CC BY
36
УДК 591.441;618.39
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ АЛЛОГЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ У МЫШЕЙ С НОРМАЛЬНОЙ ФЕРТИЛЬНОСТЬЮ, ВЫСОКИМ УРОВНЕМ СПОНТАННЫХ И МУРАМИЛДИПЕПТИД-ИНДУЦИРОВАННЫХ АБОРТОВ
© Артемьева К.А.1, Болтовская М.Н.1, Богданова И.М.1,
Обернихин С.С.1, Земляков А.Е.2, Калюжин О.В.1'3
1 Лаборатория клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН Москва;
2 кафедра органической химии Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, Симферополь, Украина;
3 кафедра клинической иммунологии и аллергологии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, Москва
E-mail: kalyuzhin@list га
Цель работы - сравнительное исследование изменений структуры селезенки в динамике аллогенной беременности у мышей с нормальной фертильностью (^CBAx^BALB/c), высокой частотой спонтанных абортов (9CBAx^DBA/2) и индуцированными р-гептилгликозидом мурамилдипептида (С7МДП) резорбциями эмбрионов. Сравнение морфометрических показателей выявило, что селезенка беременных мышей в парах с высоким уровнем спонтанных абортов, в отличие от таковой в фертильных сочетаниях животных, характеризуется меньшей объемной долей белой пульпы с тенденцией к преобладанию В-зоны на 8-й день гестации. На 14-й день гестации морфометрические показатели селезенки у самок в парах 9CBAx^DBA/2 и ^CBAx^BALB/c не различались. С7МДП, индуцирующий аборты у $CBA, оплодотворенных ^BALB/c, и повышающий уровень спонтанных абортов у ^CBA, скрещенных с ^DBA/2, вызывал резкое увеличение объемных долей белой пульпы и Т-зависимой зоны периартериолярных лимфоидных муфт. Во всех случаях у беременных и небеременных самок введение С7МДП индуцировало появление многочисленных мега-кариоцитов в субкапсулярной зоне.
Ключевые слова: модели иммунозависимых абортов, р-гептилгликозид мурамилдипептида, CBAxDBA/2, CBAxBALB/c, структура селезенки.
STRUCTURAL CHANGES OF THE SPLEEN DURING ALLOGENEIC PREGNANCY IN MICE WITH NORMAL FERTILITY AND HIGH RATE OF SPONTANEOUS AND MURAMYL DIPEPTIDE-INDUCED ABORTIONS Artemyeva К.А.1, Boltovskaya М-N.1, Bogdanova I.M.1, Obernikhin S.S.1, Zemlyakov A.E.2, Kalyuzhin O.V.1'3
1 Laboratory of Cellular Immunopathology and Biotechnology, Human Morphology Research Institute
of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow;
2 Department of Organic Chemistry of Taurida National V.I.Vernadsky University, Simferopol, Ukraine;
3 Department of Clinical Immunology and Allergy of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow The purpose of the paper was a comparative study of structural changes of the spleen during allogeneic pregnancy in fertile matings (?CBAx^ BALB/c), in abortion-prone matings ($ CBA x 61 DBA / 2) and in mice with embryo resorptions induced by muramyl dipeptide P-heptylglycoside (C7MDP). A comparison of morphometric parameters showed that the spleen in pregnant mice of abortion-prone matings, unlike those in non-abortion-prone matings, is characterized by the lower volume of the white pulp with a tendency to the predominance of the B-zone on the 8-th gestation day. On the 4-th gestation day, morphometric spleen parameters of pregnant mice in pairs $CBAx^DBA/2 and ^CBAx^BALB/c did not differ. C7MDP, which induced abortions in $CBAx^ BALB/c matings and increased the level of spontaneous embryo resorptions in $CBAx^DBA/2 matings, caused a marked increase in the volume fractions of the white pulp and T-dependent areas of peri-arteriolar lymphoid sheaths. In all cases in pregnant animals and non-pregnant females, injections of C7MDP induced the emergence of numerous megakaryocytes in the subcapsular region.
