CC BY
58
Также тесная обратная корреляционная зависи- ЛИТЕРАТУРА
мость установлена между долей пациентов с диагнозом 1. Герасимов А. Н. Медицинская статистика. МИА. - М.,
«цервикокраниалгия» и коэффициентом физической 2007. - 350 с.
активности с высокой степенью значимости (г = -0,89) 2. Елисеева И. И., Юзбашев М. М. Общая теория статистики. -
и уровнем значимости Р<0,01 . М.: «Финансы и статистика», 2003. - 520 с.
3. Кривуля С. Д., Коршунов Ю. Н. Железнодорожная ме-
Обсуждение дицина: Руководство / В. М. Сибилев, Ю. Н. Коршунов, А. З.
Во всех группах независимо от степени тяжести Цфасман. - М., 1991. - Том 2. - С. 10-33.
труда наибольшую долю составляли пациенты с люм- 4. Методические рекомендации МР 2.3.1.2432-08, утвержден-
боишиалгией. Причем доля этих пациентов возрастает ные главным государственным санитарным врачом РФ Г. Г. Они-
в зависимости от степени тяжести труда. щенко 18.12.2008 г. - С. 9.
С увеличением КФА (коэффициента физической ак- 5. Попелянский Я. Ю., Штульман Д. Р. Боли в шее, спине,
тивности) изменяется локализация болей. Тесная пря- конечностях // Болезни нервной системы: Руководство для вра-
мая корреляционная зависимость с высокой степенью чей. - М.: Медицина, 2003. - 489 с.
значимости получена при диагнозах «люмбалгия» и 6. Попелянский Я. Ю. Ортопедическая неврология (вер-
«люмбоишиалгия». Тесная обратная корреляционная теброневрология). - М.: Медпресс-информ, 2003. - 670 с. зависимость с высокой степенью значимости получена
при диагнозах «цервикалгия» и «цервикокраниалгия». Поступила 04.06.2009
А. В. ШЕСТОПАЛОВ, В. Г. ОВСЯННИКОВ, Н. С. АЛЕКСЕЕВА
СТРУКТУРНО-ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ
АКТИВАЦИИ НЕИТРОФИЛОВ В ОТВЕТ НА ОСТРУЮ ВИСЦЕРАЛЬНУЮ БОЛЬ
Кафедра патологической физиологии ГОУ ВПО РостГМУ Росздрава, Россия, 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29. E-mail: nataalexeeva@gmail.com
В опытах на крысах исследовано влияние острой висцеральной боли на морфофункциональное состояние нейтрофилов. Оценивались активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы нейтрофилов и степень насыщения их гликогеном.
Установлено, что вовлечение системы белой крови в алгогенный процесс сопровождается нарастанием активности миелопероксидазы и снижением активности щелочной фосфатазы нейтрофилов. Степень насыщения этих клеток гликогеном прогрессивно снижается. Через 2 часа после нанесения болевого раздражения описанные отклонения нивелируются.
Ключевые слова: висцеральная боль, миелопероксидаза, щелочная фосфатаза, гликоген, функциональная активность нейтрофилов.
А. V. SHESTOPALOV, V. G. OVSYANNIKOV, N. S. ALEXEEVA
STRUCTURAL-CYTOCHEMICAL CRITERIA OF ACTIVITY OF THE NEUTROPHILS DUE TO INFLUENCE OF ACUTE VISCERAL PAIN
Department of Pathological Physiology, Rostov State Medical University, Russia, 344022, Rostov-on-Don, Nakhichevanskij str., 29. E-mail: nataalexeeva@gmail.com
Functional condition of neutrophils due to acute visceral pain was investigated on adult male rats. Activity of myeloperoxidase, alkaline phosphatase and degree of glycogen saturation of neutrophils were estimated.
It is established, that involving of system of white blood cells in the painful process is accompanied by increase of myeloperoxidase activity and decrease of alkaline phosphatase activity in the neutrophils. Degree of glycogen saturation of neutrophils progressively decreases. The described deviations are disappeared in 2 hours after acute visceral pain.
