа птиц Н5Ш (A/Gs/Kxasnoozerskoye/627/05), селезенка, тимус, лимфоциты, макрофаги, многоядерные клетки, иммуноморфологическое исследование.
Высокопатогенный вирус гриппа А Н5Ш-субтипа представляет реальную угрозу во всех странах, включая Россию [1]. Исследования циркулирующих изолятов возбудителя демонстрируют продолжающуюся эволюцию вируса за счет мутаций и генной реассортации с появлением новых штаммов, устойчивых к имеющимся на сегодняшний день противовирусным препаратам и обладающих способностью прямой передачи от птиц человеку [2,3]. Вирус гриппа А Н5Ш-субтипа вызывает генерализованную инфекцию в отсутствии ранее сформировавшегося специфического иммунитета в человеческой популяции [4], что позволяет рассматривать данный тип вируса в качестве вероятной причины будущих пандемий гриппа.
Высокую летальность при данной вирусной инфекции связывают не с прямым цитопатиче-ским действием вирусов на клетки организма, а с дисрегуляцией секреции про- и противовоспалительных цитокинов клетками иммунной системы с одновременным угнетением интер-феронового ответа и задержкой каспазозави-симого апоптоза инфицированных вирусами макрофагов [3,5].
Так как большинство исследований вирулентности и патогенеза вируса Н5Ш сделаны на штаммах, выделенных в странах Юго-Восточной Азии, остаются неизученными патогенетические и клинико-морфологические аспекты субтипов вируса Н5Ш, выявленных в регионах России.
Исходя из вышеизложенного, была определена цель исследования: выявить степень патогенности для млекопитающих штамма птичьего гриппа Н5Ш-субтипа (А^8/Кга8по-ozerskoye/627/05), выделенного на территории Новосибирской области, и изучить морфологические изменения в органах иммуногенеза (тимусе и селезенке) экспериментальных животных, инфицированных данным штаммом.
Методика исследования
Исследования проведены на 105 беспородных мышах-самцах шестинедельного возраста, с массой тела 20-25 г, что позволило исключить детерминацию генотипа животных на особенности иммунного ответа. В работе использовали штамм вируса гриппа А субтипа Н5№ A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05, выделенный от павшей птицы во время вспышки заболевания
Потапова О.В. — зав. лабораторией структурных основ патогенеза социально значимых заболеваний, канд.м.н., e-mail: [email protected]
Шкурупий В.И. — директор НЦКЭМ, академик РАМН, д.м.н., e-mail: [email protected]
Лузгина Н.Г. — вед.н.с. лаборатории патологической физиологии, канд.м.н., e-mail: [email protected]
Шестопалов А.М. — завотделом, e-mail: shestopalov2@ mail.ru
Дроздов И.Г. — генеральный директор, д.м.н., e-mail: [email protected]
Одарченко И.В. — лаборатория структурных основ патогенеза социально значимых заболеваний, н.с. Шестопалова Л.В. — кафедра физиологии, профессор, e-mail: [email protected]
в июле 2005 года на территории Новосибирской области.
Животные были разделены на 2 группы: первая группа служила контролем и была представлена 30 интактными мышами, животных второй группы инфицировали штаммом вируса гриппа A субтипа H5N1 A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05. Заражение проводили интраназально дозой МЛД50 (мышиная летальная доза, применение которой вызывает гибель 50% животных). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде.
Материал для исследования получали через 1, 2, 3, 6 и 10 суток после заражения от 15 мышей на каждом сроке после выведения их из эксперимента (под эфирным наркозом путем дислокации позвонков в шейном отделе). Объектом исследования были выбраны селезенка и тимус как центральный и периферический органы иммуногенеза.
Для светооптического исследования образцы органов фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону. Для оценки состояния органов иммуногенеза определяли величины следующих морфометрических параметров: численную плотность лимфоидных фолликулов (Nai) и их диаметр (мкм), численную плотность многоядерных клеток в синусоидах селезенки (Nai), объемную плотность фиброзной ткани (Vv).
Для иммуногистохимического иследования проводили соответствующую подготовку парафиновых срезов, включающую: депарафиниза-цию, регидратацию, демаскировку выявляемых антигенов в микроволновой печи с мощностью 700W, блокирование эндогенной пероксидазы, инкубирование с блокирующей сывороткой, инкубирование со специфическими моноклональными антителами к кластерам CD4+, CD8+, CD68+. (Novocastra). Время инкубации составило 1 час при комнатной температуре с последующим инкубированием со стрептави-диновым пероксидазным комплексом, ДАБ-субстратом и дополнительным докрашиванием препаратов гематоксилином. Для изучения механизмов апоптоза использовали маркеры caspasa-3, TRAIL (TNF- related apoptosis-indu-cing ligand) (Novocastra). Для исследования роли про- и противовоспалительных цитокинов — моноклональные антитела к ИЛ-2, ИЛ-6, TNF-a. (Novocastra). Для визуализации была применена система детекции NovoLink (Novocastra).
