CC BY
20
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ
ЦИКЛОФОСФАНА
Е.Р. Эрастов, д-р мед. наук, доцент
Нижегородская государственная медицинская академия (Россия, г. Нижний Новгород)
Аннотация. Работа произведена на 38 беспородных собаках-самцах. Воздействие ЦФ - препарата, обладающего сильным цитотоксическим и иммунодепрессивным действием, вызывает серьезные изменения в элементах пирамидной, экстрапирамидной систем и сегментарного отдела мозга. Обнаружены существенные изменения морфометрических параметров нервных и глиальных клеток. Ультраструктурные показатели свидетельствуют о резком нарушении белоксинтетического и энергетического аппарата нейрона. Некоторые изменения выходят за грань функциональных и могут трактоваться как патологические.
Ключевые слова: центральная нервная система - циклофосфан.
Циклофосфан (циклофосфамид) - цито-статический противоопухолевый химиоте-рапевтический лекарственный препарат, обладающий также выраженным иммуно-депрессивным действием с преимущественным угнетением активности В-лимфоцитов. Циклофосфан (ЦФ) широко применяют в онкологии и в смежных с ней медицинских специальностях [1, 2]. Имеются множественные свидетельства об иммунодепрессивном влиянии ЦФ на ге-мопоэз [3], сердечную мышцу [4], другие органы человека. Несмотря на то, что существуют отдельные работы, посвященные функциональным изменениям нервной системы под воздействием ЦФ [5, 6, 7], влияние этого препарата на структуру нервной системы до сих пор остается «белым пятном» экспериментальной биологии и теоретической медицины.
Материал и методы исследования. Работа произведена на 38 беспородных собаках-самцах в соответствии с приказом Минвуза СССР № 742 от 13.11.84 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных». Из 38 животных 26 были интактными, а остальным (12 собак) моделировали полную блокаду иммунного ответа посредством внутривенных струйных инъекций циклофосфа-на.
Для получения более однородного морфологического материала мы соблюдали следующие условия:
1) объектом исследования избрали беспородных собак, отбор которых ограничили по полу (использовали только самцов) и возрасту - 2-3 года;
2) эксперимент и взятие материала проводили исключительно в первую половину дня;
3) все животные содержались в стандартных условиях вивария, получали одинаковое питание и использовались в эксперименте после карантина и снятия обстановочного рефлекса.
Полную блокаду иммунного ответа моделировали посредством внутривенных струйных инъекций ЦФ в дозе 50 мг/кг массы тела один раз в день на протяжении 3 дней подряд. Эта методика иммуноде-прессии применяется при интенсивной подготовке больных острым лейкозом и тяжелой апластической анемией к операции по трансплантации костного мозга [8].
После выполнения последнего эксперимента животному внутривенно вводили 10% раствор тиопентала натрия (из расчета 0,5 мл на кг массы тела). Взятие материала проводили через 30 минут после остановки сердца. При помощи безопасной бритвы извлекали кору головного мозга (поле Ргс1), участок среднего мозга на уровне верхнего двухолмия и четвертый поясничный сегмент спинного мозга. Каждый из взятых отделов разлагали на 2 ку-
сочка. Первый кусочек помещали в 12% раствор формалина для дальнейшей заливки в блоки. Второй кусочек использовали для электронномикроскопического исследования. Специально заточенной иглой для инъекций диаметром 1,0 мм пунктировали кору, крупноклеточную часть красного ядра (КЯ) и передний рог спинного мозга. Полученный при пункции столбик серого вещества помещали в глутаралдегид.
Кусочки нервной ткани, предназначенные для морфометрии, после стандартной спиртовой проводки помещали в парафин-целлоидиновые блоки, которые в дальнейшем резали на санном микротоме (толщина срезов 7 мк) и окрашивали по Нисслю крезиловым фиолетовым.