Key words: visceral pain, myeloperoxidase, alkaline phosphatase, glycogen, functional activity of neutrophils.
Введение
Важными ферментами, обеспечивающими переваривающую функцию фагоцитов, являются миелопе-роксидаза, фосфатазы, а основным энергетическим субстратом, обеспечивающим их функцию, является глюкоза, депонированная в форме гликогена.
При том, что решающая роль этих субстратов ни у кого сегодня не вызывает сомнения, остаются неоднозначно трактуемые отдельные позиции.
Они прежде всего касаются роли и последовательности вступления в процесс ферментов, несущих в себе далеко неоднозначные функции.
Исходным постулатом в этом отношении следует принять тезис А. Н. Маянского и Д. Н. Маянского, которые пишут: «Принципиальный этап в учении об антимикробной функции нейтрофила - развитие представлений о том, что умерщвление бактерий (киллинг-эффект) не имеет отношения к деградации (перевариванию) мертвых объектов - убитых микробов...» [6].
Относительно роли пероксидазы как маркерного фермента [4], обеспечивающей образование активных кислородных метаболитов сомнений нет, а вот роль, последовательность и время вступления в процесс щелочной фосфатазы так однозначно не воспринимаются.
С. Ю. Знагован [5], Г. Г. Федотова и Р. Е. Киселева [14] отмечают чрезвычайно низкую активность щелочной фосфатазы в лейкоцитах в покое. Вероятно, этот фермент является индуцибельным. В пользу этого свидетельствует тот факт, что гормоны стресса, в том числе и болевого стресса, активируют щелочную фосфатазу нейтрофилов [3, 24]. Создается впечатление, что щелочная фосфатаза, гидролизуя органические фосфаты и дестабилизируя защитные структуры, подготавливает микроорганизмы к действию на них веществ с высокой киллинговой активностью [13, 14, 19, 21].
Другая точка зрения более логичная и соответствует представлениям А. Н. Маянского и Д. Н. Маян-ского, признает киллинговый эффект, обеспечиваемый цепью превращений активных форм кислорода, в начале которой находится миелопероксидаза [7], с последующей деградацией элементов, убитых бактерий кислой и щелочной фосфатазами [18]. Благодаря чему, собственно, фагоцитоз и принимает завершенный характер.
Методика исследования
Работа основана на использовании экспериментального материала. Исследования выполнены на 20 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах. Исследовалось содержание миелопероксидазы, щелочной фосфатазы и гликогена в лейкоцитах крови. Забор крови производился в исходном состоянии, через 2 минуты, 60 минут, 120 минут после острой висцеральной боли (ОВБ) у каждого животного.
Для воспроизведения ОВБ 4-5-й степени интенсивности у крыс использовали метод ректальной электростимуляции [12]. На основании анализа поведенческих и вегетативных реакций опытных животных оценивали интенсивность болевого раздражения в соответствии с критериями, предложенными А. В. Валь-дманом с соавт. [1], Ю. Н. Васильевым с соавт. [2].
Для определения миелопероксидазы в лейкоцитах использовали метод Леле [11]; щелочной фосфатазы -метод азосочетания по Хейхоу и Кваглино [22, 16]; содержания гликогена - метод ШИК-реакции по Мак-Манусу [9]. Интенсивность цитохимических реакций в лейкоцитах оценивали путем полуколичественного анализа микроскопически, используя следующие градации характера реакции в отдельных клетках: 0 - в цитоплазме нет позитивно окрашенного материала; + (I) - в цитоплазме клеток выявляются рассеянные гранулы или «венчик» из одного ряда позитивно окрашенных гранул; ++ (II) -в цитоплазме клеток выявляется «венчик» из 2 рядов позитивно окрашенных гранул; +++ (III) - в цитоплазме клеток выявляется «венчик» из 3 и более рядов позитивно окрашенных гранул или блоков.
Средний цитохимический коэффициент (К) - интегральная величина, характеризующая суммарную активность фермента, вычисляется по формуле:
K=((N|x1)+(N||x2)+(N|||x3))/N,
где N - общее число клеток, участвующих в цитохимической реакции,
N, - число клеток, относящихся к I группе,
NM - число клеток, относящихся ко II группе,
N||| - число клеток, относящихся к III группе.
