CC BY
1
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ / LOMONOSOV BIOLOGY JOURNAL. 2023. Т. 78. № 3S. C. 47-50 47
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
УДК 577.217
Структурное исследование рибосомы Candida auris
A.A. Атамас*©, А.И. Гуськов, A.B. Рогачев
Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический университет, Россия, Московская область, 141701, г. Долгопрудный, Институтский пер., 9 'e-mail: atamas.aa@phystech.edu
Candida auris — патогенный грибок, вызывающий инфекции у людей с ослабленной иммунной системой. Он устойчив к антимикробным препаратам, что усложняет лечение. C. auris представляет серьезную угрозу для здоровья населения, так как имеет высокую резистентность и контагиозность. Поскольку рибосома играет ключевую роль в жизнедеятельности организмов, поиск ингибиторов рибосомы C. auris имеет большое практическое значение. Мы использовали криоэлектронную микроскопию и анализ отдельных частиц для получения трехмерной структуры рибосомы C. auris. Мы описываем особенности рибосомальной РНК C. auris, что предоставляет ценную информацию для разработки лекарственных средств для борьбы с данным патогеном.
Ключевые слова: Candida auris, рибосома, инфекции, резистентность, криоэлектронная микроскопия, структурная биология
DOI: 10.55959/MSU0137-0952-16-78-3S-8
Введение
Candida auris является патогенным грибком, способным вызывать инфекции у людей, особенно у пациентов с ослабленной иммунной системой. Одной из особенностей C. auris является его устойчивость к широкому спектру антимикробных препаратов, что влечет за собой сложности в лечении инфекций, обусловленных данным патогеном. В связи с его резистентностью и высокой контагиозностью, C. auris представляет серьезную угрозу для здоровья населения [1]. Рибосома, как одна из ключевых молекулярных мишеней, критически необходима для выживания и развития этой инфекции. В связи с этим поиск видоспеци-фичных низкомолекулярных ингибиторов рибосомы C. auris является клинически-значимой задачей. Для определения уникальных сайтов связывания ингибиторов рибосомы необходима трехмерная атомарная модель.
Используя криоэлектронную микроскопию и метод анализа отдельных частиц мы впервые получили трехмерную структуру рибосомы C. auris с разрешением 2, Детальный анализ структуры с использованием UCSF Chimera позволил обнаружить ранее неизвестные конформационные изменения в рибосоме C. auris, которые могут быть связаны с механизмами резистентности к антибиотикам. Мы описываем архитектуру рибосомальной РНК, а также ее интересные особенности. Эти находки предоставляют ценную информацию
© Атамас A.A., Гуськов А.И., Рогачев А.В., 2023
для разработки более эффективных стратегий борьбы с C. auris и улучшения прогноза заболеваний, связанных с этим патогеном.
Наше исследование подчеркивает важность электронной микроскопии в изучении структурных и функциональных характеристик рибосомы C. auris. Полученные результаты способствуют дальнейшему пониманию этого патогена и могут быть использованы в разработке новых стратегий лечения инфекций, вызванных C. auris.
Материалы и методы
Очистка рибосом. 80S-рибосомы C. auris очищали, следуя ранее опубликованному протоколу [2]. Клетки растили в колбах в среде дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (yeast extract peptone dextrose, YPD) при 30°C. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали с YPD и инкубировали в колбах при интенсивном встряхивании (250 об./мин) в течение 10 мин. Клетки осаждали и трижды промывали в буфере М (30 мМ HEPES-KOH (рН 7,5), 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 8,5% маннит, 2 мМ дитиотре-итола (ДТТ) и 0,5 мМ ЭДТА). Суспензию клеток механически разрушали стеклянными шариками (Sigma-Aldrich, США) на вортексе с частотой 40 Гц в течение 1 мин с 1-минутными перерывами на льду между каждым встряхиванием. Стеклянные шарики удаляли быстрым центрифугированием (20 000 g в течение 2 мин), а лизат
48 A.Ä. Атамас, А.И. Гуськов, А.В. Рогачев
дополнительно очищали более длительным центрифугированием (30 000 g в течение 9 мин). Затем добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ) 20000 (Hampton Research, США) до конечной концентрации 4,5% (масса/объем), и раствор оставляли стоять на льду в течение 5 мин. Раствор осветляли центрифугированием (20 000 g, 5 мин). Затем концентрацию ПЭГ 20000 доводили до 8,5% и раствор оставляли на 10 мин на льду. Рибосомы осаждали (17 500 g в течение 10 мин) затем суспендировали в буфере М+ (буфер М, содержащий KCl в концентрации 150 мМ, с добавлением ингибиторов протеаз и гепарина).