Электронномикроскопически изучали ультратонкие срезы коры больших полушарий, крупноклеточной части КЯ и передних рогов спинного мозга, приготовленных на ультратоме иКВ-Ш-808А. Кусочки фиксировали в глютаровом альдегиде на фосфатном буфере и дофиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия. Для прицельной заточки блоков на нервные клетки применяли методику полутонких срезов, окрашенных крезиловым фиолетовым.
На препаратах, окрашенных по Нисслю, на микроскопе МБИ-6 при помощи оку-лярмикрометра МОВ-1-15хУ42 (увеличение 750) проводили количественную и качественную оценку нервных и глиальных клеток. На электроннограммах размерами 9х12 качественно оценивали состояние ультраструктур нейронов, сателлитной глии и нейропиля переднего рога спинного
мозга, крупноклеточной части КЯ и пятого слоя моторной коры.
Цифровые данные, полученные перечисленными методами, обрабатывали по правилам вариационной статистики с учетом изменчивости признака в пределах организма при помощи пакета компьютерных программ «DINF-4», «CORR», «STADIA.6.0. for Window».
Изучали четвертый поясничный сегмент спинного мозга - мотонейроны вен-тролатерального ядра и интернейроны VII пластины по Рекседу, нейроны крупноклеточной части красного ядра (КЯ) и пирамидные клетки V слоя моторной коры.
Результаты исследования и их обсуждение. Воздействие ЦФ - препарата, обладающего сильным цитотоксическим и им-мунодепрессивным действием, вызывает серьезные сдвиги в элементах пирамидной, экстрапирамидной систем и сегментарного отдела мозга.
На первое место выступают изменения белоксинтезирующего аппарата нервной клетки. В классической нейроморфологии давно принято судить о функциональной активности нейрона по состоянию вещества Ниссля - белоксинтетического аппарата. При воздействии ЦФ обращает на себя внимание резкое уменьшение по сравнению с интактной группой числа нервных клеток с нормальным распределением тиг-роида (мотонейронов спинного мозга по сравнению с интактной группой меньше на 10,6%, интернейронов на 12,7%, нейронов КЯ - на 14,8% и пирамидных нервных клеток - на 25,2% (р<0,01) (Таб. 1, 2).
Показатели Нормохромия Гиперхромия ХРОМАТОЛИЗ Частичный Тотальный Перинукл. Перифер. Равномерн.
Мотонейроны спинного мозга 81,23+ 1,40 3,69+0,58 12,00+1,01 0,00+ 0,00 2,62+ 0,66 0,46+0,26
Интернейроны спинного мозга 90,46+0,63 5,53+0,45 3,23+ 0,50 0,31+ 0,21 0,46+ 0,26 0,00+0,00
Нейроны крупноклеточной части КЯ 85,43+ 1,43 4,00+0,59 8,86+0,95 0,29+0,28 1,71+0,55 0,00+ 0,00
Пирамидные нейроны моторной коры 73,43+ 1,66 7,14+ 0,86 10,00+1,24 2,00+ 0,91 6,00+ 1,09 1,43+0,53
Таблица 1. Распределение вещества Ниссля в нейронах различных отделов ЦНС ин-тактных животных (%)
Обращает внимание большее, чем у ин-тактных собак, количество клеток с другими видами хроматолиза, а также гипер-хромных нейронов. Особенно это касается моторной коры. Так, среднее число нейронов с тотальным хроматолизом в рассматриваемой экспериментальной группе составило 12,80+0,53%. Предыдущими исследованиями показано, что хроматолиз
тотальный, заключающийся в полном исчезновении базофильного вещества цитоплазмы, наблюдается при преждевременном старении (болезни Альцгеймера) [9], при тяжелой черепномозговой травме [10], при тотальной ишемии [11], при химических [12] и алкогольной интоксикации [13].
Таблица 2. Распределение вещества Ниссля в нейронах различных отделов ЦНС при воздействии ЦФ (%)_
Показатели Нормохромия Гиперхромия ХРОМАТОЛИЗ Частичный Тотальный Перинукл. Перифе ). Равномерн.
