CC BY
75
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Физиология ♦
УДК 576.311.348.4; 546.817
Влияние низких доз ионов Pb2+ на состояние цитоскелета астроцитов мозга крыс в раннем постнатальном периоде
Е.В. Сухаренко1, кандидат технических наук (helenasuhar@gmail.com), И.В. Прищепа2, аспирант (prishepka89@mail.ru), В.С. Недзвецкий2, доктор биологических наук (nedzvetskyvictor@gmail.com), В.И. Максимов3, доктор биологических наук (dr.maximov@gmail.com)
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Керченский государственный морской технологический университет» (Керчь).
2 Днепропетровский национальный университет им. О. Гончара (Днепропетровск).
3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (Москва).
Исследовали влияние ацетата свинца (25 мг/л в питьевой воде) на полипептидный состав и содержание белка глиальных ПФ мозга крыс в раннем постнатальном периоде (1.21 дней). Установлено достоверное (р<0,01) повышение экспрессии ГФКБ в мозжечке и больших полушариях во всех группах (1-й, 10-й, 21-й день) постэмбрионального развития. В головном мозге животных в условиях пренатального воздействия ацетата свинца отмечено появление иммунореактивных полипептидных фрагментов ГФКБ в диапазоне Мг 47.40 кДа. Полученные результаты свидетельствуют о развитии астроглиальной реакции в ответ на хроническое воздействие ацетата свинца в эмбриональном периоде.
Ключевые слова: ацетат свинца, глиальный фибриллярный кислый белок, ранний постнатальный период развития ЦНС
Сокращения: ГФКБ — глиальный фибриллярный кислый белок, ГЭБ — гематоэнцефалический барьер, ПААГ — полиакриламидный гель, ПНД — день пост-натального развития, ПФ — промежуточные фила-менты, м-РНК — матричная рибонуклеиновая кислота, ЦНС — центральная нервная система, ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
Введение
Клетки нервной ткани отличаются уникальными белками цитоскелета, которые характеризуются определенной субклеточной локализацией и особенностями экспрессии на разных этапах онтогенеза. Представителями таких гистоспецифических белков ПФ цитоскелета структурно-функциональных единиц ЦНС являются триплет белков нейрофиламентов нейронов и ГФКБ глиоцитов [1]. Показано, что именно эти белки определяют специфику функционирования цитоскелета, а уровень экспрессии ГФКБ рассматривается как чувствительный индикатор действия нейротоксичных факторов во взрослом мозге.
Известно, что ГФКБ играет важную роль в модуляции подвижности астроцитов и обеспечении структурной стабильности их отростков, а также принимает участие в процессе астроглиоза, который может индуцироваться различными повреждающими факторами как химической, так и физической природы, травмати-зацией ЦНС, метаболическими расстройствами. Ответные реакции нервной ткани сопровождаются интенсивной пролиферацией и гипертрофией астроцитов, повышенным синтезом ГФКБ и реэкспрессией белка ПФ ви-ментина, присутствие которого характерно лишь для незрелых глиальных клеток. Такие модификации метаболизма и изменения белкового спектра играют фун-
даментальную роль в астроглиальном ответе и обусловливают нейропротекторную и репаративную функции глиоцитов.
Нейроны чрезвычайно чувствительны к изменениям микроокружения и глиально-нейронального взаимодействия в период эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития. Ранняя стадия онтогенеза ЦНС характеризуется миграцией нейронов, дендрито- и аксоногене-зом, установлением синаптических контактов. Ключевая роль в этих процессах принадлежит клеткам астроглии, токсическое влияние на которые может вызывать необратимые морфофункциональные нарушения дифференциации клеток на ранних этапах развития ЦНС [2]. Одной из возможных причин ранней нейродегенерации может служить свинцовая интоксикация, что подтверждают данные, указывающие на сдвиг сроков дифференциации и дозревания астроцитов, а также развитие глио-за под воздействием низких концентраций солей свинца. Показано, что свинец индуцирует разрушение элементов цитоскелета нейронов и накопление фибриллярного материала в перикарионе [3]. Изменение архитектуры ПФ цитоскелета астроглии может быть важным этапом в развитии патологических нарушений, сопровождающих свинцовую интоксикацию.
