CC BY
60
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Татьяна Петровна Генинг1, Татьяна Владимировна Абакумова2, Инна Ивановна Антонеева3, Снежанна Олеговна Генинг4
НЕЙТРОФИЛЬНЫЙ СТАТУС ПРИ РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ IA СТАДИИ
1 Профессор, д. б. н., заведующая, кафедра физиологии и патофизиологии Ульяновского государственного университета (432000, РФ, г. Ульяновск, ул. Льва Толстого, д. 42)
2 К. б. н., ассистент, кафедра физиологии и патофизиологии Ульяновского государственного
университета (432000, РФ, г. Ульяновск, ул. Льва Толстого, д. 42)
3 Д. м. н., доцент, кафедра онкологии и лучевой диагностики Ульяновского государственного
университета (432000, РФ, г. Ульяновск, ул. Льва Толстого, д. 42)
4 Студентка медицинского факультета Ульяновского государственного университета (432000, РФ, г. Ульяновск, ул. Льва Толстого, д. 42)
Адрес для переписки: 432001, РФ, г. Ульяновск, ул. Крымова, д. 63, кв. 403,
Генинг Татьяна Петровна; e-mail: Naum-53@yandex.ru
Для оценки морфофункционального состояния нейтрофильных лейкоцитов использовали периферическую кровь 32 женщин с первичным раком шейки матки 1А стадии. При исследовании по оценке активности миелопероксидазы, щелочной и кислой фосфатаз, уровня катионных белков в нейтрофилах периферической крови, а также при определении доли активных нейтрофилов в спонтанном варианте НСТ-теста у больных по сравнению с донорами выявлено повышение абсолютного количества нейтро-филов при одновременном снижении в них исследуемых показателей.
Ключевые слова: рак шейки матки, нейтрофильные лейкоциты.
Частота развития самого опасного для здоровья и жизни женщины заболевания — рака шейки матки (РШМ) составляет 18,8 на 100 000 женского населения [1]. При этом, если прирост заболеваемости РШМ за последние
5 лет в России составлял 0,9 на 100 000, то в Ульяновской области этот показатель достигал 6,1 на 100 000 женского населения.
Нейтрофильные лейкоциты (НфЛ) являются непременными участниками процесса формирования и развития опухоли. НфЛ первыми мигрируют к опухоли на ранних стадиях формирования [2; 3], инфильтрируют ее и становятся компонентами стромы [4]. Данные о роли НфЛ в канцерогенезе противоречивы. Ряд работ свидетельствует о проопухолевой активности НфЛ [5; 6], в то время как существуют клинические и экспериментальные данные, подтверждающие цитостатическое и цито-токсическое действие НфЛ на клетки опухоли [7].
В организме НфЛ могут находиться в двух состояниях — исходном и активированном. Переход НфЛ из
© Генинг Т. П., Абакумова Т. В., Антонеева И. И.,
Генинг С. О., 2011
УДК 618.146-006.6:616.155.34
одного состояния в другое осуществляется через промежуточную стадию — прайминг [8], в ходе которого изменяется уровень клеточного метаболизма, в частности увеличиваются цитотоксичность и бактерицидность микрофагов. Праймирование НфЛ может происходить под влиянием опухолевых клеток [9; 10].
Целью исследования была оценка морфофункционального статуса НфЛ периферической крови на начальной стадии РШМ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследуемая группа состояла из 32 первичных больных РШМ IA стадии по классификации Международной федерации акушеров и гинекологов (FIGO), подвергавшихся обследованию в гинекологическом отделении Ульяновского областного клинического онкологического диспансера. Подбор пациенток проводили по строго определенным критериям: возраст 30—45 лет (включительно); отсутствие острых воспалительных инфекционных и неинфекционных заболеваний; отсутствие в анамнезе хирургических вмешательств давностью менее года (включая стоматологические). Контрольную группу составили практически здоровые женщины в возрасте 30—45 лет.