Далее рибосомы очищали в градиенте сахарозы от 10 до 30%, а после отбирали соответствующие фракции и добавляли ПЭГ 20000 до конечной концентрации 7% (масса/объем). Рибосомы осаждали (17 500 g в течение 10 мин.) и суспендировали в буфере G (10 мМ Hepes-KOH (pH 7,5), 50 мМ KOAc, 10 мМ NH4OAc, 2 мМ DTT и 5 мМ Mg(OAc)2).
Криоэлектронная микроскопия: замораживание сеток и обработка изображений. Образец очищенной рибосомы с концентрацией ~1 мг/мл по 2,7 мкл наносили на углеродные сетки (Quantifoil Cu R1.2/1.3 с ультратонкой углеродной подложкой, 200 меш; Quantifoil, Германия), избыток жидкости удаляли в течение 3—5 с помощью FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, США), и замораживали погружением в жидкий этан. Подготовленные сетки переносили в микроскоп Talos Arctica 200 кэВ (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенный детектором прямых электронов К2. Изображения с нулевыми потерями записывались полуавтоматически с использованием скрипта UCSF Image. Квантовый энергетический фильтр GIF был настроен на ширину щели 20 эВ. Изображения были получены при различном номинальном увеличении с размером пикселя от
0,413 до 1,012 А и с диапазоном дефокуса от -0,5 до -3,0 мкм. Видеоизображения были собраны с 24 кадрами, фракционированными по дозе в течение 18 с.
Обработка данных. После выполнения процедур коррекции подвижек и оценки функции переноса контраста в программном комплексе CryoSPARC [3], была произведена отбраковка микрографов по значениям функции переноса контраста и общей величины подвижек. Выборка частиц наилучшего качества производилась путем генерации двумерных классов. Дальнейшая от-фильтровка производилась путем генерации трехмерной реконструкции с разделением на два пространственных объекта. Финальная реконструкция была произведена по протоколу Nonuniform refinement в программном комплексе CryoSPARC с финальным разрешением 2,8 А.
Моделирование. Структура рибосомы 80S Candida albicans использовалась в качестве шаблона для построения модели. Сопоставление модели с картой было выполнено в Chimera [4]. Субъединицы 60S и 40S были уточнены отдельно в их соответствующих сфокусированных картах с использованием уточнения Phenix [5] в прямом пространстве. Цепи белков и рРНК визуально проверяли в Coot и при необходимости корректировали вручную.
Результаты и обсуждение
При создании модели рибосомы C. auris использовалась ранее полученная модель C. albicans (7PZY), что позволило выявить ряд интересных особенностей полученной структуре рибосомы. Биоинформатический анализ рибосомальных белков С. albicans и С. auris показал, что они не имеют значительных отличий и обладают высокой гомологией. Однако, несмотря на ожидаемую высокую консервативность рибосомальной РНК в пределах
Рисунок. Сравнение 25S рРНК Candida albicans с картой плотности для рРНК Candida auris. A — отсутствие плотности для некоторых нуклеотидов, указывающая на делецию в цепи рРНК C. auris; Б — плотность, несоответствующая геометрии цепи РНК, указывающая на изменение конфигурации цепи рРНК C. auris.
СТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РИБОСОМЫ CANDIDA AURIS
49
одного вида, сравнение рРНК C. albicans с картой плотности для рРНК C. auris выявило наличие некоторых отличающихся участков.
Значительных отличий у 5.8S и 5S рРНК у C. albicans и C. auris не выявлено, но 25S рРНК у C. auris имеет некоторые особенности (рисунок). Наблюдается отсутствие плотности для некоторых нуклеотидов (рисунок, А), из чего можно предположить, что последовательность рРНК C. auris короче таковой у C. albicans. Так же было выявлено изменение геометрии некоторых участков (рисунок, Б), что может влиять на взаимодействие рРНК с рибосомальными белками или химическими соединениями, играющими роль ингибиторов рибосомы.