Соединения свинца относят к наиболее опасным загрязнителям, количество которых в окружающей среде неуклонно увеличивается ввиду широкого круга источников поступления (выбросы промышленных предприятий, выхлопные газы автотранспорта, сжигание угля и т. п.) [4]. Ранее при использовании изменений экспрессии ГФКБ в качестве маркера эффектов нейротоксич-ности ограничивались, главным образом, исследованиями мозга взрослых животных. Однако постоянное присутствие свинца в воздухе, питьевой воде и продуктах питания в количествах, приближающихся к подпо-роговым, обусловливает необходимость исследования особенностей молекулярных механизмов патологичес-
Влияние низких доз ионов Pb2+ на состояние цитоскелета астроцитов мозга крыс в раннем постнатальном периоде
3,5
ж
а ф
а
Рис. 1. Содержание ГФКБ в мозжечке молодых крыс в условиях воздействия ацетата свинца на 1-й (мозг an mass), 10-й и 21-й день после рождения по сравнению контрольными группами крыс того же возраста. К — контрольные группы животных, РЬ — экспериментальные группы животных; достоверность изменений * р <0,05; ** р <0,01.
кого влияния низких доз Pb2+ на ЦНС в период развития. Принимая во внимание, что процессы раннего онтогенеза сопровождаются активной пролиферацией и дифференциацией определенных субпопуляций клеток ЦНС, которые чрезвычайно чувствительны к действию токсичных факторов, понимание ответных молекулярных и клеточных реакций может быть важным звеном в изучении механизмов развития патологий ЦНС и стратегии нейропротекции.
Цель исследования
Выявить особенности содержания ГФКБ и изучить состав полипептидных фрагментов астроцитарного цито-скелета мозга крыс в раннем постнатальном периоде развития в условиях действия ацетата свинца.
Материалы и методы
Беременные самки крыс линии Wistar были разделены на контрольную и экспериментальную группы методом рандомизации. Животные экспериментальной группы (n=7) получали ацетат свинца с питьевой водой с момента оплодотворения и в период лактации. Концентрация (СН3СОО)2РЬ составляла 25 мг/л. Животным контрольной группы (n=7) давали очищенную питьевую воду Рожденных крыс обеих групп (n=60) декапитировали на 1-й, 10-й и 21-й ПНД (ПНД-1, ПНД-10 и ПНД-21, соответственно). Головной мозг крыс ПНД-10 и ПНД-21 разделяли на отделы (мозжечок и большие полушария), у крысят ПНД-1 для исследования брали мозг an mass.
Ткань мозга гомогенизировали в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4), который содержал 2 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 ммоль фенилметилсульфонил-фторид, ингибиторы протеиназ («Roche Molecular Bio-chemicals», Германия). Все манипуляции проводили при температуре 4 оС. Гомогенат центрифугировали при 30 000 g в течение 60 мин. Полученный супернатант (S1) содержал растворимые белки мозга. После ресуспенди-рования осадок промывали в том же буфере и центрифугирования при 30 000 g в течение 45 мин. Затем осадок ресуспендировали в трис-буфере, содержащем дополнительно 4 М мочевину, и центрифугировали при
Рис. 2. Содержание ГФКБ в полушариях молодых крыс в условиях воздействия ацетата свинца (мозг an mass) на 1-й, 10-й и 21-й день после рождения по сравнению контрольными группами крыс того же возраста. К — контрольные группы животных, РЬ — экспериментальные группы животных; достоверность изменений * р <0,05; ** з <0,01.