Результаты исследования
В исходном состоянии миелопероксидаза обнаруживается на базальном уровне во всех исследованных клетках, о чем свидетельствует средний цитохимический коэффициент, равный 1,76±0,01.
Через 2 минуты после нанесения болевого раздражения регистрируется активация миелопероксидазы. Об этом можно судить прежде всего по достоверному повышению значения среднего цитохимического коэффициента до 1,98±0,01 (р<0,05).
При оценке распределения миелопероксидазы в нейтрофилах отмечаются уменьшение количества клеток с низким содержанием гранул фермента и возрастание количества клеток со средними и высокими показателями (табл. 1).
Наиболее выраженное увеличение активности миелопероксидазы отмечается через 1 час после алго-генного воздействия. Средний цитохимический коэффициент в этот срок приобретает значение 2,09±0,02 (р<0,001). При этом треть клеток характеризовалась максимальным содержанием гранул с миелоперок-сидазой, а число клеток с минимальной активностью фермента уменьшилось еще значительнее.
Таким образом, через 1 час активность миелоперок-сидазы в нейтрофилах достигает максимальных значений, о чем свидетельствуют не только существенное увеличение среднего цитохимического коэффициента, но и преобладание в картине белой крови нейтрофи-лов, в цитоплазме которых обнаруживается «венчик» из трех и более рядов позитивно окрашенных гранул. Все выявленные показатели существенно отличаются от исходных, что подтверждается статистическим анализом (р<0,05 во всех случаях).
Через 2 часа пероксидазная активность снижается. Средний цитохимический коэффициент практически не отличается от исходного: 1,79±0,03 против 1,76±0,01 (р>0,05). В общей гамме клеток превалируют нейтро-филы с умеренно выраженным содержанием гранул миелопероксидазы.
Таким образом, отмеченное нарастание активности миелопероксидазы в нейтрофилах в течение часа свидетельствует о вовлечении этого фермента в алго-генный процесс. Заметим при этом, что в параллельно проводимых экспериментах через час после болевого воздействия мы наблюдали максимальную способность стимулированных фагоцитов генерировать активные формы кислорода.
К этому следует добавить, что нейтрофилы, в принципе, обладают выраженной фоновой пероксидазной активностью. В их клетках как в покое, так и при стимуляции присутствуют позитивно-окрашенные гранулы. Клетки, не содержащие таких гранул, практически не встречаются.
Исходный уровень щелочной фосфатазы достаточно высок. В покое 62±2,34% клеток имеют максимальное
Таблица 1
Активность миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов в динамике эксперимента
Динамика эксперимента Степень цитохимических реакций, % К ср. цх. % полож. кл.
0 I II III
М±т М±т М±т М±т М±т
Исх. фон 0 36±1,48 52±1,48 12±1,01 1,76±0,01 100
2 мин после ОВБ 2±0,322 30±2,172 40±1,362 28±2,052 1,98±0,012 98
60 мин после ОВБ 0 25±1,562 41±1,532 34±1,12 2,09±0,022 100
120 мин после ОВБ 0 30±2,282 61±5,52 9±0,172 1,79±0,03 100
Примечание: К ср. цх. - средний цитохимический коэффициент,
1 - тенденция к изменению по сравнению с исходным фоном по ^критерию Стьюдента
(0,1 >р >0,05),
2 - достоверные различия по сравнению с исходным фоном по ^критерию Стьюдента (р<0,05).
Таблица 2
Активность щелочной фосфатазы лейкоцитов в динамике эксперимента
Динамика эксперимента Степень цитохимических реакций, % К ср. цх. % полож. кл.
