CC BY
18
DOI: 10.23868/202205005
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЕ ЛЕГКОЙ СТЕПЕНИ
Н.Г. Плехова, И.В. Радьков, С.В. Зиновьев, В.Б. Шуматов ш^утпв. 25.01.2022
Принята к печати: 14.05.2022
Тихоокеанский государственный медицинский университет, Опублик0вана on-line: 16.05.2022
Владивосток, Россия
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL TRANSFORMATIONS OF THE BRAIN IN EXPERIMENTAL MILD TRAUMATIC BRAIN INJURY
N.G. Plekhova, I.V. Radkov, S.V. Zinoviev, V.B. Shumatov
Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia
e-mail: [email protected]
При черепно-мозговой травме легкой степени интерес представляет изучение нейродегенеративных процессов, возникающих вследствие воспалительных изменений нервной ткани. Цель исследования: в острый период при экспериментальной черепно-мозговой травме легкой степени выявить структурные преобразования нервной ткани головного мозга. Для воспроизведения у взрослых крыс черепно-мозговой травмы легкой степени использована модифицированная модель падающего груза. Проведено иммуногистохимическое исследование нервной ткани головного мозга с применением специфичных для крыс моно-клональных антител к эндотелину-1, глиальному фибриллярному кислому белку, виментину и белку эндотелия гематоэнцефали-ческого барьера (SMI 71). Установлено, что в первые сутки после нанесения травмы в коре головного мозга животных преобладает церебральный спазм кровеносных сосудов с ишемией капилляров. На 8 сутки отмечается увеличение количества гипер- и гипохромных нейронов, а через 14 суток обнаруживается восстановление тонуса микроциркуляторного русла с признаками нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Отмечено существенное перераспределение в тканях больших полушарий головного мозга глиальных элементов, содержащих кислый глиальный белок и виментин, а также нейронов, продуцирующих эндотелин-1. В отсроченный посттравматический период выявлены компенсаторные реакции нервной ткани, которые характеризуются морфологическими изменениями нейронов (увеличение диаметра и количества ядрышек), сопряженных с внутриклеточной регенерацией. Таким образом, для патогенеза экспериментальной черепно-мозговой травмы легкой степени в ишемический (1 сутки) и промежуточный (8 суток) периоды характерно слабо выраженное нарушение структурной целостности нервной ткани головного мозга. В отдаленный посттравматический период (14 суток) в нейронах и астроцитах наблюдается проявление компенсаторных реакций.
Ключевые слова: черепно-мозговая травма легкой степени, экспериментальная модель, неокортекс, эндотелин-1, глиальный фибриллярный кислый белок, виментин, SMI 71.
На основании неврологической оценки легкая черепно-мозговая травма (лЧМТ) определяется по шкале комы Глазго показателем >13 и рассматривается как сотрясение головного мозга (ГМ) с кратковременной потерей сознания [1]. В результате первичного биомеханического повреждения в ГМ инициируется высвобождение нейротрансмиттеров и возникают неконтролируемые ионные потоки, что приводит к деполяризации нейронов с оттоком калия и притоком кальция на фоне повышения активности натрий-калиевого (Na+-K+) насоса и расхода АТФ [2]. Внутриаксонное содержание кальция оказывает деструктивное влияние на структуру нейрофиламентов и микротрубочек, нарушая связи между нейронами. Предположительно, вышеуказанные изменения метаболизма клеток лежат в основе симптоматики лЧМТ как в краткосрочном, так и в долгосрочном периодах постравматических изменений [2]. Если
In mild traumatic brain injury, it is of interest to study neurodegenerative conditions resulting from inflammatory changes in the nervous tissue. Purpose of the study: in the acute period in case of mild experimental traumatic brain injury, to reveal structural transformations of the nervous tissue of the brain. A modified model of a falling weight was used to reproduce of these trauma in adult rats. An immunohistochemical study of the brain with using rat-specific monoclonal antibodies to endothelin-1, glial fibrillar acidic protein, vimentin, and blood-brain barrier endothelial protein (SMI 71) was performed. It has been established that on the first day after injury in the cerebral cortex of animals, the spasm of blood vessels with capillary ischemia predominates. On day 8, there is an increase in the number of hyper- and hypochromic neurons, and after 14 days, restoration of the tone of the microcircu-latory bed is detected with signs of a violation of the permeability of the blood-brain barrier. A significant redistribution in the tissues of the cerebral hemispheres of glial elements containing acid glial protein and vimentin, as well as neurons producing endothelin-1, was noted. In the delayed post-traumatic period, compensatory reactions of the nervous tissue were revealed, which are characterized by the presence of morphological changes in neurons (an increase in the diameter and number of nucleoli in size) associated with intracellular regeneration, as well as the synthesis of various protein factors in them. Thus, the pathogenesis of mild experimental craniocerebral injury in the ischemic (1 day) and intermediate (8 days) periods is characterized by the presence of mild violations of the structural integrity of the nervous tissue of the brain. In the late post-traumatic period (14 days), neurons and astrocytes exhibit compensatory reactions.
