CC BY
20
УДК 611.37: 616.37 — 002:615.245
Ф. В. БАСОВ, В. С. ТАРАСЕНЮО А. А. СТАДНИКОВ, С. Д. ВАЛОВ, Д. В. ВОЛКОВ, Е. В. МАЛИЦКАЯ, А. А. БОБЫЛЕВ
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПЕРФТОРАНА
Оренбургский государственный медицинский университет
F. V. BASOV, V. S. TARASENKO, A. A. STADNIKOV, S. D. VALOV, D. V. VOLKOV, E. V. MALICKAY, А. А. BOBYLEV
STRUCTURALLY THE FUNCTIONAL CHARACTERISTIC OF CHANGES IN
THE PANCREAS IN CONDITIONS OF THE EXPERIMENTAL SHARP PANCREATITIS
AT INFLUENCE PERFTORAN
Orenburg State Medical University
РЕЗЮМЕ.
В работе изучена ультраструктурная реорганизация клеток паренхимы и стромы поджелудочной железы при экспериментальном остром панкреатите в условиях влияния перфторана. С использованием комплексного методического подхода (световая и электронная микроскопия, морфометрия, иммуно-цитохимическая идентификация апоптозных клеток) доказана возможность позитивного влияния экзогенно вводимого перфторана на процессы репа-ративных гистогенезов, васкулогенеза, восстановления микроциркуляции паренхимы и стромы поджелудочной железы при экспериментальном остром панкреатите, а также показано позитивное воздействие данного препарата на компенсаторно-приспособительные возможности органа.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ОСТРЫЙ ПАНКРЕАТИТ, ПЕРФТОРАН.
SUMMARY.
In work ultrastructural reorganization of cells a pancreas is studied at an experimental sharp pancreatitis in
Басов Федор Валерьевич — к. м. н., доцент кафедры госпитальной хирургии, урологии; тел. 89128421627; e-mail: fbassov@mail.ru Тарасенко Валерий Семенович — з. вр. РФ, д. м. н., профессор, заведующий кафедрой госпитальной хирургии, урологии; тел. 8 (3532) 349296; e-mail: k_gspsury@orgma.ru
Стадников Александр Абрамович — з. д. н. РФ, з. р. в. ш. РФ,
д. б. н., профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии; тел. 89128467914; e-mail: alexander. stadnikovnoreply@iqelite.com
Валов Сергей Дмитриевич — д. м. н., профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии; тел. 8 (3532) 772275; e-mail k_histology@orgma.ru
Волков Дмитрий Владимирович — д. м. н., доцент кафедры госпитальной хирургии, урологии; тел. 8 (3532) 349296; e-mail: k_ gspsury@orgma.ru
Малицкая Елена Владимировна — к. м. н., доцент кафедры госпитальной хирургии, урологии; тел. 8 (3532) 349296; e-mail: k_ gspsury@orgma.ru
Бобылев Алексей Александрович — к. м. н., доцент кафедры госпитальной хирургии, урологии; тел. 8 (3532) 349296; e-mail k_ gspsury@orgma.ru
conditions of influence perftoran. With use of the complex methodical approach (light and electronic microscopy, morphometric, immunohistochemistry identification apoptotic cells) is proved an opportunity of positive influence entered perftoran on processes regenerative properties of pancreatocytes, restoration of microcirculation a pancreas at an experimental sharp pancreatitis, and also positive influence of the given preparation on adaptive opportunities of body is shown.
KEY WORDS: AN EXPERIMENTAL SHARP PANCREATITIS, PERFTORAN.
Острый панкреатит остаётся одной из нерешённых проблем клинической медицины, являясь одним из потенциально фатальных заболеваний с широкой вариацией клинических форм, разнообразием местных и системных осложнений [2, 4, 5].
Внутриклеточная активация ферментов, на фоне нарастающей гипоксии в результате нарушений кровообращения в поджелудочной железе на уровне микроциркуляторного звена, приводит к ацинарному некрозу и некрозу жировых клеток. Возникают две тесно взаимосвязанные, «каскадно» протекающие патобиохимические и морфофункци-ональные реакции, в результате чего развивается комплекс тяжелых изменений как в самой железе, так и во внутренних органах [6, 9].
Интегральным моментом, определяющим прогрессирующее развитие патофизиологических нарушений в поджелудочной железе и в организме в целом при остром панкреатите, являются функциональные и структурные изменения, сопровождающиеся повышением продуктов свободного радикального окисления [8, 10, 11].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ — изучить структурно-функциональные изменения тканей поджелудочной железы при экспериментальном остром панкреатите под влиянием перфторана.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Исследования по изучению морфологических и
репаративных изменений в поджелудочной железе в условиях экспериментального острого панкреатита под влиянием перфторана были выполнены на 45 половозрелых морских свинках-самцах массой 550-720 г.