Keywords: models of immune-dependent abortion, muramyl dipeptide P-heptylglycoside, CBAxDBA/2, CBAxBALB/c, spleen structure.
В экспериментальных исследованиях имму-норегуляторных механизмов беременности большое внимание уделяется локальным иммунным процессам на границе мать-плод, инволюции тимуса, изменениям циркулирующих иммуноком-петентных клеток, их продуктов, а также гормонов. Вместе с тем морфофункциональные изменения селезенки во время беременности остаются
недостаточно изученными. При наступлении беременности макрофаги и у5-Т клетки инфильтрируют слизистую оболочку матки, что отражает реакцию материнской иммунной системы на появление чужеродных антигенов в репродуктивном тракте. Затем сенсибилизированные иммуно-циты мигрируют в периферические лимфоидные органы, в том числе в селезенку. Микроокруже-
ние селезенки обеспечивает межклеточные контакты и продолжение иммунного ответа [13].
Как сингенная, так и аллогенная беременность у мышей характеризуется транзиторной спленомегалией. Масса селезенки постепенно увеличивается и достигает пика на 10-13-е сутки беременности [12, 13, 19]. К 15-му дню гестации число клеток этого органа повышается примерно до 300 миллионов, что в 2,6 раза больше, чем вне беременности. Затем масса селезенки и количество спленоцитов начинают уменьшаться и уже на 18-й день беременности не отличаются от показателей небеременных самок [15].
Важной функцией спленоцитов, связанной с репродукцией, является синтез прогестерон-индуцируемого блокирующего фактора (PIBF), который подавляет активность нормальных киллеров и сдвигает морфофункциональный баланс Th1 и Th2 в сторону последних, тем самым предотвращая резорбцию эмбрионов [20].
Исследование влияния беременности у мышей на численность и функциональную активность CD8+ T-клеток, играющих ведущую роль в иммунном ответе на вирусные и другие внутриклеточные патогены, показало, что их количество в селезенке и дренирующих матку лимфоузлах транзиторно увеличивается в середине беременности за счет усиления пролиферации. Следовательно, во время гестации функция CD8+ T-клеток-эффекторов сохраняется [16].
Во все сроки беременности в селезенке присутствуют герминативные центры, число которых варьирует [19], что отражает активность Т-зависимого В-клеточного ответа. Установлено, что гомеостаз в герминативных центрах контролируют Т-регуляторые клетки, определяющие силу и качество гуморальных реакций.
Таким образом, селезенка играет существенную роль в адаптации материнского организма к состоянию беременности.
Однако до настоящего времени не изучено морфофункциональное состояние селезенки беременных мышей при скрещивании линий, приводящем к высокому уровню спонтанных абортов ($СВАх^DBA/2) [18], а также при иммунозави-симых абортах, индуцированных ß-гептил-гликозидом мурамилдипептида (С7МДП) [1].
Цель работы - сравнительное исследование изменений структуры селезенки в динамике алло-генной беременности у мышей с высокой фертильностью, спонтанными и С7МДП-индуцированными абортами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали 8-10-недельных мышей инбредных линий CBA, DBA/2, BALB/c массой тела 23-25 г, полученных из филиала «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария НИИ морфологии человека РАМН. Самок и самцов ссаживали в соотношении 3:1, день появления копулятивной пробки обозначали как 1-й день гестации (ДГ). Высокий уровень спонтанных абортов воспроизводили скрещиванием самок CBA с самцами DBA/2, в качестве фертильного контроля использовали комбинацию мышей ^CBAx^BALB/c [18]. С7МДП, синтезированный как описано ранее [2], вводили внутрибрюшинно на 5-й ДГ (завершение имплантации) и 7-й ДГ (формирование плаценты) в дозе 20 мкг в 0.1 мл 0.9% раствора NaCl на 1 животное (« 0.83 мг/кг). Небеременным самкам С7МДП вводили двукратно с 48-часовым интервалом. Выбранная доза С7МДП соответствует ED50, определенной в предварительной серии экспериментов на мышиных септических моделях [5, 6, 7].