Keywords: mild traumatic brain injury, experimental model, neocortex, endothelin-1, glial fibrillar acidic protein, vimentin, SMI 71
при среднетяжелой и тяжелой ЧМТ гибель нейронов и повреждение серого и белого вещества коррелируют с долгосрочным дефицитом моторной и когнитивной функций [3], то в случае лЧМТ, главным образом, задействованы и обсуждаются механизмы развития нейровоспаления в ГМ [4, 5]. Показана активация глии (микроглии и астроцитов) в посттравматический период, которая сопровождается высвобождением медиаторов воспаления с последующим привлечением периферических иммунных клеток [6]. Патогенетические механизмы сотрясения мозга интенсивно изучаются, и наиболее актуальной является оценка степени компенсации воспалительных процессов, протекающих в условиях закрытой внутричерепной травмы легкой степени [7].
Цель исследования: в острый период при экспериментальной лЧМТ выявить структурные преобразования нервной ткани ГМ.
А
В
Рис. 1. Макропрепараты головного мозга здоровых (А) и травмированных крыс через 2 ч. после нанесения легкой (Б) и среднетяжелой ЧМТ (В)
Материал и методы
Дизайн исследования
Эксперимент проводили на половозрелых крысах-самцах породы Wistar (весом 200-250 г, n=50) в соответствии с положениями Хельсинкской декларации и рекомендациями Директивы Европейского сообщества (86/609 Г.С.), дизайн исследования одобрен междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 3 от 20.09.2017). Животные были разделены на 2 группы: 1 группа — контрольная, интактные животные (n=10); 2 группа — животные с моделированием лЧМТ (n=40). Гистологический анализ образцов нервной ткани ГМ проводили на 1 (n=10), 2 (n=10), 8 (n=10) и 14 (n=10) сут. после нанесения травмы. Все потенциально болезненные вмешательства в экспериментах, а также эвтаназию осуществляли под комбинированным инъекционным наркозом: 0,003 мг/г золетила (Virbac, Франция), 0,008 мг/г кси-ланита (ЗАО НИТА-ФАРМ, Саратов, Россия) и 0,1% раствор атропин сульфата (ОАО ДАЛЬХИМФАРМ, Россия)
Для воспроизведения лЧМТ использовали модифицированную модель падающего груза, описанную в работе R. Mychasiuk с соавт. (2014) [8] и адаптированную для взрослых крыс. Травму на затылочную область головы животного наносили с высоты 1 м с помощью установки, состоящей из штатива с направляющей падение груза (масса 200 г) трубкой. Для достижения вращения тела животного на 180° использовали контейнер, внизу которого был помещен мягкий материал, а его верхняя часть была покрыта фольгой, выдерживающей вес крысы в состоянии покоя, но разрывающейся при нанесении удара по голове. Среднетяжелую ЧМТ инерционного типа наносили с помощью вышеуказанной установки, но без контейнера, в который падает животное. Наличие лЧМТ определяли по шкале Modified Neurological Severity Scores (mNSS), включающей тесты на выявление расстройств двигательной активности (мышечный статус и неестественные движения), чувствительной сферы (зрительной, тактильной и проприоцептивной), рефлексов и координации движений [9]. Оценку проводили по балльной системе от 0 до 10.