В I (А, В) серии опытов (контрольной) на 30 животных осуществляли моделирование экспериментального острого панкреатита (ЭОП). В операционных кафедры гистологии Оренбургского государственного медицинского университета с соблюдением правил асептики морским свинкам под эфирным наркозом производили верхнесрединную лапаротомию и выделяли поджелудочную железу. Затем в протоковую систему железы вводили 0,5-1,0 мл стерильной желчи (от больных, оперированных по поводу холедохолитиаза, без гнойного холангита) с каплей аутокрови и механическим повреждением ее тканей: дольки органа подвергали травматизации путем сдавления их браншами анатомического пинцета (модель Mallet Guy, 1961). В брюшную полость эксперементального животного для дальнейшего введения препарата (в зависимости от серии) ставили тонкий эпидуральный (стерильный) катетер. Рану брюшной полости зашивали наглухо с подшиванием поджелудочной железы к париетальной брюшине и с фиксированием кисетным и Z-образным швами катетера к коже животного, для введения лекарств.
В I А серии животные были интактны, в I В серии на животных воздействовали 0,85% раствором хлорида натрия, в разовой дозе 6 мл/кг, через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно. Данная серия являлась контрольной.
Во II серии опытов на 15 животных создавалась аналогичная модель ЭОП, через эпидуральный катетер осуществляли внутривенное введение пер-фторана в разовой дозе 6 мл/кг, через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно. Контролем служили животные I (А, В) серии.
Изучение полученного материала (биоптаты поджелудочной железы) у экспериментальных животных осуществляли через 1, 3 и 5 суток от начала эксперимента на световом и электронно-микроскопическом уровнях, с применением иммуноцитохимических исследований. Гистосрезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином.
Дифференцировку углеводных соединений в тканях поджелудочной железы с необходимыми контролями проводили в соответствии с рекомендациями Э. Пирса (1962) [3].
Нуклеиновые кислоты выявляли метиленовым зеленым и пиронином Ж по Браше. Морфологические исследования соотношений жизнеспособных и некротизированых зон поджелудочной железы
на гистопрепаратах проводили с использованием окулярных морфометрических приспособлений [1].
Выявление ДНК в срезах клеточных элементов проводилось по методу Фёльгена — Розенбека.
Для идентификации клеток с признаками апоп-тоза применяли иммуноцитохимические реакции: на определение экспрессии проапоптотического белка р53 и на выявление интернуклеосомаль-ной фрагментации ДНК (фирма «Дако», Дания, ДакоЬ8АВ — kit, Дания). С целью определения внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag Plus in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Intergen», Канада).
Для электронно-микроскопического исследования материал последовательно фиксировали в 2,5% растворе охлажденного (+4о С) глютарового альдегида и четырехокиси осмия по G. Millonig (1961). Обезвоживание проводили в ацетоне с нарастающей концентрацией и последующей заливкой кусочков в смолу ЭПОН-812. Ультратонкие срезы приготовили на ультратоме LKB-5. Срезы подвергли двойному контрастированию: в 2% водном растворе уранила ацетата при +37о С в течение 2 часов и цитрате свинца [10]. Изучение объектов и фотографирование их осуществляли с помощью электронного микроскопа ЭВМ 100 АК при увеличениях Х7000 — х48 000.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Гистологически отмечены явления воспаления с признаками застойных изменений. В ацинарных клетках выражены процессы вакуолизации цитоплазмы, некробиоза и некроза. В соединительнотканных прослойках наблюдается отёк, проявляющийся в набухании волокон и матрикса (основное аморфное вещество). В прослойках соединительной ткани определяются расширенные сосуды микро-циркуляторного русла, плазмоциты, нейтрофиль-ные лейкоциты, моноциты. При электронно-микроскопическом изучении капилляры, артериолы и венулы тромбированы, их эндотелий отечен и подвергнут десквамации, ядра пикнотичны и деформированы. В зонах паранекроза определяются обширные поля, где полностью стерта гистострук-тура поджелудочной железы. Ацинусы имеют вид бледных, иногда эозинофильных островков, либо тяжей, утрачивающих клеточное строение. Ядра ацинозных клеток подвергаются кариопикнозу, ка-риорексису и кариолизису.
Введение перфторана в условиях экспериментального острого панкреатита приводит к достоверному увеличению объёма ядер ацинозных клеток и ядерно-цитоплазматических отношений за счёт возрастающего числа двуядерных клеток (табл. 1).