Сформированы 10 экспериментальных групп по 7 мышей в каждой:
- небеременные самки CBA: интактные (1) и после введения С7МДП (2);
- 9CBA, оплодотворенные ^BALB/c (для исследования селезенки на 8-й день гестации): интактные (3) и после введения С7МДП (4);
- 9CBA, скрещенные с ^BALB/c (для изучения селезенки на 14-й день гестации): интактные (5) и после введения С7МДП (6);
- 9СВА, спаренные с ^DBA/2 (8-й день гестации): интактные (7) и после введения С7МДП (8);
- 9СВА, оплодотворенные ^DBA/2 (14-й день гестации): интактные (9) и после введения С7МДП (10).
Животных выводили из эксперимента цервикальной дислокацией под эфирным наркозом на 8-й и 14-й ДГ, небеременных самок - через 7 суток после второго введения препарата. Селезенку фиксировали в 10-процентном нейтральном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.
Исследование препаратов проводили методом световой микроскопии и компьютерной морфо-метрии с помощью программы ImageScopeM (Leica Microsystems GmbH, Германия). Определяли индекс соотношения белой (БП) и красной пульпы (КП) в условных единицах, объемные доли лимфоидных фолликулов (ЛФ) и периартерио-
лярных муфт (ПАЛМ) в процентах от площади белой пульпы.
Результаты представляли в виде среднего ± стандартное отклонение. Данные анализировали с использованием программ Sigma Stat 3.5 и Microsoft Excel. Характер распределения анализируемых параметров в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Меж-групповые сравнения проводили с помощью г-критерия Стьюдента для нормально распределенных показателей и ^-критерия Манна-Уитни для распределений, отличных от нормального. Различия считали значимыми при p<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При морфологическом и морфометрическом исследовании селезенки небеременных ÇCBA выявлено равное соотношение БП и КП, в БП преобладали ЛФ, не имеющие светлых центров (рис. 1A). Двукратное введение С7МДП резко увеличивало объемные доли БП и ПАЛМ (табл. 1), маргинальная зона, как и у интактных самок, была выражена умеренно; в субкапсулярной зоне определялись многочисленные мегакариоциты (рис. 1B).
При фертильном сочетании линий (ÇCBAx^BALB/c) селезенка самок на 8-й ДГ характеризовалась почти двукратным увеличением доли БП по сравнению с небеременными мышами, Т- и В-зоны были выражены в равной степени (рис. 2A). На 14-й ДГ объем БП был больше, чем в предыдущий срок беременности, при этом сохранялось равное соотношение долей ЛФ и ПАЛМ (рис. 2C, табл. 1). В оба срока беременности в БП наблюдали одиночные ЛФ со светлыми
центрами; маргинальная зона была выражена незначительно на 8-й ДГ, умеренно - на 14-й ДГ.
При скрещивании линий, приводящем к высокому уровню спонтанных абортов (9CBA*^DBA/2), в селезенке самок на 8-й ДГ доля БП была достоверно меньше, чем у самок высокофертильных пар, и не отличалась от таковой у небеременных мышей. В-зона преобладала и была более выражена, чем у 9CBA, оплодотворенных ^BALB/c (рис. 3A), но занимала меньшую площадь по сравнению с небеременными самками (табл. 1). В БП присутствовали ЛФ со светлыми центрами и хорошо выраженной маргинальной зоной. На 14-й ДГ в селезенке преобладала БП; ЛФ и зона ПАЛМ были одинаково выражены (рис. 3C); морфометрические показатели этого органа в парах ^CBAx^DBA/2 и 9CBAx^BALB/c не различались.