Мотонейроны спинного мозга 72,66+ 1,69 9,00+ 1,00 6,33+0,92 0,33+0,33 4,33+ 0,59 7,33+ 0,66
Интернейроны спинного мозга 79,00+1,57 8,00+ 0,69 4,00+0,85 1,33+0,57 3,33+ 0,83 4,33+ 0,77
Нейроны круп-нокле-точной части КЯ 72,8+ 1,96 6,80+ 0,85 8,80+ 0,53 1,60+0,65 3,20+0,53 6,00+ 0,66
Пирамидные нейроны моторной коры 54,8+ 2,46 10,80+ 1,20 8,00+1,19 3,60+0,72 9,20+0,61 12,80+ 0,53
Увеличение объемов нейроцитов, отмеченное при воздействии ЦФ, (таб. 3, 4) происходит в основном за счет динамики объема цитоплазмы. Отечные изменения связаны с нарушением водно-электролитного баланса, возникающего в связи с изменением проницаемости клеточной мембраны. Объем ядер достоверно отличался от интактных собак только в моторной коре (был больше на 19,9%, р<0,05). Изменения объемов глиальных
ядер не показали выраженной динамики. Во всех отделах изучаемой системы, кроме интернейронов, происходит увеличение показателя глиального обеспечения нейрона. Таким образом, при этом воздействии нервная клетка испытывает дефицит трофического обеспечения. Тот факт, что в интернейронах, выполняющих ассоциативную функцию, обнаружена обратная динамика, свидетельствует об их коренных отличиях от двигательных нейронов.
Таблица 3. Морфометрические показатели элементов ЦНС интактных животных
Мотонейроны Интернейроны Нейроны Пирамидные
Показатели спинного спинного крупнокле-точной нейроны Услоя
мозга мозга части КЯ моторной коры
Объем 9039,20+ 3966,77+ 8451,29+ 23839,30+
нейрона (мкм3) 337,44 137,48 380,73 947,53
Коэффициент 1,82+ 1,73+ 1,59+ 2,94+
элонгации нейрона 0,03 0,03 0,046 0,04
Объем 8108,31+ 3421,93+ 7576,57+ 22231,89+849,11
з цитоплазмы (мкм3) 317,91 139,13 334,11
Объем 1035,94+ 559,82+ 874,72 + 1650,29+
3 ядра (мкм ) 42,83 38,66 30,48 78,28
Коэффициент 1,65+ 1,55+ 1,60+ 1,53 +
элонгации ядра 0,05 0,03 0,022 0,03
Ядерноплазматическое 0,12+ 0,15+ 0,12+ 0,072+
отношение 0,007 0,01 0,006 0,004
Диаметр 4,40+ 3,90+ 4,02+ 4,99+
ядрышка (мкм) 0,05 0,04 0,07 0,10
Объем 29,18+ 24,70+ 25,70+ 49,87+
3 глиального ядра (мкм3) 1,05 0,94 1,14 2,82
Коэффициент элонгации 1,37+ 1,53+ 1,44+ 1,49+
глиального ядра 0,01 0,03 0,021 0,02
Отношение объема гли-ального ядра к ядру нейрона(%) 0,022+ 0,001 0,047+ 0,002 0,029+ 0,001 0,031+ 0,002
Суммарная 12,99+ 12,36+ 28,35+
глия 0,43 0,64 0,88
Сателлитная 1,30+ 1,23+ 5,11+
глия 0,10 0,10 0,24
Отношение сателлитной глии к суммарной глие(%) 10,07+ 0,49 - 10,04+ 0,58 25,42+ 1,74
Глиальный 1,45+ 0,83+ 1,29+ 2,03+
индекс 0,06 0,03 0,07 0,12
Глиальное обеспечение 3 нейрона (мкм3) 6343,10+ 345,02 4940,46+ 242,00 6781,62+ 385,89 12129,06+ 683,13
Среди ультраструктурных изменений ЦНС, возникающих при воздействии ЦФ, на первое место выходят нарушения бело-ксинтетического аппарата нейрона. Цистерны эндоплазматической сети резко увеличены, число рибосом и полисом снижено. Выявлена деструкция ядер, заключающаяся в их фрагментации. Ядерная оболочка разрыхлена, часто вдается внутрь ядра, образуя множественные инвагинации. Характерны резкие повреждения
энергетического аппарата в виде разрушения наружных мембран митохондрий, значительной деструкции крист. Обнаруживаются следы митохондрий и митохондрии, полностью лишенные крист. Число лизосом увеличено, часто встречаются ли-пофусциновые гранулы. В нейропиле отмечено множественное разволокнение миелиновых оболочек аксонов, в равной степени присущее всем изучаемым отделам ЦНС.