Таблица 1 — Изменение морфометрических характеристик ацинозных клеток в эксперименте
Параметры Контроль (интактные животные) ЭОП + 0,85% раствор хлорида натрия ЭОП + перфторан
Цитоплазма ацинозных клеток (мкм) 10,62±0,16* 11,41±0,23** 12,44±0,31*, **
Ядра ацинозных клеток (мкм) 5,71±1,01* 7,11±0,58** 8,93±0,02*, **
Отношение двуядерных ацинозных клеток к одноядерным 0,06±0,01* 0,07±0,01** 0,12±0,01*, **
Диаметр гемокапилляров (мкм) 8,74±0,20* 9,11±0,31** 8,14±0,14*, **
* — р<0,01 для различий с морфометрическими показателями контроль — перфторан; ** — р<0,01 для различий с морфометрически-ми показателями ЭОП + 0,85% раствор хлорида натрия — ЭОП + перфторан.
Это может свидетельствовать о создании необходимых условий для реализации ими репаратив-ных возможностей. На ультраструктурном уровне установлена сохранность межклеточных и мембранных компартментов клеток. Данные изменения протекали на фоне нормализации сосудов микро-циркуляторного русла.
В отличие от контрольной серии эксперимента в опытной группе животных в концевых секреторных отделах отмечаются явления мукоидизации. Необходимо отметить, что без введения перфтора-на декомплексированные ацинарные клетки характеризовались высоким содержанием рибонуклео-протеидов и суммарного белка.
По показателю синтеза суммарного белка в ацинозных клетках наблюдалось его снижение и усиление процессов ослизнения. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение перфторана изменяет характер белкового обмена, специфичного для поджелудочной железы. Введение перфто-рана стимулирует пролиферативные процессы при экспериментальном остром панкреатите и структурное состояние функционирующих концевых отделов железы. Были обнаружены секреторные клетки в концевых отделах, которые подвергались дедифференцировке. Ацинозные клетки уплощались, в цитоплазме редуцируются структуры эн-доплазматической сети, пластинчатый комплекс Гольджи, уменьшаются размеры митохондрий, увеличивается количество свободных рибосом и полисом. Такие клетки входили в состав эпителиальных трубочек, формирующихся в зоне регенеративных образований. Необходимо отметить, что введение перфторана уменьшало развитие воспалительной реакции в поджелудочной железе. Это проявлялось
В условиях введения перфторана отмечены явления митотического деления центрацинозных клеток и клеток выводных протоков, формирующих трубчатые структуры. В результате описываемых процессов в железе можно выделить несколько зон: регенеративная, представленная пролифериру-ющим эпителием среди малодифференцированной соединительной ткани, пограничной зоне некроби-отическими изменённых тканей, пограничная зона неповреждённой поджелудочной железы.
Следует отметить, что число ДНК-синтезирующих клеток и экспрессирующих клеток синтез антиапопто-тического белка Ьс1-2 возрастало по сравнению с контрольной серией в 2,6-3 раза (табл. 2).
в уменьшении отёка, нейтрофильной и моноцитар-ной инфильтрации. Отмечались пролиферирующие клетки фибробластического ряда, которые активно врастали между сохранёнными и дискомплексиро-ванными концевыми отделами железы.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Настоящее исследование — попытка выяснить возможное влияние препарата перфторан на поджелудочную железу при экспериментальном остром панкреатите.
Исследуя фрагменты поджелудочной железы экспериментальных животных, у которых с целью лечебной коррекции применяли препарат перфто-ран, мы получили существенные морфологические отличия в развитии репаративных гистогенезов.
Это, прежде всего, проявилось в уменьшении выраженности некробиотических и некротических изменений паренхиматозных и стромальных структур органа за счет усиления процессов васкулогенеза, улучшения микроциркуляции, пролиферации эндо-телиоцитов, фибробластов, моноцитарных макро-
Таблица 2 — Количество ьо1-2 позитивных ацинарных клеток в условиях экспериментального острого
панкреатита (в %)
Контроль (интактные животные) ЭОП + 0,85% раствор хлорида натрия ЭОП + перфторан
0,11±0,01* 2,61±0,21* 1,92±0,06*,**
* — р<0,01 — для различий контроль + перфторан; * — р<0,01 — для различий ЭОП + 0,85% раствора хлорида натрия — ЭОП + перфторан.
фагов, более раннем отграничении очагов некроза малодифференцированной соединительной тканью.