Индукция иммунозависимых абортов двукратным введением С7МДП 9CBA, оплодотворенным ^BALB/c, вызывала резкое увеличение объемных долей БП и ПАЛМ селезенки на 8-й ДГ (рис. 2B). Выраженность этих изменений превышала таковую как у интактных самок пар $CBAx^BALB/c, так и у небеременных мышей после введения С7МДП (в 1.8 и 1.4 раза, соответственно). На 14-й ДГ наблюдалась хорошо выраженная маргинальная зона, сохранялось значительное преобладание БП и зоны ПАЛМ (рис. 2D), но объемная доля ПАЛМ уменьшалась по сравнению с 8-м ДГ (табл.1).
При введении С7МДП 9CBA, скрещенным с ^DBA/2, на 8-й ДГ в селезенке наблюдалось увеличение БП и зоны ПАЛМ по сравнению с ин-тактными самками пар ^CBAx^DBA/2 (рис. 3B). Однако это увеличение было менее выражено, чем у 9CBA, оплодотворенных ^BALB/c, после
Рис. 1. Селезенка небеременных самок CBA: интактных (А) и после введения С7МДП (B).
Здесь и рис. 2 и 3: окрашивание гематоксилином и эозином. Увеличение х50. Описание в тексте.
Рис. 2. Селезенка беременных самок фертильных пар (9CBAx^BALB/c): интактных на 8-й (А) и 14-й ДГ (С), после введения С7МДП на 8-й (С) и 14-й ДГ (Б).
Рис. 3. Селезенка беременных самок при «абортогенном» сочетании линий (9СВА*^БВА/2): интактных на 8-й (А) и 14-й ДГ (С), после введения С7МДП на 8-й (С) и 14-й ДГ (Б).
Таблица 1
Морфометрические показатели селезенки самок мышей СВА
Группа наблюдений Объемные доли, % от белой пульпы Индекс отношения объемных долей белой пульпы к красной, усл. ед
Лимфоидные фолликулы ПАЛМ
1. Небеременные $CBA 75.46±10.9 24.54±10.9 0.93±0.13
2. Небеременные $CBA + С7МДП 39.62±7.67{ 60.38±7.67{ 1.38±0.42{
3. 2CBAx^BALB/c, 8-й ДГ 53.54±5.62* 46.46±5.62* 1.19±0.13*
4.$CBAx^BALB/c + С7МДП, 8-й ДГ 17.90±3.02*{ 82.1±3.02*{ 1.80±0.36*{
5$ CBA x^BALB/c, 14-й ДГ 50.26±8.28* 49.74±8.28* 1.50±0.12*f
6. $CBAx^BALB/c + С7МДП, 14-й ДГ 30.4±5.47f{ 69.60±5.47{ 1.81±0.14*{
7. $CBAx^DBA/2, 8-й ДГ 60.46±6.17* 39.55±6.17* 1.03±0.26#
8. $CBAx^DBA/2 + С7МДП, 8-й ДГ 38.21±4.95#{ 61.79±4.95#{ 1.44±0.33{
9. $CBAx^DBA/2, 14-й ДГ 46.34±7.47*f 53.66±7.47*f 1.46±0.28*f
10. $CBAx^DBA/2 + С7МДП, 14-й ДГ 40.16±5.66 59.84±5.66 1.80±0.15*f{
Примечание: р<0.05 * - по сравнению с группой небеременных самок, ^ - по сравнению с 8-м ДГ, # - по сравнению с группами ($СВАх^ВАЬВ/с) того же ДГ, { - по сравнению с группами животных, не подверженных действию С7МДП.
двукратного введения иммуномодулирующего гликопептида. Соотношение БП и КП, объемные доли ЛФ и ПАЛМ не отличались от соответствующих показателей небеременных самок, которым вводили С7МДП. На 14-й ДГ объем БП возрастал в сравнении с таковым как на 8-й ДГ в данной группе, так и на 14-й ДГ у интактных самок пар $CBAx^DBA/2 (рис. 3D). Доли ЛФ и ПАЛМ не отличались ни от показателей предыдущего срока беременности, ни от таковых на 14-й ДГ у интактных самок пар $CBAx^DBA/2 (табл. 1).