НфЛ выделяли из венозной крови путем центрифугирования на двойном градиенте фиколла-урографина (1,117 и 1,077 г/мл) и ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе.
Исследование фагоцитарной активности НфЛ проводили стандартным методом с использованием дрожжевых клеток. Рассчитывали фагоцитарный индекс (ФИ) по Гамбургеру — процент фагоцитирующих НфЛ через 5, 30 и 60 мин инкубации, фагоцитарное число (ФЧ) по Райту [11] и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ): ИЗФ = ФЧ 5'/ФЧ 60'. Кроме того, в НфЛ цитохимически определяли активность миелопероксидазы (МПО) с бензидином [12], уровень катионных белков (КБ) по Шубичу [13], щелочной фосфатазы (ЩФ) по Rutenburg [14], долю активных нейтрофилов (ДАН) в спонтанном варианте с восстановлением нитросинего тетразолия (НСТ-тест) [15]. Результаты выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК).
Для оценки ригидности исследовали поверхность НфЛ на сканирующем зондовом микроскопе (СЗМ) «Solver Pro» («NT-MDT», Зеленоград) в полуконтактном режиме. Использовали фирменные кремниевые зонды с жесткостью 0,20 Н/м. Радиус закругления кончика зонда составлял примерно 50 нм.
Для определения значимости различий между группами использовали U-критерий Манна—Уитни.
результаты и обсуждение
В ходе исследований установлено, что при РШМ IA стадии по сравнению с контролем значимо повышается абсолютное количество НфЛ в периферической крови (рис. 1).
Число фагоцитирующих клеток (30 мин) у больных РШМ составило 45,1 ± 6,24% и значимо отличалось от такового у доноров (70,8 ± 0,36%). ФЧ (30 мин) НфЛ в кро-
©
I
■&
Рисунок 1. Абсолютное и относительное число нейтрофилов у больных РШМ № стадии. Звездочкой отмечены статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой.
А. Контроль. Б. РШМ № стадии.
ви больных было ниже, чем в крови доноров (1,5 ± 0,03 и 2,0 ± 0,12 усл. ед. соответственно). При этом фагоцитоз у больных, вероятно, идет по незавершенному типу, так как ИЗФ < 1 (0,76).
Непосредственная цитотоксическая активность НфЛ проявляется при активации секреторной дегрануляции — высвобождении протеолитических ферментов и других белков из гранул и меньших запасающих орга-нелл [6]. У НфЛ имеются 4 типа гранул: азурофильные, содержащие МПО и относящиеся к регуляторно-секреторным гранулам, специфические, содержащие лакто-феррин и коллагеназу, желатиназные и секреторные гранулы, возникающие на стадии зрелого НфЛ.
Азурофильные гранулы содержат нейтральные про-теазы, в том числе МПО. Именно эти гранулы мобилизуются при фагоцитозе и участвуют в образовании фа-голизосом [16]. Уменьшение уровня МПО в НфЛ может рассматриваться как следствие снижения способности к завершенному фагоцитозу [17].
Специфические гранулы содержат КБ, которые обеспечивают микробицидное действие НфЛ в анаэробных условиях в отсутствие респираторного взрыва. Мы констатировали снижение активности МПО (1,6 ± 0,004 СЦК против 2,7 ± 0,07 СЦК в контроле) и уровня КБ (1,6 ± 0,03 СЦК против 1,8 ± 0,06 СЦК в контроле), обуславливающих кислородзависимую и анаэробную бак-терицидность НфЛ. В анаэробном метаболизме НфЛ активное участие принимают и гидролитические ферменты специфических гранул, в частности ЩФ. Участвуя в гидролизе нуклеиновых кислот и фосфопротеинов, она готовит клетку для дальнейшего воздействия КБ [18]. Активность ЩФ в НфЛ у больных РШМ была несколько сниженной по сравнению с таковой в НфЛ доноров (0,84 ± 0,101 СЦК против 1,20 ± 0,070 СЦК в контроле).