При применении перфторана активизация пролиферации и гипертрофия сохранных панкреатоцитов, клеток выводных протоков, сопряженные с васкуло-генезом и новообразованием соединительнотканных элементов приводит к появлению в пограничных с некротическими участками поджелудочной железы островков органотипической регенерации с формированием атипических ацинусов. Одновременно возрастает численность концевых отделов железы с признаками ослизнения ацинозных клеток.
Применение перфторана существенно стимулирует регенераторные возможности соединительной ткани. Уже через 3 сут. развивается малодифферен-цированная соединительная ткань по краю очагов некроза. При этом без использования перфторана к 5 сут. опыта очаги панкреонекроза покрывались дифференцированной соединительной тканью с грубыми пучками коллагеновых волокон, то при применении перфторана дистальные слои соединительнотканных участков сохраняли малодиффе-ренцированный вид и были пронизаны новообразованными гемокапиллярами.
В тех сериях опытов, где применялся перфторан на стадиях 3-5-х суток опыта, уменьшалось количество тромбированных и сладжированных сосудов микроциркуляторного русла. Одновременно усиливались регенераторные потенции эндотелиоцитов, фибробластов и периваскулярных клеток.
На ультраструктурном уровне установлена сохранность митохондрий и мембранных компонентов клеток. Данные изменения протекали на фоне нормализации размеров сосудов микроциркуля-торного русла.
В отличие от контрольной серии эксперимента (в опытной группе животных) концевые отделы перестраиваются, подвергаясь мукоидизации. Необходимо заметить, что без влияния перфторана дискомплексированные и ацинарные клетки характеризовались высоким содержанием детрита и суммарного белка.
Изучение гистопрепаратов и электроннограмм показало, что пограничные с участками панкрео-некроза аденоциты, центрацинозные клетки, эпителий выводных протоков сохраняли свои гисто- и органобластические репаративные свойства.
Таким образом, воздействие перфторана в эксперименте положительно отразилось на ходе репа-ративных процессов в поджелудочной железе. Ис-
пользование его повышало репродуктивную активность сохранных ацинозных клеток, эпителиоцитов выводных протоков, фибробластов. Данные эффекты прослежены во все сроки наблюдений. Применение перфторана обеспечило не только более быстрое и эффективное отграничение очагов панкре-онекроза, но и привело к значительной стимуляции пролиферации эпителиальных структур органа.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия / Г. Г. Автандилов. — М.: Медицина, 1990. — 260 с.
2. Кубышкин, В. А. Лечебная тактика при пан-креонекрозе / В. А. Кубышкин // Анналы хирургической гепатологии. — 1996. — № 1. — С. 148.
3. Пирс, Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс. — М. : ИЛ, 1962. — 610 с.
4. Руднов, В. А. Интенсивная терапия некро-тизирующего панкреатита: анализ современного состояния / В. А. Руднов, А. С. Зубарев // Русский Медицинский Журнал. — 2005. — Том 13. — № 26. — С. 1774-1778.
5. Савельев, В. С. Деструктивный панкреатит: алгоритм диагностики и лечения (проект) / В. С. Савельев, М. И. Филимонов, Б. Р. Гельфанд, С. З. Бурневич // Consilium-medicum. — 2001. — Т. 3. — № 6. — С. 273-279.
6. Смирнов, Д. А. Диагностика мембранных нарушений при остром панкреатите / Д. А. Смирнов, Л. С. Ходосевич, А. Т. Плащевский // Хирургия. — 1990. — № 1. — С. 49-52.
7. Bonner-Weiz, S. Pancreatic stem cells / Bonner-Weiz, S. // J. Pathol. — 2002. — V. 197. — № 3. — P. 519-526.
8. Kim, So-Yoon. Activation of nestin-positive duct stem cells in pancreas / Kim So-Yoon, Lee S. H., Bendayan M. H. // Dev. dynamics. — 2004. — V. 230. — № 1. — P. 1-11.
9. Nonaka, A. The role of free radical in the development of acute mild and severe pancreatitis in mice / Nonaka A., Mahabe T., Kyogoku T. [et al.] // Nippon Shokak-ibyo Gakkai Zasshi. — 1990. — V. 87. — P. 1212-1216.
10. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy / Reynolds, E. S. // J. Cell. Biol. — 1963. — Vol. 17. — P. 203-213.
11. Sunamura, M. Pancreatic microcirculation in acute pancreatitis / Sunamura M., Yamauchi J., Shibuya K., Chen H. M., Ding L., Takeda K., Kobari M., Matsuno S. // J. Hepatobiliary Pancreat Surg. — 1998. — 5 (1). — 62-8.