В оба срока исследования у беременных мышей вне зависимости от линии оплодотворивших их самцов введение С7МДП индуцировало появление многочисленных мегакариоцитов в субкап-сулярной зоне.
Таким образом, сравнение морфометрических показателей функциональных зон органа выявило, что селезенка беременных мышей в парах с высоким уровнем спонтанных абортов, в отличие от таковой в фертильных сочетаниях животных, характеризуется меньшей объемной долей БП с тенденцией к преобладанию В-зоны на 8-й ДГ. На 14-й ДГ морфометрические показатели селезенки у самок в парах $CBAx^DBA/2 и $CBAx^BALB/c не различались.
С7МДП, индуцирующий аборты у $CBA, оплодотворенных ^BALB/c, и повышающий уровень спонтанных абортов у $CBA, скрещенных с ^DBA/2 [1], вызывал резкое увеличение объемных долей БП и Т-зависимой зоны ПАЛМ. В условиях воздействия иммуномодулятора при
фертильном сочетании 9CBAx^BALB/c, когда частота резорбции эмбрионов возрастала почти троекратно (в среднем до 45,4±6,31%), указанные изменения проявлялись уже на 8-й ДГ и были более выражены, чем у самок пар 9СВА*^БВА/2, у которых частота резорбции под влиянием С7МДП увеличивалась в среднем лишь на 20%. Очевидно, увеличение БП и Т-зависимой зоны ПАЛМ в селезенке при С7МДП-индуцированных абортах отражает усиление клеточных иммунных реакций, неблагоприятных для развития беременности [18], обусловленное свойством гликозидов МДП, в частности С7МДП, усиливать клеточные иммунные реакции и направлять дифференциров-ку Т-хелперов в сторону ТЫ-клеток [3, 4, 9, 10, 17]. По-видимому, определённый вклад в указанные изменения вносит известная способность С7МДП модулировать функцию макрофагов [8] -важных клеточных элементов, образующих лим-фоцитарно-макрофагальные комплексы в различных зонах селезенки [11].
Представленные в настоящей работе данные приближают к пониманию не только функции селезенки при беременности, но и механизмов действия гликозидов МДП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артемьева К.А., Болтовская М.Н., Калюжин О.В. Моделирование иммунозависимого невынашивания беременности на мышах с использованием гликозида мурамилдипептида // Курский научно -
практический вестник «Человек и его здоровье». -2012. - № 2. - С. 34-40.
2. Земляков А.Е., Цикалов В.В., Калюжин О.В., Курь-янов В. О., Чирва В.Я. Гликозиды М-ацетилмурамоил-Ь-аланил^-изоглутамина. Влияние конфигурации гликозидного центра и природы агликона на биологическую активность // Биоорганическая химия. - 2003. - Т. 29. - № 3. -С. 316-322.
3. Калюжин О.В., Захарова Н.С., Брицина М.В., Земляков А.Е., Калюжин В.В. Иммуномодулирующая активность ß-гептилгликозид-мурамилдипептида in vivo // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т. 128. - № 11. - С. 553-554.
4. Калюжин О.В., Земляков А.Е., Калюжина Е.В., Шкалев М.В., Нелюбов М.В. Действие гликозидов мурамилдипептида на пролиферацию лимфоцитов и выработку ими интерлейкина-2 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2002. - Т. 134. - № 8. - С. 186-190.
5. Калюжин О.В., Калина Н.Г., Баштаненко А.Ф., Шкалев М.В., Кузовлев Ф.Н., Калюжин В.В. Стимуляция резистентности мышей к бактериальной инфекции гликозидами мурамилдипептида // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т. 135. - № 5. - С. 531-535.
6. Калюжин О.В., Калюжин В.В., Земляков А.Е., Елкина С.И., Шкалев М.В., Сергеев В.В. Стимуляция неспецифической резистентности мышей ß-гептилгликозид-мурамилдипептидом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1999. - Т. 127. - № 5. - С. 543-545.