0 I II III
М±т М±т М±т М±т М±т
Исх. фон 0 6±1,1 32±2,52 62±2,34 2,56±0,04 100
2 мин после ОВБ 4±0,082 26±2,142 50±1,852 20±2,332 1,86±0,042 96
60 мин после ОВБ 3±0,022 20±1,522 42±2,872 35±2,032 2,15±0,041 97
120 мин после ОВБ 0 4±1,08 25±3,322 71±2,512 2,67±0,03 97
Примечание: К ср. цх. - средний цитохимический коэффициент,
1 - тенденция к изменению по сравнению с исходным фоном по ^критерию Стьюдента
(0,1 >р >0,05),
2 - достоверные различия по сравнению с исходным фоном по критерию Стьюдента (р <0,05).
Таблица 3
Распределение гликогена в лейкоцитах в динамике эксперимента
Динамика эксперимента Степень цитохимических реакций, % К ср. цх. % полож. кл.
0 I II III
М±т М±т М±т М±т М±т
Исх. фон 1 ±0,56 40±3,5 52±1,48 7±1,06 1,67±0,04 99
2 мин после ОВБ 3±0,372 56±4,562 40±1,992 1±0,012 1,43±0,032 97
60 мин после ОВБ 3±0,452 60±3,822 33±2,132 4±0,012 1,42±0,042 97
120 мин после ОВБ 2±0,1 34±2,1 56±1,581 8±0,95 1,73±0,03 98
Примечание: К ср. цх. - средний цитохимический коэффициент,
1 - тенденция к изменению по сравнению с исходным фоном по ^критерию Стьюдента
(0,1 >р >0,05),
2 - достоверные различия по сравнению с исходным фоном по ^критерию Стьюдента (р<0,05).
присутствие позитивно-окрашенных гранул, в то время как на долю клеток с низкой активностью приходится 6±1,1%. Клетки, не содержащие гранулы исследуемого материала, практически не встречаются, и средний цитохимический коэффициент равен 2,56±0,04.
Через 2 минуты после нанесения болевого раздражения наблюдается достаточно выраженное измене-
ние в распределении нейтрофилов по степени активности в них щелочной фосфатазы. В общем ансамбле доминируют клетки, имеющие низкую и умеренную активность щелочной фосфатазы.
Интегральная относительная величина, характеризующая активность щелочной фосфатазы - средний цитохимический коэффициент, показывает снижение активности
исследуемого фермента (К=1,86±0,04) относительно исходных значений этого показателя (2,56±0,04) (р<0,05).
Через 1 час активность щелочной фосфатазы выросла, но не достигла исходного уровня, и средний цитохимический коэффициент составил 2,15±0,04. Также в этот срок отмечено умеренное восстановление содержания клеток с высокой активностью фермента.
Через 2 часа отмечается умеренное повышение активности щелочной фосфатазы в сравнении с исходным фоном. Этот период характеризуется отсутствием ШИК-негативных клеток и увеличением количества нейтрофилов с высокой активностью щелочной фосфатазы. Средний цитохимический коэффициент соответственно вырос и составил 2,67±0,03 против исходного 2,56±0,04 (р<0,05).
Таким образом, нанесение болевого раздражения приводит к снижению активности щелочной фосфата-зы уже через 2 минуты от начала эксперимента. Через час активность щелочной фосфатазы приближается к исходной, а к двум часам несколько превосходит ее.
Уже через 2 минуты сократилась доля клеток, имеющих максимальное и умеренное содержание гликогеном, а средний цитохимический коэффициент снизился до 1,43±0,03 (р<0,05) (табл. 3).
Болевой стресс сопровождается мобилизацией глюкозы лейкоцитов, что свидетельствует о функциональной перестройке активности клеток.
Мобилизация гликогена оказалась стремительной и стойкой. В течение часа цифровые значения его содержания не претерпевали метаморфозы.
Через два часа после нанесения болевого раздражения запасы гликогена восстанавливаются и даже превосходят исходный уровень. Существенно возросло относительное количество клеток с высоким и умеренным содержанием гликогена, а средний цитохимический коэффициент составил 1,73±0,03.