30000 g в течение 60 мин. Супернатант (S2) содержал цитоскелетные филаментные белки. Концентрацию общего белка определяли по методу Брэдфорд [5]. Белки фракций Si и S2 фракционировали по молекулярной массе электрофоретически в градиенте ПААГ (5...20 %). Количество общего белка в каждой пробе соответствовало 50 мкг. Окрашенные маркерные белки («Gibco-BRL Inc.») использовали для определения молекулярной массы. После разделения в ПААГ белки переносили на нит-роцеллюлозную мембрану («Schleicher & Schuel», США) в течение 120 мин при токе 100 мА. После переноса мембрану блокировали 3%-м обезжиренным сухим молоком с 1%-м альбумином в течение 120 мин при комнатной температуре и инкубировали с анти-ГФКБ специфической сывороткой («Santa Cruze Biotechnology Inc.», США) в течение 120 мин, затем со вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена («Sigma», США), в течение 60 мин. Полипептидные зоны окрашивали с помощью диаминобензидина. Полученные результаты сканировали и подсчитывали интенсивность окрашивания, используя программу Image 2000 («Bio-Techne Corp.»). Относительное содержание ГФКБ выражали как отношение интенсивности иммуноокрашивания к содержанию общего белка в пробе.
Количественный анализ ГФКБ проводили путем сравнения интенсивностей окраски соответствующих полипептидных зон между экспериментальными и контрольными пробами, отнесенными к количеству общего белка во фракциях. Иммуноблоттинг ГФКБ позволяет оценить не только общую иммунореактивность, но и относительное количество дериватов, то есть степень протеолиза глиальных филаментов.
Полученные данные обрабатывали с использованием математической статистики для малых выборок [6]. Относительное содержание ГФКБ выражали в виде средней величины ± стандартная ошибка средней, достоверную разницу между группами оценивали с применением t-критерия Стьюдента (р<0,05) после проверки гипотез о нормальности распределения и разницы между генеральными дисперсии.
Е.В. Сухаренко, И.В. Прищепа, В.С. Недзвецкий, В.И. Максимов
Результаты и обсуждение
Уровень и полипептидный состав ГФКБ определяли как в растворимой, так и в цитоскелетной белковых фракциях. Из полученных с помощью иммуноблоттинга данных следует, что хроническое действие ацетата свинца ведет к повышению содержания белка глиальных ПФ в мозге крысят всех экспериментальных групп — 1-го, 10-го и 21-го дней после рождения. Результаты количественного определения ГФКБ представлены на рис. 1, 2.
Наиболее значительные изменения экспрессии ГФКБ наблюдали в мозге новорожденных крысят (ПНД-1) по сравнению с контрольной группой того же возраста. Необходимо обратить особое внимание на то, что в ранний постэмбриональный период незрелые астроциты продуцируют ГФКБ в очень ограниченных количествах, а их ПФ состоят преимущественно из виментина [7]. В норме пик экспрессии ГФКБ приходится на 9...15-И день постнатального периода. На третьей неделе жизни синтез этого белка глиального цитоскелета несколько снижается. Такая динамика экспрессии ГФКБ полностью совпадает с процессами миграции, пролиферации и дифференциации незрелых астроцитов во взрослые формы популяций клеток всех отделов мозга, отражая фибриллогенез в астроцитах, их дифференциацию и представительство в отдельных регионах мозга.
Выбранный для изучения период развития мозга крыс соответствует времени формирования зрелых астрогли-альных образований ЦНС в гиппокампе, субвентри-кулярной зоне, коре больших полушарий. Глиальные и нейрональные элементы тесно связаны с помощью непосредственных межклеточных адгезивных контактов, гуморальных факторов роста, цитокинов, сигналов внешней среды. Наряду с этим, в первый месяц развития формируются наиболее функционально значимые синаптические контакты, и нейроны дифференцируются по типу используемого нейромедиатора [8]. Образование синапсов происходит при активном участии астроцитов, которые синтезируют трофические и адгезивные факторы, обеспечивая прорастание нейритов и фиксацию межклеточного взаимодействия в ранний период постнатального развития. Формирование устойчивых синапсов обеспечивает жизненно важные физиологические функции организма — обучение, память, рефлексы, приспособление к условиям окружающей среды, и делает этот период чрезвычайно уязвимым к действию токсических факторов разной природы.