Кислородзависимую активность НфЛ определяют по реакции восстановления НСТ. Спонтанный вариант теста характеризует степень «функционального раздражения» НфЛ in vivo. Увеличение количества НСТ-положительных клеток свидетельствует о напряженности окислительно-восстановительных процессов в клетке. При оценке НфЛ в спонтанном НСТ-тесте выявлено, что число активных клеток в периферическом кровотоке у больных РШМ значимо выше, чем у доноров (78,6 ± 9,34 и 6,2 ± 0,95% соответственно) (рис. 2).
Методом СЗМ была исследована цитоархитектоника НфЛ (рис. 3) и выяснено, что ригидность их мембраны при РШМ значимо не отличается от таковой у НфЛ доноров (232,7 ± 34,51 и 241,2 ± 25,51 Па соответственно).
Снижение этого показателя ряд исследователей связывают с изменением фагоцитарной активности НфЛ [19]. В наших исследованиях, несмотря на выраженные отличия показателей фагоцитоза, изменения ригидности по сравнению с таковой в контроле не были статистически значимыми.
Таким образом, у больных РШМ IA стадии увеличивается абсолютное количество НфЛ при изменении их функционального состояния: снижении бактерицидной активности и повышении количества НфЛ, продуцирующих активные формы кислорода. Фагоцитарная активность снижается, а фагоцитоз идет по незавершенному типу.
2,5
,1,5
о
0,5
90 80 70 60 *
50 X
о
О
40 :р
X
30 0 20 10 0
Рисунок 2. Функциональная активность НфЛ у больных РШМ Ш стадии. Звездочкой отмечены статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой. I — активность МПО; II — уровень КБ; III — активность ЩФ; IV — показатели НСТ-теста.
А. Контроль. Б. РШМ !А стадии.
Работа поддержана грантами ФЦП «Научнопедагогические кадры инновационной России на 2009— 2013 гг.».
ЛИТЕРАТУРА
1. Афанасьев М. С., Алешкин В. А., Афанасьев С. С. «Вируснобактериальная природа дисплазии и рака шейки матки» // Вестн. РАМН. — 2004. — № 6. — С. 35—40.
2. Ovarian cancer cell modulate human blood neutrophils response to activation in vitro / Klink M., Jastrzembska K., Nowak M., Bednar-ska K., Szpakowski M., Szyllo K., Sulowska Z. // Scand. J. Immunol. — 2008. — Vol. 68. — P. 328—336.
3. Regression of an established tumor genetically modified to release granulocyte colony-stimulating factor requires granulocyte-T cell cooperation and T cell-produced interferon gamma / Stoppacciaro A., Melani C., Parenza M., Mastracchio A., Bassi C., Baroni C., Parmiani G., Colombo M. P. // J. Exp. Med. — 1993. — Vol. 178, N 1. — Р. 151—161.
4. Mueller M.M., Fusenig N.E. Friends or foes — bipolar effects of the tumour stroma in cancer // Nat. Rev. Cancer. — 2004. — Vol. 4, N 11. — Р. 839—849.
5. Human neutrophils facilitate tumor cell transendotelial migration / Wu Q.D., Wang J.H., Condron C., Bouchier-Hayes D., Redmond H. P. // Amer. J. Physiol. Cell. — 2001. — Vol. 280, N 4. — P. 814—822.
6. Role of Bv8 in neutrophil-dependent angiogenesis in a transgenic model of cancer progression / Shojaei F., Singh M., Thompson J. D., Ferrara N. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 2008. — Vol. 105. — P. 2640—2645.
7. Clark R. A. Activation of the neutrophils kill microbes // Ann. Rev. Immunol. — 1999. — Vol. 23. — P. 197—223.
8. Клебанов Г. И., Владимиров Ю. А. Клеточные механизмы прайминга и агрегации фагоцитов // Успехи совр. биол. — 1999. — Т. 119, № 3. — С. 462—475.
9. Jgney F. H., Behrens C. K., Krammer P. H. CD 95L mediates tumor counterattack in vitro but induces neutrophil-independent tumor rejection in vivo // Int. J. Cancer. — 2004. — Vol. 113. — P. 78—87.