Гистологический анализ
Для гистологического исследования образцы нервной ткани ГМ фиксировали в 4% забуференном формалине,
заливали в парафин и готовили микропрепараты толщиной 5 мкм в сагиттальной плоскости с последующим окрашиванием гематоксилином Эрлиха и эозином. Для иммуногистохимического определения наличия белков использовали поликлональные специфичные для крыс первичные антитела к эндотелину-1, глиальному фибриллярному кислому белку (ГФКБ) и виментину (Abcam, США). В качестве вторичных антител применяли поликлональные стрептавидиновые антитела, коньюги-рованные с пероксидазой, и хромогенный субстрат для их выявления — диаминобензидин (Spring Bio-Science Corporation, США). Для выявления белка эндотелия гематоэнцефалического барьера (SMI 71) использовали специфичные для крыс меченные флуорохромом Alexa Fluor® 647 антитела к белку SMI 7l (BioLegend, США). Препараты анализировали с помощью микроскопа CX41, оснащенного цифровой камерой (Olympus, Япония). Для флуоресцентной микроскопии применяли лазерный сканирующий конфокальный микроскоп LSM 710 (Zeiss, Германия). Морфометрическую обработку изображений осуществляли с использованием программы NIS-Elements Imaging Software (Nikon, Япония).
Статистический анализ
Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0 (StatSoft, США). Для определения нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка (10<n<50). Показатели представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (M ± m). Различия между группами анализировали с помощью t-критерия Стьюдента, уровень статистической значимости различий принимали при p<0,05.
Результаты
При оценке неврологического статуса у травмированных крыс были отмечены незначительные нарушения координации без двигательных расстройств. Значение общего среднего балла по шкале mNSS (1,4 ± 0,1) было сравнимо с показателем для здоровых животных (р=0,005), тогда как после нанесения среднетяжелой ЧМТ наблюдалась отчётливая очаговая симптоматика со значением общего среднего балла равным 8 (р=0,005), что соответствовало выраженным неврологическим расстройствам. При выбранном способе моделирования
Рис. 2. Кора больших полушарий травмированных животных: А — скопления эритроцитов (1) в третьем желудочке (1 сут. после лЧМТ); Б — расширение (1) субархноидального пространства (1 сут. после лЧМТ); В — перицеллюлярный отек и гиперхромные нейроны (8 сут. после лЧМТ); Г — гипохромные (стрелка) нейроны (8 сут. после лЧМТ). Окр.: гематоксилин и эозин. Масштабный отрезок: 750 мкм
лЧМТ исключался перелом костей черепа, отсутствовали размозжение коры, кровоизлияния в месте удара, в полости желудочков и паренхиму ГМ (рис. 1, 2А).
В теменной, поясничной и височных частях больших полушарий крыс в острый посттравматический период (1 сут.) было обнаружено сужение сосудов микроцирку-ляторного русла: их диаметр равнялся 7,40 ± 0,51 мкм при значении для здоровых животных 9,40 ± 0,51 мкм (р<0,05). На поверхности больших полушарий ГМ было отмечено набухание мягких мозговых оболочек (их толщина составила 24,751 ± 2,290 мкм, у здоровых крыс — 24,751 ± 2,290 мкм, р<0,05) и сужение просвета артерий. Субарахноидальные кровоизлияния отсутствовали, но определялась гиперемия пиальных кровеносных сосудов и расширение пространства между паутинной и мягкой оболочками (рис. 2Б). В нервной ткани ГМ были отмечены признаки вазогенного, цитотоксического поражения и периваскулярные отеки интрамуральных артериол и венул на протяжении всего эксперимента после лЧМТ (до 14 сут.). На фоне перицеллюлярного отека в течение 1 сут. (рис. 2В) было выявлено высокое содержание гиперхромных нейронов с базофильной цитоплазмой при небольшом количестве гипохромных клеток (рис. 2В, Г) с повышенным содержанием ядрышек. Количество таких клеток у травмированных животных равнялось 7,5 ± 1,2, а у здоровых — 4,5 ± 1,7 (р<0,05). Большое количество некротизированных нейронов было обнаружено в начальные сроки (1 сут.) после лЧМТ, о чем свидетельствовали показатели их количества, которые составили для здоровых животных 14,6 ± 0,5, для травмированных — 23,0 ± 0,7 (р<0,001), а через 8 и 14 сут. — 18,0 ± 0,7 и 15,6 ± 0,5 клеток на 1 мкм2
(р<0,01) соответственно. Существенное по сравнению со здоровыми животными снижение в 3 раза количества микрососудов в ГМ с позитивной реакцией на наличие белка SMI 71 (55 ± 4% и 20 ± 5%, р<0,001, рис. 3) было обнаружено в 1 сут., тогда как на 8 и 14 сут. его содержание повышалось (70,0 ± 5,8%, р<0,001). Количество белка SMI 71 в сосудах ГМ травмированных животных изменялось на протяжении эксперимента: в течение 1 сут. оно снижалось, а затем повышалось до конца срока наблюдения (14 сут.). Эти данные указывают на наличие компенсаторных реакций в нервной ткани ГМ.