Возрастание содержания интактного ГФКБ с молекулярной массой 49 кДа в цитоскелетной фракции белков свидетельствует о наличии астроглиального ответа на действие ионов Pb3+ в незрелом головном мозге крыс. Немаловажно, что выявленные изменения концентрации ГФКБ происходят за счет синтеза de novo именно интактного филаментного полипептида с молекулярной массой 49 кДа. В соответствующих растворимых фракциях экспериментальных и контрольных групп крысят достоверной разницы между содержанием ГФКБ не обнаружено. В настоящее время функциональное значение растворимых дериватов ГФКБ остается не ясным. Впервые растворимая фракция ГФКБ была получена из нервной ткани животных post mortem. Ранее ее происхождение связывали с активацией Са2+-зависимой нейтральной протеиназы [9]. В дальнейшем было установлено, что неполимеризованные растворимые субъединицы ГФКБ
I
49 kDa 45 kDa
K Pb 1-й
K Pb 10-й
K Pb 21-й
Рис. 3. Иммуноблоттинг цитоскелетных фракций головного мозга крыс экспериментальных и контрольных групп: 1 — мозг крыс ПНД-1 контрольной группы; 2 — мозг крыс ПНД-1 в условиях воздействия ацетата свинца; 3 — мозжечок крыс ПНД-10 контрольной группы;
4 — мозжечок крыс ПНД-10 в условиях воздействия ацетата свинца;
5 — мозжечок крыс ПНД-21 контрольной группы; 6 — мозжечок крыс ПНД-21 в условиях воздействия ацетата свинца
K Pb 1-й
3 4
K Pb
10-й
49 kDa 45 kDa
K Pb 21-й
Рис. 4. Иммуноблоттинг цитоскелетных фракций головного мозга крыс экспериментальных и контрольных групп: 1 — мозг крыс ПНД-1 контрольной группы; 2 — мозг крыс ПНД-1 в условиях воздействия ацетата свинца; 3 — большие полушария крыс ПНД-10 контрольной группы; 4 — большие полушария крыс ПНД-10 в условиях воздействия ацетата свинца; 5 — большие полушария крыс ПНД-21 контрольной группы; 6 — большие полушария крыс ПНД-21 в условиях воздействия ацетата свинца
могут появляться в мозге in vivo, а значительная гетерогенность иммунореактивных полипептидов наблюдается при различного рода воздействиях, ассоциированных с Са2+-опосредованными механизмами фосфо-рилирования и протеолиза. Возможно, лимитированный протеолиз белков филаментов является одним из путей реконструкции фибриллярного аппарата астроцитов. Это предположение подтверждают недавно полученные результаты, свидетельствующие о реализации одного из путей деградации ПФ глии с участием каспаз [10].
Как правило, астроцитарный ответ зрелой ЦНС характеризуется повышением содержания ГФКБ на фоне четко выраженных изменений полипептидного состава глиальных филаментов. На основании данных иммуноблоттинга можно утверждать, что в условиях воздействия ионов Pb2+ в период пренатального развития ЦНС увеличивается содержание и изменяется полипептидный состав ГФКБ (рис. 3, 4).
Рост экспрессии ГФКБ ведет к активации фибрилло-генеза, что характерно как для гипертрофированных астроцитов при повреждении, так и для астроцитов в фазе активной пролиферации и созревания. Опираясь на ранее полученные сведения об отсутствии влияния малых доз Pb2+ на индукцию гипертрофии астроглиаль-ных клеток в эмбриональном мозге [11], можно предположить, что повышение уровня ГФКБ связано с проли-фирацией и созреванием астроцитов.
Следует отметить, что, по сравнению со зрелым мозгом, изменения экспрессии ГФКБ на ранних этапах пост-натального периода более ярко выражены. Несмотря
Влияние низких доз ионов РЬ2+ на состояние цитоскелета астроцитов мозга крыс в раннем постнатальном периоде
на то, что механизм появления четких признаков дифференциации астроцитов на ранних этапах постнаталь-ного развития точно не установлен, увеличение количества белка астроцитарных промежуточных филаментов, вероятнее всего, служит следствием ускоренной пролиферации и созревания этих клеток в ответ на свинцовую интоксикацию.