7. Калюжин О.В., Мулик Е.Л., Сергеев В.В., Калина Н.Г., Елкина С.И., Калюжина М.И., Кузов-лев Ф.Н., Караулов А.В. Применение ß-гептилгликозид-мурамилдипептида в экспериментальной терапии генерализованных бактериальных инфекций // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2000. - № 4. - С. 73-77.
8. Калюжин О.В., Нелюбов М.В., Калюжина Е.В., Кузовлев Ф.Н., Шкалев М.В. Влияние конфигурации гликозидной связи и структуры агликона гли-козидов мурамилдипептида на их способность стимулировать продукцию интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли макрофагами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2002. - Т. 134. - № 9. - С. 326-328.
9. Калюжин О.В., Фукс Б.Б., Бовин Н.В., Земляков А.Е., Чирва В.Я. Иммуномодулирующая активность новых производных мурамилдипептида in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - Т. 117. - № 5. - С. 510-513.
10. Караулов А.В., Калюжин О.В., Земляков А.Е. Био-
логическая активность гликозидных производных N-ацетилмурамил-L -аланил-D -изоглутамина //
Российский биотерапевтический журнал. - 2002. -Т. 1. - № 1. - С. 14-24.
11. Alexander C.M., Tygrett L.T., Boyden A.W., Wol-niak K.L., Legge K.L., Waldschmidt T.J. T regulatory cells participate in the control of germinal centre reactions // Immunology. - 2011. - Vol.133 (4). -P. 452-468
12. Bustamante J.J., Dai G., Soares M.J. Pregnancy and lactation modulate maternal splenic growth and development of the erythroid lineage in the rat and mouse // Reprod. Fertil. Dev. - 2008. - Vol. 20 (2). -P. 303-310.
13. Hegde U.C., Ranpura S., D'Souza S., Raghavan V.P. Immunoregulatory pathways in pregnancy // Indian J. Biochem. Biophys. - 2001. - Vol. 38 (4). -P. 207-219.
14. Hooper D.C., Chantry D.H., Billington W.D. Murine pregnancy-associated modulations in lymphocyte reactivity to mitogens: identification of the cell populations affected // J. Reprod. Immunol. - 1987. - Vol.
11 (4). - P. 273-286.
15. Norton M.T., Fortner K.A., Bizargity P., Bonney E.A. Pregnancy alters the proliferation and apoptosis of mouse splenic erythroid lineage cells and leukocytes // Biol. Reprod. - 2009. - Vol. 81 (3). - P. 457-464.
16. Norton M.T., Fortner K.A., Oppenheimer K.H., Bonney E.A. Evidence that CD8 T-cell homeostasis and function remain intact during murine pregnancy // Immunology. - 2010. - Vol. 131 (3). - P. 426-437.
17. Kalyuzhin O. V., Zemlyakov A.E., Fuchs B.B. Distinc-
tive immunomodulating properties and interactivity with model membranes and cells of two homologous muramyl dipeptide derivatives // Int. J. Immunophar-macol. - 1996. - Vol. 18 (11). -
P. 651-659.
18. Kwak-Kim J., Park J. Ch., Kyong H. Immunological modes of pregnancy loss // Am. J. Reprod. Immunol. - 2010 - Vol. 63 (6). - P. 611-623.
19. Maroni E.S., de Sousa M.A.B. The lymphoid organs during pregnancy in the mouse. A comparison between a syngeneic and an allogeneic mating // Clin. Exp. Immunol. - 1973. - Vol. 31. - P. 107-124
20. Szekeres-Bartho J., Polgar B., Kozma N., Miko E., Par G., Szereday L., Barakonyi A., Palkovics T., Papp O., Varga P. Progesterone-dependent immuno-modulation // Chem. Immunol. Allergy. - 2005. -Vol. 89. - P. 118-125.