В зависимости от срока наблюдения в ГМ травмированных животных наблюдалось перераспределение позитивной реакции на наличие ГФКБ, виментина и эндотелина-1 (рис. 4). У здоровых крыс эти белки отсутствовали в клетках теменных и поясных отделов коры ГМ, а были обнаружены, главным образом, в ней-роглии и нейронах боковых желудочков (рис. 4А). Через 1 сут. после лЧМТ нейроны, содержащие эндотелин-1, и глиальные клетки с позитивной реакцией на ГФКБ и виментин были отмечены как в области белого вещества, окружающего боковые желудочки, так и в базаль-ных ядрах, во внутренней капсуле, гиппокампе и в своде мозга больших полушарий (рис. 4Б, В, Г). На 14 сут. после лЧМТ высокое содержание таких клеток было выявлено в коре теменных и поясных отделов полушарий.
Обсуждение
Наиболее удачным воспроизведением биомеханики диффузного повреждения ГМ, соответствующим ЧМТ легкой степени, являются комбинированные модели
\ \
\
л ^ А Б
/
<5>
\
\
\
В Г
Рис. 3. Кора больших полушарий: микрососуды головного мозга здоровых (А) и травмированных крыс с \продукцией белка БМ! 71, (стрелки) через 1 (Б), 8 (В) и 14 (Г) сут. после нанесения лЧМТ. Иммуногистохимическая реакция, ядра клеток докрашены ОДР!. Масштабный отрезок: А — 20 мкм, Б — 5 мкм; В, Г — 10 мкм
** *
I ш
Ль
1
л'
Г
2->>
I ' 'Ы-а
-р. к «Ц». ^ '*' -, ,<■ - *
В — г _
Рис. 4. Кора больших полушарий: А — отсутствие эндотелина-1 в теменной области ГМ здоровых животных; Б — нейроны теменной области ГМ травмированных животных, продуцирующие эндотелин-1 (14 сут. лЧМТ); В — продукция виментина в глии белого вещества большого полушария ГМ (1 сут. лЧМТ); Г — продукция кислого глиального белка в астроцитах теменной коры больших полушарий ГМ (14 сут. лЧМТ). Иммуногистохимическая реакция. Масштабный отрезок: А, Б, В — 500 мкм, Г — 750 мкм
' * » .
Б
1
'Г с ? *
гЧ
> V. л - »л .с I
Г Р
А
Согласно результатам морфологического исследования ГМ нами выделены ишемический (1 сут.), промежуточный (8 сут.) и отдаленный периоды (14 сут.) постравматических изменений. Так, в ишемический период преобладал спазм церебральных кровеносных сосудов и капилляров, промежуточный характеризовался увеличением количества гипер- и гипохромных нейронов. В таких гиперхромных нейронах происходит активный синтез белков, а при воздействии неблагоприятных факторов они подвергаются апоптозу [9, 10]. В отдаленный период была обнаружена нормализация структурного гомеостаза в результате внутриклеточной регенерации нейронов, о чем свидетельствовало увеличение их диаметра и количества ядрышек. Белок SMI 71, маркер проницаемости капилляров, специфичен для эндотелия крыс в областях гематоэнцефалического барьера и было показано, что его реактивность временно исчезает при экспериментальном очаговом аллергическом энцефаломиелите в результате разрушения нейронов [11], как и было продемонстрировано в нашем эксперименте по изучению динамики его содержания в ГМ травмированных крыс. Позитивная реакция на наличие виментина у травмированных животных помимо области, прилегающей к боковым желудочкам, была отмечена в гиппокампе, внутренней капсуле, своде мозга, тогда как у здоровых животных в обозначенных областях она отсутствовала. С течением времени после травмы количество этого белка в ГМ снижалось. Указывается, что выявление виментина характеризует регенераторную реакцию астроцитов при нейровоспалении и ишемии в области гиппокампа [12, 13], которая была отмечена нами в посттравматический
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Sussman E.S., Pendharkar A.V., Ho A.L. et al. Mild traumatic brain injury and concussion: terminology and classification. Handbook clin. Neurol. 2018; 158: 21-4.
2. Giza C.C., Hovda D.A. The new neurometabolic cascade of concussion. Neurosurgery 2014; 75(4): 24-33.
3. Mayer C.L., Huber B.R., Peskind E. Traumatic brain injury, neuroinflammation, and post-traumatic headaches. Headache 2013; 53(9): 1523-30.