Вычисление средних величин проводили методами вариационной статистики. Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин оценивали по критерию Стьюдента, достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты исследования
После заражения у животных развивался острый инфекционный процесс. Средняя продолжительность жизни составила 8,19±0,18 суток, летальность — 85%.
Уже через сутки после заражения в селезенке отмечали снижение количества лимфоцитов в герминативной зоне фолликулов и в периар-териальных зонах с последующим прогрессирующим истощением лимфоидной ткани. При иммуногистохимическом исследовании было показано одновременное уменьшение СД4/ СД8 лимфоцитов. Величина показателя численной плотности фолликулов с 1 суток после инфицирования к 10 суткам развития инфекционного процесса уменьшилась в 2,2 раза с одновременным уменьшением диаметров фолликулов на 45% в эти же сроки наблюдения (табл.). Герминтативные центры в фолликулах практически не визуализировали. Начиная с
1 суток после заражения животных вирусом гриппа птиц в расширенных синусоидах наблюдали гемостаз, скопления нейтрофилов, гиперплазию клеток макрофагального ряда. В синусоидах наблюдали гигантские многоядерные клетки (рис.), численная плотность которых нарастала к 10 суткам. Величина данного параметра в период с 3 по 10 сутки развития болезни возросла в 2 раза. Полученные данные могут быть свидетельством развития гемофаго-
Рис. Ткань селезенки мыши на 3 сутки после
инфицирования вирусом гриппа птиц H5N1 — субтипа (A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05). Истощение лимфоидной ткани с синусовой макрофагальной гиперплазией и формированием многоядерных клеток. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 400.
Таблица
Морфометрические показатели структурных изменений в селезенке мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1-субтипа A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (М±т )
Параметры Контроль (интактные животные) n=30 Инфицированные животные
Срок после заражения, сутки
1 2 3 6 10 n=15 n=15 n=15 n=15 n=15
Численная плотность лимфидных фолликулов (№^ в 4,2x104 мкм2 8,42+0,51 8,2+0,41 7,65+0,26 а 7,02+0,31 а 5,62+0,51 аЬ 3,72+0,4 аЬ
Диаметр лимфоидных фолликулов, мкм 6,25+0,12 5,62+0,14 5,38+0,51 4,65+0,41 3,25+0,51 3,12+0,12
Численная плотность многоядерных клеток, (№^ в 4,2x104 мкм2 2,78+0,18 a 3,15+0,16 ab 4,8+0,26 5,72+0,33 5,87+0,4 ab
Объемная плотность фиброзной ткани (Уу), % 1,25+0,11 1,83+0,16 2,56+0,22 3,02+0,12 a 4,16+0,85 ab 4,36+0,15 ab
Примечания: а — величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров в контрольной группе; Ь — величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предыдущего срока наблюдения; п — количество животных в группах.
цитарного синдрома при вирусе гриппа птиц у млекопитающих, который может быть связан с блокадой каспазо-зависимого апоптоза макрофагов, инфицированных вирусом гриппа птиц Н5Ш[6].
Для уточнения механизма данного синдрома проводили иммуногистохимическое исследование с моноклональными антителами к каспазе-3 — индуктору апоптоза. Положительное окрашивание с экспрессией данного маркера в единичных макрофагах регистрировали только на 6 сутки развития инфекционного процесса, к 10 суткам количество макрофагов, экспрессирующих каспазу-3, незначительно увеличилось, однако, в гигантских клетках, которые были положительны по СД68 (маркеру макрофагов), признаков каспазо-зависимого апоптоза не наблюдали.
В динамике развития инфекционного процесса в селезенке регистрировали фиброти-ческие осложнения: разрастание фиброзной ткани наблюдали преимущественно в перива-скулярных зонах. Величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в период со
2 по 10 сутки после инфицирования вирусом гриппа птиц Н5Ш-субтипа увеличилась в 2,3 раза. Ранний и быстропрогрессирующий фиброз, вероятно, связан с активацией фибробла-стов в условиях ишемии и под влиянием про-воспалительных цитокинов.
В тимусе наблюдали отек, полнокровие сосудов с тромботическими массами в просвете некоторых из них, очаги некроза с лейкоцитарной инфильтрацией. С 1 по 10 сутки развития инфекционного процесса наблюдали прогрессирующее уменьшение количества лимфоци-
тов с замещением жировой и фиброзной тканями. Наряду с данными изменениями наблюдали увеличение количества клеток макрофа-гального ряда с явлениями гипертрофии.
Иммуногистохимическое исследование ци-токинового профиля в поврежденных тканях мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц Н5Ш-субтипа A/goose/Krasnoozerskoye/ 627/05, показало положительную экспрессию с фактором некроза опухоли-a уже на первые сутки после заражения, выраженность которой проявлялась увеличением числа положительно окрашенных клеток, в большей степени — макрофагального ряда.