Таблица 4. Морфометрические показатели элементов ЦНС животных при воздействии ЦФ_
Мотонейроны Интернейроны Нейроны крупно- Пирамидные
Показатели спинного спинного кле- точной нейроны ^лоя
мозга мозга части КЯ моторной коры
Объем 10752,69 +663,30 3047,50+ 8114,72+ 27030,30+
нейрона (мкм3) 271,66 744,00 822,43
Коэффициент 1,57+ 1,72+ 1,64+ 2,89+
элонгации нейрона 0,03 0,03 0,04 0,04
Объем 9620,32+ 2446,01+ 7233,32+ 25052,15+
цитоплазмы (мкм3) 659,55 119,67 700,78 732,11
Объем 1132,42+ 611,58+ 881,20+ 1978,14+
ядра (мкм3) 61,31 46,25 49,79 98,04
Коэффициент 1,52+ 1,60+ 1,59 + 1,25 +
элонгации ядра 0,04 0,03 0,02 0,021
Ядерноплазматическое 0,11+ 0,20+ 0,13 + 0,08 +
отношение 0,007 0,009 0,010 0,005
Диаметр 3,81+ 3,68+ 3,95+ 4,69+
ядрышка (мкм) 0,06 0,05 0,06 0,05
Объем 30,58+ 24,28+ 29,73+ 51,02+
глиального ядра (мкм3) 1,88 1,22 1,27 3,55
Коэффициент элонгации 1,47+ 1,51+ 1,47+ 1,25+
глиального ядра 0,03 0,05 0,03 0,02
Отношение объема гли-ального ядра к ядру нейрона(%) 0,028+ 0,002 0,042+ 0,004 0,034+ 0,001 0,080+ 0,005
Суммарная 13,00+ 10,95+ 27,99+
глия 0,33 3,63 0,77
Сателлитная 1,42+ 1,56+ 6,48+
глия 0,11 0,10 0,68
Отношение сателлитной глии к суммарной глие(%) 11,01+ 0,56 - 14,87+ 0,55 22,50+ 2,06
Глиальный 1,40+ 0,84+ 1,03+ 2,21+
индекс 0,06 0,05 0,05 0,09
Глиальное обеспечение 7812,46 3712,87+ 7983,33 12472,20+
нейрона (мкм3) +524,05 185,75 714,83 717,11
Ультраструктурные изменения свиде- свидетельствует о дистрофических изме-тельствуют о резком нарушении белоксин- нениях нервной клетки [14]. тетического и энергетического аппарата Таким образом, воздействия ЦФ приво-
нейрона. Отмеченная нами деструкция дят к значительным изменениям структур-ядер описана ранее при воздействии ЦФ. но-функциональной перестройки изучае-Появление в цитоплазме нейронов боль- мых отделов мозга, некоторые из которых шого количества липофусциновых гранул можно считать патологическими.
Библиографический список
1. Тюляндина А.С. Лекарственное лечение рака яичников // Практическая онкология. -2014. - Т.15. - №4(60). - С. 168-175.