4. Chiu C.C., Liao Y.E., Yang L.Y. et al. Neuroinflammation in animal models of traumatic brain injury. J. Neurosc. Methods 2016; 272: 38-9.
5. Wang G., Zhang J., Hu X. et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2013; 33(12): 1864-74.
6. Masel B.E., De Witt D.S. Traumatic brain injury: A disease process, not an event. J. Neurotrauma 2010; 27(8): 1529-40.
7. Tobe E.H. Geriatric traumatic brain injury: Relationship to dementia and neurodegenerative disease. J. Gerontol. Geriatr. Res. 2016; 5(2): 1000292.
8. Mychasiuk R., Farran A., Angoa-Perez M. et al. A novel model of mild traumatic brain injury for juvenile rats. J. Vis. Exp. 2014; 94: 51820.
9. Антипова М.В., Гусельникова В.В., Коржевский Д.Э. Возрастные особенности структурно-функциональной организации микроглиоцитов стриатума крысы. Мед. акад. журн. 2019; 19(S): 133-4. [Antipova M.V., Guselnikova V.V., Korzhevsky D.E. Age features of the structural and
острый период. Радиальные глиальные клетки субвен-трикулярной зоны вокруг боковых желудочков остаются в мозге взрослого человека и крыс в качестве нервных стволовых клеток [14, 15]. Эти клетки синтезируют нестин, виментин, ГФКБ, GLAST и Pax6, пролиферируют и располагаются перпендикулярно относительно стенки желудочка [16]. Подобная локализация клеток нейроглии, продуцирующих виментин и ГФКБ, была обнаружена нами у травмированных крыс в области спавшихся стенок боковых желудочков и внутренней капсулы ГМ. В корковом веществе ГМ было отмечено увеличение количества глиальных клеток, синтезирующих ГФКБ в астроцитах, что, на наш взгляд, было связано с их пролиферацией. Эндотелин-1 является не только вазоконстриктором, но и фактором, оказывающим влияние на воспаление, регенерацию и ноницепцию [17]. Нами отмечена тенденция к увеличению количества нейронов, содержащих этот белок, в коре поясного и теменного отделов обоих полушарий ГМ крыс после лЧМТ.
Таким образом, нами было показано, что при экспериментальной лЧМТ в ишемический (1 сут.) и промежуточный (8 сут.) периоды характерны слабо выраженные нарушения структурной целостности ГМ. В отдаленный посттравматический период были отмечены компенсаторные реакции в нервной ткани ГМ, которые характеризовались морфологическими изменениями нейронов, свидетельствующими о регенерации. Так, в этих клетках было обнаружено увеличение диаметра ядер, количества ядрышек и внутриклеточного синтеза эндотелина-1, что сопровождалось увеличением количества астроцитов с наличием ГФКБ и виментина.
functional organization of microgliocytes of the rat striatum. Med. Acad. J. 2019; 19(S): 133-4].
10. Zimatkin S.M., Bon E.I. Dark Neurons of the Brain. Behav. Neurosci. 2018; 48: 908-12.
11. Safavi F., Li H., Gonnella P. et al. C-kit plays a critical role in induction of intravenous tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunologic. Research 2015; 61(3): 294-302.
12. Hua L., Xiao-Qiong W., Min Z. et al. Expression of vimentin and glial fibrillary acidic protein in central nervous system development of rats. Asian Pac. J. Trop. Med. 2017; 10(12): 1185-9.
13. Sukhorukova E.G., Korzhevskii D.E., Alekseeva O.S. Glial fibrillary acidic protein: The component of iintermediate filaments in the vertebrate brain astrocytes. J. Evol. Biochem. Phys. 2015; 51: 1-10.
14. Ekmark-Lewen S., Lewen A., Israelsson C. et al. Vimentin and GFAP responses in astrocytes after contusion trauma to the murine brain. Restor. Neurol. Neurosci. 2010; 28(3): 311-21.
15. Jiang S.X., Slinn J., Aylsworth A. et al. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. J. Neurochem. 2012; 122(4): 764-74.
16. Zamanian J.L., Xu L., Foo L.C. et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J. Neurosci. 2012; 32(18): 6391-410.
17. Maegele M., Wafaisade A., Peiniger S. et al. The role of endothelin and endothelin antagonists in traumatic brain injury: a review of the literature. Neurological Research 2011; 33(2): 119-26.