В период раннего онтогенеза ЦНС последствия реактивного астроцитоза, как и процесса формирования гли-альных рубцов, особенно актуальны. Известно, что при совместном культивировании «нокаутированных» по гену ГФКБ астроцитов мышей и нейронов, способность астроцитарных клеток формировать отростки теряется [12]. В то время как астроциты мышей, «нокаутированные» одновременно по генам ГФКБ и виментина, способны формировать глиальный рубец после повреждения ткани мозга, однако его плотность недостаточна для поддержания целостности ГЭБ. Эти данные свидетельствуют, что регуляция экспрессии ПФ глии является важным компонентом адекватного астроцитарного ответа, вызванного повреждениями ЦНС. Возможно, экспрессия ГФКБ также критична для поддержания нормальной архитектуры белого вещества и целостности ГЭБ [13].
Хроническое воздействие Pb2+ модулирует экспрессию генов, в частности, способствует повышению уровня м-РНК ГФКБ в гипокампе, стриатуме и мозжечке [11]. Принимая во внимание, что астроциты являются основными клетками — «аккумуляторами» свинца в тканях мозга, вполне вероятно, что преждевременная пролиферация астроцитов и ускоренная экспрессия цитоскелет-ного белка, вызванная ацетатом свинца, направлены именно на реализацию протекторных свойств астроцитов.
В настоящее время степень влияния процессов глиоза и преждевременной дифференцировки астроцитов в ранний постнатальный период на процесс созревания ЦНС не установлена. При решении этого вопроса следует учитывать, что именно незрелые астроциты играют главную роль в нейрональной миграции и нейропатогенезе. Это подтверждают результаты исследований нейронального выживания и роста нейритов в ходе совместного культивирования нейронов и мутантных по ГФКБ и виментину астроцитов. Установлено, что астроциты, проявляющие основные черты незрелости, в значительной степени способствуют выживанию нервных клеток, стимулируя нейрито- и синаптогенез. Однако астроглиоз in vitro в общей культуре незрелых нервных клеток и глиоцитов препятствует регенерации аксонов; зрелые астроциты значительно снижают синтез нейротрофических факторов и специфических молекул клеточной адгезии и экстрацеллюлярного матрикса [14]. Принимая во внимание, что ионы свинца индуцируют значительные нарушения психофизиологических характеристик у взрослых крыс под воздействием Pb2+ в эмбриональном периоде и до 16-го дня постнаталь-ного развития, можно прогнозировать появление необратимых сдвигов в нейронально-глиальном взаимодействии и пластичности нервной системы в целом при увеличении продолжительности действия низких доз Pb2+ до полного созревания головного мозга [2].
При проведении исследований важно учитывать, что в ходе альтернативного сплайсинга образуются различные изоформы ГФКБ, имеющие различную субклеточную локализацию и обеспечивающие особенности региональной динамики ПФ астроцитов [15]. Так, эффек-
ты тяжелых металлов на взрослые дифференцированные астроциты сопровождаются нарушением экспрессии основной изоформы ГФКБ — ГФКБа [16]. Возможно, действие ионов свинца вызывает изменения в отдельных компартментах цитоскелета.
Полученные результаты свидетельствуют о токсичном действии ионов свинца на состояние цитоскелета астро-цитов, их дифференциацию в ранний период онтогенеза и формирование зрелой ЦНС.
Выводы
Выявленные повышение содержания ГФКБ и состав полипептидных фрагментов данного цитоскелетного белка астроцитов свидетельствуют об участии ПФ астроци-тарного цитоскелета в глиальном ответе, который развивается вследствие нейротоксического действия низких доз ионов свинца на ранних этапах развития ЦНС.
Библиография
1. Березин, В.А. Нейроспецифические белки цитоскелета / В.А. Березин, Г.М. Шевченко // Укр. биохим. ж. — 1987. — Т. 59. — № 1. — С. 222-232.
2. Stoltenburg-Didinger, G. Glial fibrillary acidic protein and RNA expression In adult rat hippocampus following low-level lead exposure during development / G. Stoltenburg-Didinger, I. Punder, B. Peters et. al. // Histochem. Cell Biol. — 1996. — V. 105. — Р. 431-442.