10. Neutrophils promote aerogenous spread of lung adenocarcinoma with bronchioloalveolar carcinoma features / Witko-Sarsat V., Rieu P., Descamps-Latscha B., Lesavre P., Halbwachs-Mecarelli L. // Clin. Cancer. Res. — 2000. — Vol. 13. — P. 3518—3527.
11. Медведев А. Н., Маянский А. Н., Чаленко В. В. Способ иссле-
3
2
0
А
Б
Б
Рисунок 3. НфЛ периферической крови (фиксация метанолом, трехмерное изображение).
А. Доноры. Б. Больные РШМ IA стадии.
дования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. — 1991. — № 2. — С. 19—20.
12. Долгушин И. И., Бухарин О. В.Нейтрофилы и гомеостаз. — Екатеринбург, 2001. — 278 с.
13. Шубич М. Г., Нагоев Б. С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. — М.: Медицина, 1980. — 224 с.
14. Фагоцитарная активность нейтрофилов у больных множественной миеломой / Чубукина Ж. В., Бубнова Л. Н., Глазнова Т. В., Павлова И. Е., Розанова О. Е., Бессмельцев С. С. // Рос. аллергол. журн. — 2010. — № 5, вып. 1. — С. 336—337.
15. Шубич М. Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. — 1974. — Т. 16, № 10. — С. 1321—1322.
16. Segal A. How neutrophils kill microbes // Ann. Rev. Jmmunol. — 2005. — Vol. 23. — P. 197—223.
17. Пауков В. С., Кауфман О. Я. Структурно-функциональная характеристика нейтрофильных лейкоцитов и их роль в формировании воспалительных иммунных процессов // Арх. пат. — 1983. — № 5. — С. 3—13.
18. Шубич М. Г., Нестерова И. В. О специфичности цитохимического выявления кислой фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах // Лаб. дело. — 1980. — № 3. — С. 150—154.
19. Исследование морфологии и ригидности мембран нейтро-фильных гранулоцитов в режиме реального времени методом сканирующей зондовой микроскопии / Плескова С. Н., Гущина Ю. Ю., Звонкова М. Б., Хомутова А. Е. // Бюл. экспер. биол. — 2006. — Т. 141, № 6. — С. 760—762.
Поступила 16.02.2011
Tatiana Petrovna Gening1, Tatiana Vladimirovna Abakumova2, Inna Ivanova Antoneyeva3, Snezhana Olegovna Gening3
NEUTROPHIL STATUS IN PATIENTS WITH STAGE IA CERVICAL CANCER
1 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Chair of Physiology and Pathophysiology,
Ulyanovsk State University (42, ul. Lva Tolstogo, Ulyanovsk, RF, 432000)
2 MD, PhD, Assistant, Chair of Physiology and Pathophysiology,
Ulyanovsk State University (42, ul. Lva Tolstogo, Ulyanovsk, RF, 432000)
3 MD, PhD, DSc, Associate Professor, Chair of Oncology and. Radiation Diagnosis,
Ulyanovsk State University (42, ul. Lva Tolstogo, Ulyanovsk, RF, 432000)
4 Student, Medical Faculty, Ulyanovsk State University (42, ul. Lva Tolstogo, Ulyanovsk, RF, 432000)
Address for correspondence: Gening Tatiana Petrovna, app. 403, bld. 43, ul. Krymova, Ulyanovsk, RF, 432001;
e-mail: Naum-53@yandex.ru
Neutrophil morphological and functional status was analyzed in peripheral blood from 32 women with stage IA primary cervical cancer. Measurement of myeloperoxidase activity, alkaline and acid phosphatase, cationic proteins in peripheral neutrophils and fraction of active neutrophils in spontaneous NST test demonstrated elevation in absolute neutrophil count and decrease in the parameters tested in cancer patients as compared with healthy donors.
Key words: cervical cancer, neutrophils.