Обсуждение результатов
Щелочная фосфатаза - это фермент, который дефос-форилирует субстрат в результате гидролиза сложноэфир-ной связи и поддерживает буферный потенциал клетки. Через эти и другие механизмы щелочная фосфатаза наряду с другими ферментами создает микробицидный потенциал фагоцитов. М. Г. Шубич и Б. С. Нагоев [18] описывают более пятидесяти заболеваний, в острую фазу которых активность щелочной фосфатазы нейтрофилов повышается.
Казалось бы, и в нашей работе есть основания ожидать повышения активности щелочной фосфатазы.
Однако этого не происходит. В опытах мы наблюдали иную реакцию. В то же время активность миело-пероксидазы возрастает практически сразу, достигает своего максимума через один час после электроболевого раздражения и только через два часа возвращается к исходным значениям.
Между миелопероксидазой и щелочной фосфата-зой устанавливаются в динамике висцеральной боли реципрокные отношения. Увеличение активности одного фермента сопровождается снижением другого, и наоборот [8].
В нашем же случае повышение активности миело-пероксидазы сопровождалось угнетением активности щелочной фосфатазы.
Затем оба фермента, один понижая, а другой - повышая свою активность, возвращаются к исходному уровню, но никак не к полярному состоянию.
Процесс образования активных форм кислорода и солидарное вовлечение в процесс миелопероксидазы протекают перманентно на базальном уровне. Это позволяет запустить механизм микробицидности буквально в считанные секунды [23, 26].
В условиях отсутствия объекта приложения, т. е. микробов, мишенью микробицидного потенциала могут стать структуры клеток и тканей [10, 20, 25].
Именно с этих позиций мы можем объяснить, почему активность щелочной фосфатазы падает уже через 2 минуты после болевого раздражения, затем снижение продолжается и только через 2 часа, когда активность миелопероксидазы возвращается к норме, принимает исходные значения и даже несколько превосходит их, демонстрируя тем самым готовность участвовать в процессах микробной деградации. Мы бы нашли оправданным быстрое снижение активности миелоперок-сидазы, если бы процесс фагоцитоза носил реальный характер, но этого нет. Вот почему, возможно, миело-пероксидаза наращивает и сохраняет свою активность достаточно долго, препятствуя активации щелочной фосфатазы.
Судя по полученным результатам, срабатывает стереотип функциональной деятельности фагоцитов, что требует субстратного обеспечения, и это объясняет, почему в пределах двух часов уровень гликогена в клетках падает: он расходуется. Это согласуется с мнением, что любая реакция, требующая от нейтрофи-ла напряжения, сопровождается снижением запасов гликогена [15]. В то же время зрелый нейтрофил располагает ферментами для биосинтеза гликогена [17], интенсивность которого позволяет восполнить расход гликогена и создать его резерв, что мы и имеем к концу трехчасовой экспозиции.
Таким образом, в ответ на болевое раздражение срабатывает сложная система превентивной защиты. В условиях отсутствия реального микробного вторжения фагоциты на болевой сигнал лишь демонстрируют развертывание его механизмов. Они заключаются в активации миелопероксидазы и снижении активности щелочной фосфатазы. Длительность вовлечения этих ферментов ограничена двумя часами с момента алго-генного воздействия, по истечении этого срока функциональная активность восстанавливается.
Вовлечение нейтрофилов в алгогенный процесс является энергозависимым механизмом. Восстановление уровня гликогена отмечается только через 2 часа от момента возникновения висцеральной боли.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вальдман А. В., Игнатов Ю. Д. Центральные механизмы боли. - Л.: Наука, 1976. - 191 с.
2. Васильев Ю. Н., Игнатов Ю. Д., Кочан А. Г. и др. Анальге-тические эффекты акупунктуры у крыс в свободном поведении и его изменение под влиянием морфина и налоксона // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1979. - № 11. - С. 566-569.
3. Диксон М., УэббЭ. Ферменты. - М., 1983. - 816 с.
4. Долгушин И. И., Бухарин А. В. Нейтрофилы и гомеостаз. -Екатеринбург, 2001. - 278 с.
5. Знагован С. Ю., Иваненко А. В., Шпилева Л. А. и др. Влияние газообразного формальдегида и перегревания на показатели белой крови // Сб. научных трудов Луганского национального аграрного университета. Серия «Биологические науки». - Луганск, 2004. - № 43. - С. 61-64.
6. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск, 1983. - 254 с.
СП
о о см
S I
ь о ш ш
5
0
1 S J S
4
cu г
>5 .0
I
>
со
I
5
0
1
со
ю >
7. Меньщикова Е. Б., Ланкин В. З, Зенков Н. К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М., 2006. - 556 с.
8. Нагоев Б. С., Абидов В. Т., Нагоева М. Х. Состояние лизо-сомального катионного белка и активности миелопероксидазы у больных ангинами различной этиологии // Успехи современного естествознания. - 2005. - № 7. - С. 40-41.
9. Пирс Э. Гистохимия. - М., 1962. - 964 с.
10. Плехова Н. Г. Бактерицидная активность фагоцитов // Ж. микробиол. - 2006. - № 6. - С. 89-96.
11. Роскин Г. И., Левинсон Л. Б. Микроскопическая техника. -М.: Советская наука, 1957. - 469 с.
12. Сачков В. И., Женило В. М., Абрамов Ю. Б. Устройство для моделирования висцеральной боли в эксперименте // Изобретение № 1098 от 27.03.1990.
13. Струков А. И., Серов В. В., Саркисов Д. С. Общая патология человека: в 2 т. - М., 1990. - Т. 2. - 415 с.
14. Федотова Г. Г., Киселева Р. Е. Изменение активности щелочной и кислой фосфатазы лейкоцитов в развитии неспецифического воспаления в легких // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 1. - С. 91.
15. Фрадкин В. А. Аллергодиагностика in vitro. - М.: Медицина. -1975. - 145 с.
16. Хейхоу Ф. Г., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. -М., 1983. - 319 с.
17. Хрущев Н. Г., Комарович Н. И. Цитохимический анализ механизма синтеза гликогена в нейтрофилах периферической крови // Докл. ЛНСССР. - 1969. - № 6. - С. 1422-1424.
18. Шубич Ф. Г., Нагоев Б. С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. - М., 1980. - 224 с.
19. Cochrane C. G., Allen R. A., Jesaitis A. J. et al. Physico-chemical properties of the N-formyl peptide receptor on human
neutrophils // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 261, № 2 Issue 4. -P.1854-1857.
20. Ginsburg I., Kohen R. Cell damage in inflammatory and infectious sites might involved a coordinated «cross-talk» among oxidants, microbial haemolysins and amphyphils cationic proteins, phospholipases, fatty acids, proteinases and cytokines // Free Radic. Res. - 1995. - Vol. 22. - P. 489-517.
21. Gray B. H., Haseman J. R. Bactericidal activity of synthetic peptides based on the structure of the 55-kilodalton bactericidal protein from human neutrophils // Infection and Immunity. - 1994. - Vol. 62, № 7. - P. 2732-2739.
22. Hayhoe F. G. J., Quaglino A. Cytochemical demonstration and measurement of leukocyte alkaline phosphatase activity in normal and pathological states by a modified azo - dye coupling technique // Brit. J. Haemat. - 1958. - Vol. 4. - P. 375.
23. Root R. K, Metcalf J., Oshino M. N, Chance B. H2O2 release from human granulocytes during phagocytosis. I. Documentation quantation and some regulating factors // J. Clin. Invest. - 1976. -Vol. 58. - P. 945-955.
24. Valentine W. H., Follete J. H., Harbi E. B. Studies on leukocyte alkaline phosphatase activity relation to stress and pituitare-adrenal activity // J. Lab. Clin. Med. - 1954. -Vol. 44. - P. 219.
25. Weiss S. J. Tissue destruction by neutrophils // New Engl. J. Med. - 1989. - Vol. 320. - P. 365-376.
26. Zatti M., RossiE. Early changes of hexose monophosphate pathway activity and of NADPH oxidation in phagocytizing leukocytes // Biochem. Biophys. Acta. (Amst.). - 1965. -Vol. 99. - P.557-561.
Поступила 03.06.2009