3. Brambilla, R. Astrocytes play a key role in EAE pathophysiology by orchestrating in the CNS the inflammatory response of resident and peripheral immune cells and by suppressing remyelination / R. Brambilla, P.D. Morton, J.J. Ashbaugh et. al. // J. Glia. — 2014. — V. 62. — P. 452-467.
4. Бандман, А.Л. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов I-IV групп / А.Л. Банд-ман, Л.С. Гудзовский, Л.С. Дубейковская и др. — Л: Химия, 1988. — 512 с.
5. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72. — Р. 248-254.
6. Кокунин, В.А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов / В.А. Кокунин // Укр. биохим. журн. — 1975. — Т. 47. — № 6. — С. 776-791.
7. Sancho, T.M. Developmental pattern of GFAP and vimentin gene expression in rat brain and in radial glial cultures / T.M. Sancho, S. Valles, C. Montoliu, P.J. Renau et. al. // Glia. — 1995. — V. 15. — № 2. — Р. 156-166.
8. Urban N. Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles / N. Urban, F. Guillemot // Frontiers in Cell Neurosci. — 2014. — V. 8 (396). — P. 1-19.
9. De Armond, S.J. Degradation of glial fibrillary acidic protein by a calcium dependent proteinase: an electroblot study / S.J. De Armond, M. Fajardo, S.A. Naughton ed. al. // Brain Res. — 1983. — V. 262. — Р. 275-282.
10. Mei-Hsuan, C. Caspase cleavage of GFAP produces an assembly-compromised proteolytic fragment that promotes filament aggregation / C. Mei-Hsuan, L.T. Hagemann, A. Roy et. al. // Asn. Neuro. — 2013. — V. 5(5). — P. 293-308.
11. Harry, G.J. Lead-induced alterations of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the developing rat brain / G.J. Harry, T.J. Schmitt, Z. Gong et. al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 1996. — V. 139. — Р. 84?93.
12. Neuhaus, W. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier / W. Neuhaus, F. Gaiser, A. Mahringer et. al. // Frontiers in cellular neuroscience. — 2014. — V. 10. — P. 352.
13. Cabezas, R. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease / R. Cabezas, M. Avila, J. Gonzalez et. al. // Frontiers in cellular neuroscience. — 2014. — V. 8. — P. 211.
14. Wang, D. The Astrocyte Odyssey / D. Wang, A Bordey // Prog. Neurobiol. — 2008. — V. 4(86). — P. 342-367.
15. Thomsen, R.L. Alternative mRNA splicing from the glial fibrillary acidic protein (GFAP) gene generates iso-forms with distinct subcellular mRNA localization patterns in astrocytes / R.L. Thomsen, T.F. Daugaard, I.E. Holm et. al. // Plos. One. — 2013. — V. 8. — P. 23-35.
16. Rai, A. Down-regulated GFAPa: a major player in heavy metal induced astrocyte damage / A. Rai, S.K. Maurya, R. Sharma et. al. // Toxicol. Mech. Methods. — 2013. — V. 2(23). — P. 99-107.
SUMMARY
H.V. Sukharenko1, I.V. Prishchepa2, V.S. Nedzvetsky2, V.I. Maksimov3
1 Kerch State Maritime Technological University (Kerch).
2 Dnepropetrovsk National University by Oles Gonchar (Dnepropetrovsk).
3 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology by K.I. Skryabin (Moscow).
Rat Brain Cytoskeleton of Astrocytes State in the Early Postnatal Development Following Low Dose Pb2+ Ions Exposure. There was investigated lead acetate exposure (as 25 mg/l in drinking water) on polypeptide composition and content of the glial intermediate filament protein in the early postnatal period (1...21-th days). Sufficient elevation (p<0,01) of glial fibrillary acidic protein (GFAP) level was shown in cerebellum and hemispheres every groups (1-, 10-, 21-th postnatal day). Immunoreactive products of GFAP degradation with the range of Mr 47.40 kDa were found in lead-exposed rat brain. Obtained results suggest the rising of astroglial reactivation against the chronic treatment with lead acetate following early postnatal development.