В цитоплазме лимфоцитов на всех сроках наблюдения отмечали положительную реакцию с маркерами апоптоза: caspasa-3, TRAIL (TNF- related apoptosis-inducing ligand), что свидетельствует о развитии так называемого проапоптозного TNF-каскада. При взаимодействии этого цитокина с доменом смерти TRAIL происходит активация каспазы-8, которая индуцирует протеолиз прокаспазы-3 с образованием эффекторного энзима, расщепляющего клеточные протеины и индукцией апоптоза [7]. Это приводит к массовой гибели лимфоцитов и, как следствие, к истощению лимфоидной ткани в органах иммуногенеза с угнетением клеточного звена иммунитета. С данным феноменом, по-видимому, связана недостаточность интерферонового ответа у экспериментальных животных, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1, которую наблюдали при исследовании цитокинового профиля в сыворотке животных [8].
Таким образом, в основе морфогенеза пато-
логических изменений в органах иммуногенеза мышей при вирусной инфекции гриппа H5N1 — субтипа (A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05) лежит, прежде всего, неполноценный противовирусный интерфероновый ответ, запускающий каскад цитокин-опосредованных реакций, приводящих к необратимым структурно-функциональным изменениям в системах органов экспериментальных животных.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследование и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Госконтракт № 02.512.11.2193, и поддержана BIO INDUSTRY INITIATIVE (USA), МНТЦ (грант №3436).
Литература
1. Грипп птиц в Сибири — 2005: Лабораторные и эпидемиологические исследования, противоэпидемические и противоэпизоотические мероприятия в период эпизоотии вируса гриппа среди домашней птицы в Сибирском и Уральском федеральных округах Российской Федерации (июль — ноябрь 2005 года). Под ред. Г.Г. Онищенко. Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС», 2006. 192.
Avian influenza in Siberia - 2005: Laboratory and epidemiologic investigation, antiepidemic and antiepizootic countermeasures in period of avian influenza epizooty among poultry in Siberian and Ural federal district of Ru-
ssian Federation (July - November 2005). Edited by G.G. Onischenko. Novosibirsk: Pblishers «TsERIS», 2006. 192.
2. Claas, E.C., Osterhaus, A.D., van Beek, R. et al. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus // Lancet 1998. 351: 472—477.
3. Maines TR, Lu XH, Erb SM, Edwards L, Gua-rner J, Greer PW, et al. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals // J Virol. 2005.79:17888-800.
4. To KF, Chan pKS, Chan KF et al. Pathology of fatal human infection associated with avian influenza A H5N1 virus. J Med Virol. 2001.63:242-246.
5. Cheung CY, Poon LLM, Lu AS et al. Induction of proinflammatory cytokines in human macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human disease? // Lancet. 2002. 1831-1837.
6. De Jong, M. D., Simmons C. P., Thanh T. T. et al. Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia // Nat. Med. 2006.12:1203-1207.
7. Ashkenaszi A. Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily // Nat.Rev. Cancerl. 2002.2:420-430
8. Евсеенко В.А., Шаршов К.А., Букин Е.К. и др. Патогенез инфекционного заболевания мышей, вызванного вирусом гриппа птиц Н5Ш-подтипа // Бюлл. эксперимент. биологии и медицины. 2008. Прил.1.: 52 - 55.
Evseenko V.A., Sharshov K.A., Bukin E.K. etc. Pathogenesis of mice infectious diseases caused by avian influenza virus H5N1-subtype. Byull. eksperiment. biologii i meditsiny. 2008. Supplement.1.: 52 - 55.
STRUCTURAL CHANGES IN SPLEENES AND THIMUSE OF MICE, INFECTED AVIUM INFLUENZA SUBTYPE H5N1 VIRUS
Oksana Valentinovna POTAPOVA1, Vjacheslav Аlekseevich SHKURUPY1, Natalia Gennadievna LUZGINA1, Alexander Michailovich SHESTOPALOV2, Igor Gennadievich DROZDOV2, Irina Vasilievna ODARCHENCO1, Lidia Vladimirovna SHESTOPALOVA3
1 State Institution Research Centre for Clinical and Experimental Medicine, Siberian Branch,
Russian Academy of Medical Sciences 2, Akademika Timakova str., Novosibirsk, 630117
2Ministry of public health social development of Russian Federation «State Research Center of Virology and Biotechnology», head of department Koltsovo, Novosibirsk region, 630559
3Novosibirsk state university, professor of department of physiology
2, Pirogova str., Novosibirsk, 630090
High mortality percent was mentioned in male mongrel mice, intranasaly infected influenza subtype H5N1 (A/Gs/ Krasnoozerskoye/627/05) virus, which was educed in Novosibirsk region. There are some morphological changes, which were found in infected mice tisssues: lymphoid tissue depletion, hyper-plasia of sinusal macrophages, forming multinucleated cells, possibly through cutokine disregulation and delay of caspase-dependent macrophage apoptosis.
Potapova O.V. — Head of the laboratory of structural bases of socially significant diseases pathogenesis
Shkurupy V.J. — director, academicion of Russian Academy of Medical Sciences
Luzgina N.G. — senior researcher of laboratory of pathologic phisiology
Shestopalov A.M. — Head of department
Drozdov I.G. — director
Odarchenco I.V. — researcher of laboratory of structural bases of socially significant diseases pathogenesis Shestopalova L.V. — professor of department of physiology