На данный момент рибосомальная РНК C. auris не была полностью расшифрована, что ограничивает наши возможности сделать окончательные выводы о характеристиках и влиянии найденных особенностей рРНК на резистентность этого патогена. Изучение и расшифровка рибосо-мальной РНК C. auris может предоставить более глубокое понимание ее структурных и функциональных особенностей, а также позволить прояснить причины устойчивости этого патогена к противогрибковым препаратам.
Дальнейшие исследования рибосом C. auris, включая полное расшифрование его рибосомной
РНК, анализ его белковых компонентов и сравнение с рибосомами других видов Candida, могут пролить свет на механизмы устойчивости C. auris и помочь развить эффективные стратегии борьбы с этим патогеном.
Заключение
Исследование структуры рибосомы C. auris с использованием криоэлектронной микроскопии и анализа отдельных частиц позволило обнаружить конформационные изменения, которые возможно связаны с резистентностью к антибиотикам. Описание архитектуры рибосомы и ее субъединиц предоставляет ценную информацию для борьбы с C. auris и улучшения прогноза заболеваний, вызванных этим патогеном. Полученные результаты подчеркивают важность электронной микроскопии для изучения аппарата трансляции этого патогена и могут привести к разработке новых стратегий лечения и предотвращения инфекций, вызванных C. auris.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-6447041). Исследования проведены без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lockhart S.R., Etienne K.A., Vallabhaneni S., et al. Simultaneous emergence of multidrug-resistant Candida auris on 3 continents confirmed by whole-genome sequencing and epidemiological analyses. Clin Infect Dis. 2017;64(2):134—140.
2. Zgadzay Y., Kolosova O., Stetsenko A., Wu C., Bruchlen D., Usachev K., Validov S., Jenner L., Ro-gachev A., Yusupova G., Sachs M.S., Guskov A., Yu-supov M. E-site drug specificity of the human pathogen Candida albicans ribosome. Sci. Adv. 2022;8(21):eabn1062.
3. Punjani A., Rubinstein J., Fleet D., Brubaker M. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat. Methods 2017;14(3):290-296.
4. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., Ferrin T.E. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. J. Comput. Chem. 2004;25(13):1605-1612.
5. Liebschner D., Afonine P.V., Baker M.L., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallogr. D: Struct. Biol. 2019;75(10):861-877.
Поступила в редакцию 29.05.2023 После доработки 16.08.2023 Принята в печать 17.08.2023
SHORT COMMUNICATION
Structural study of the Candida auris ribosome
AA. Atamas*©, A.I. Guskov, A.Y. Rogachev
1Center for Research on Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow University of Physics and Technology,
9 Institutskiyper., Dolgoprudny, 141701, Moscow region, Russia *e-mail: atamas.aa@phystech.edu
Candida auris is a pathogenic fungus that causes infections in people with weakened immune systems. It is resistant to antimicrobial drugs, which complicates treatment. C. auris poses a serious threat to public health, as it has a high resistance and contagiousness. The ribosome plays an important role in the survival and development of this infection, and the search for inhibitors
50
А.А. Атамас, А.И. Гуськов, А.В. Рогачев
of the C. auris ribosome is of great importance. We used cryoelectron microscopy and single particle analysis to obtain the three-dimensional structure of the C. auris ribosome. We describe the architecture of the ribosome subunits and their interactions, providing valuable information for the development of novel anti-fungals against C. auris.
Keywords: Candida auris, ribosome, infections, resistance, cryo-electron microscopy, structural biology
Funding: The research was funded by Russian Science Foundation, project number 20-64-47041.
Сведения об авторах
Атамас Анастасия Алексеевна — аспирантка, мл. науч. сотр. Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний. Тел.: 8-495-408-45-54; e-mail: atamas.aa@phystech.edu; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7884-7653 Гуськов Альберт Игоревич — канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр., зав. лабораторией структурной электронной микроскопии биологических систем. Тел.: 8-495-408-45-54; e-mail: a.guskov@rug.nl
Рогачев Андрей Вячеславович — канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр., зам. директора центра молекулярных механизмов старения. Тел.: 8-495-408-45-54; e-mail: rogachev.av@ phystech.edu