2. Влияние количества мобилизованных cd34+ клеток на выживаемость больных множественной миеломой после аутологичной трансплантации / Боева Э.А., Покровская О.С., Менделеева Л.П. и др. // Вестник гематологии. - 2014. - Т.10. - №2. - С. 9-10.
3. Коррекция токсического влияния циклофосфана на гемопоэз животных с карциномой легких льюис с помощью низкомолекулярных альгинатов натрия/ Рыбалкина О.Ю., Ермакова Н.Н., Разина Т.Г и др. // Биология моря. - 2015. - Т. 41. - № 5. - С. 366-373.
4. Влияние препаратов с противоопухолевой активностью - доксорубицина и цикло-фосфана - на структурную реорганизацию миокарда крыс и численность кардиомиоцитов
/ Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Клинникова М.Г. и др. // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - №4. - С. 30-35.
5. Колесников О.Л, Артамонов С.А. Влияние циклофосфана на тревожность мышей с различным исходным состоянием нервной системы / 1-й Российско-чешский медицинский форум. Сборник материалов,2006. - С. 182-184.
6. Отягощение острых неврологических расстройств, вызванных циклофосфаном, при искусственном снижении РН химуса у крыс / Шефер Т.В., Рейнюк В.Л., Малаховский В.Н. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153. -№ 6. - С. 841-845.
7. Experimental study of ultralow-dose antibodies to cyclophosphamide on cyclophosphamide myelotoxicity / Zhdanov V.V., Khrichkova T.Y., Stavrova L.A. et al. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2009. - Т. 147. - № 3. - С. 323-327.
8. Гаврилов О.К., Файнштейн Ф.Э., Турбина Н.С. Депрессии кроветворения. - М.: Медицина, 1987. - 256 с.
9. Максимова К.Ю., Стефанова Н.А., Логвинов С.В. Морфологические изменения нейронов в гиппокампе крыс при преждевременном старении // Бюллетень сибирской медицины. - 2014. - Т.13. - №1. - С. 56-61.
10. Влияние нейропротекторной терапии на морфофункциональные изменения в ткани головного мозга при тяжелой черепно-мозговой травме (экспериментальное исследование) / Мамытова Э.М., Кадыралиев Т.К., Сулайманов М.Ж. и др.//Наука, новые технологии и инновации. - 2011. - № 6. - С. 85-89.
11. Нейроглиальные взаимоотношения в коре головного мозга крыс при тотальной транзиторной ишемии / Жданкина А.А., Плотникова М., Осипенко А.Н. и др. // Морфология. - 2016. - Т.143. - №3. - С. 81-81а.
12. Сравнительное изучение нейротоксического действия солей лития / Балашов П.П., Аникина Е.Ю., Плотников Е.В. и др. // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. -2008. - № 4. - С. 83-84.
13. КринецкаяЮ.А., Оганесян М.В. Субстанция Ниссля в нейроне и явление хроматолиза //Молодой ученый: вызовы и перспективы. Сборник статей по материалам XXIII международной научно-практической конференции. -2016. - С. 189-195.
14. Moore W., Davey V. Lipofuscin accumulation in mouse brain with age: effects of caloric restriction // Age. - 1995. - V.18. - №4. - P. 217-218.
STRUCTURAL CHANGES IN THE NERVOUS SYSTEM UNDER THE INFLUENCE
OF CYCLOPHOSPHAMIDE
E.R. Erastov, doctor of medical sciences, associate professor Nizhny Novgorod state medical academy (Russia, Nizhny Novgorod)
Abstract. The work produced in 38 mongrel dogs-males. The impact of TSF - drug, with strong cytotoxic and immunosuppressive effect, causing major changes in the elements of the pyramidal, extrapyramidal systems and SEG-Manturovo of the brain. Found significant changes of morphometric parameters of nerve and glial cells. Ultrastructural indicators that exist about sudden abnormal protein synthetical and energy apparatus of the neuron. Some changes go way beyond the functional and can be interpreted as PA-tragicheskie.
Keywords: Central nervous system cyclophosphamide.
