CC BY
45
БИОЛОГИЯ
УДК 57:612.398:616-074
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ОРГАНИЗМА
© 2010 г. Л.М. Обухова, К.Н. Конторщикова
Нижегородская государственная медицинская академия, пл. Минина, 10/1, г. Нижний Новгород, 603005, nnsma@sandy. т
Nizhny Novgorod State Medical Academy, Minin Sq., 10/1, Nizhny Novgorod, 603005, nnsma@sandy. ru
Проанализировано состояние белков плазмы крови in vitro в модельных опытах с солями металлов и водорастворимыми токсикантами, а также при интоксикации организма различного генеза. Показано, что изменение структурной конформации молекул белков плазмы крови сопровождает интоксикацию и обусловлено активацией свободнорадикальных процессов.
Ключевые слова: интоксикация, белки плазмы крови, клиновидная дегидратация, структурная конформация, свободно-радикальное окисление.
The paper analyzes the state of plasma proteins in vitro in the modeling experiments with metal salts and in aqueous-soluble toxicants as well as during organism intoxication of different genesis. It is shown that intoxication is accompanied by the change in structural conformation of the molecules of plasma proteins which is due to activation of free-radical processes.
Keywords: intoxication, plasma protein, wedge-type dehydration, structural conformation, free-radical oxidation.
Одним из ранних индикаторов нарушения гомео-стаза организма при интоксикации является изменение структурной организации белковых молекул [1]. В связи с этим цель данной работы - изучение механизмов воздействия токсических веществ на протеины плазмы крови.
Материалы и методы
Изучены образцы плазмы крови больных с эндогенной (ЭИ) и экзогенной интоксикацией. В 1-ю группу вошли 75 больных при эндогенной интоксикации (52 женщины и 23 мужчины в возрасте от 43 до 67 лет): 27 человек с обменным типом ЭИ (ишемическая болезнь сердца, вегетососудистая дистония, гипертоническая болезнь); 16 - с ретенционной интоксикацией (хроническая обструктивная болезнь легких, почечная недостаточность, мочекаменная болезнь); 26 - с ре-зорбционным типом (перенесенный инфаркт миокарда, сахарный диабет II, термическая травма); инфекционная - 8 чел. (острая респираторная вирусная инфекция). Контролем служили 11 практически здоровых человек (7 женщин и 4 мужчин в возрасте от 35 до 60 лет).
Во 2-ю группу вошли 21 больной с хронической алкогольной интоксикацией - 15 мужчин и 6 женщин в возрасте от 27 до 60 лет. Поскольку основной мишенью токсического действия алкоголя является печень [2], группу сравнения (3-я группа) составили 8 пациентов с поражениями печени неалкогольного генеза (хронический холецистит и фиброз печени): 6 мужчин и 2 женщины в возрасте от 16 до 62 лет. Кон-
тролем служили 12 практически здоровых людей: 7 мужчин и 5 женщин в возрасте от 19 до 57 лет.
Исследование структурной организации белков проводили методом клиновидной дегидратации [3], принцип которого заключается в анализе системной организации биологической жидкости после перевода ее в твердую фазу при испарении жидкости из капли на подложке. Фазовый переход из жидкого состояния в твердотельное способствует образованию определенного структурного статического порядка. Данный феномен обусловлен неравновесным состоянием наноструктур белка, возникающим при дегидратации, далекой от термодинамического равновесия открытой системы белок-вода [4]. Для перевода наблюдаемых параметров структурного макропортрета биологической жидкости в численную форму использовали собственную методику, согласно которой выраженность признаков: трещины, конкреции, кристаллы, аномальные особенности (рисунок), оценивали по 10-балльной шкале.
Помимо исследования плазмы крови методом клиновидной дегидратации определили степень эндогенной интоксикации по Малаховой [5], интенсивность свободнорадикальных процессов методом индуцированной хемилюминесценции (1тах; 8) [6], содержание окисленно модифицированных белков (ОМБ) плазмы крови [7], олигопептидов (ОП) [8]; уровни мочевины, креатинина, липидного обмена, общего (БПобщ) и связанного билирубина (БПсвяз), активности аспартатаминотрансферазы (АсАт) и ала-нинаминотрансферазы (АлАт), у-глу та \ г и лтра не пс п -тидазы (ГГТП) стандартными унифицированными
методами на биохимическом анализаторе Clima МС-15 (Ral, Испания) с применением тест-систем фирмы DiaSys (Германия); уровни СОЭ, лейкоцитов рутинными методами.
Статистическую обработку результатов проводили при помощи программных пакетов «Statistica» и «Бь ostat». Значимость различий между величинами деляли по критерию Ньюмана-Кейсла, взаимосвязь параметров картины высохшей ли биологической жидкости с биохимическими параметрами - методами линейной и кусочно-линейной регрессии, дискриминантного анализа.
Результаты
Аномальные особенности структурного макропортрета биологической жидкости (х50)
Обнаружено, что по мере роста содержания веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ -основного критерия для оценки ЭИ) увеличивается общее количество особенностей в структурном макро портете плазмы (пл.) крови (табл. 1).
Таблица 1
Показатели структурного макропортрета, уровня интоксикации, белкового гомеостаза при ЭИ (М±т)
Показатель Норма, n=11 Стадия ЭИ
I, n=29 II, n=32 III, n=10 IV, n=4
Кол-во особенностей 1,57±1,22* 3,79±0,83* 5,84±0,52* 7,4± 0,48* 8,66±1,03
Imax, мВ 1,25±0,12* 1,63±0,14* 2,29±0,22* 2,8±0,18* 1,79±0,17*
S, отн.ед. 14,00±1,50* 20,73±2,23* 21,19±1,60* 24,17±2,41* 21,50±2,51
ВНСММ пл., усл. ед. 10,85±0,1* 12,99± 0,27* 18,20± 0,25* 25,17± 0,60* 26,56± 1,39
ВНСММ эр., усл. ед 21,41±2,19* 27,85± 0,96* 31,73± 1,66* 34,52± 1,23* 32,18±2,17
ОП пл., мг/л 112,2+4,97 117,54±3,05 125,67±4,79* 148,33±6,13* 150,77±5,24*
ОП эр., мг/л 24,33+2,23 46,24±1,84* 50,32±2,56* 54,43±1,27* 52,18±2,43*
ОМБ спонт., усл. ед 134,68±16,63* 343,95±22,37* 347,76±25,28 304,08±21,65* 378,14±19,87*
ОМБ индуц., усл. ед 667,32±49,62* 1149,9±125,99* 848,53±127,84* 1010,51±78,126* 1251,29±109,52*
*- различия между показателями групп достоверны (р<0,05) (критерий Ньюмана-Кейсла).
Методом линейной регрессии выявлена достоверная связь между стадией интоксикации и появлением аномальных особенностей (линейная зависимость описывает 67,22 % всех фактических значений).
Для правильной интерпретации вышеуказанной взаимосвязи необходимо учитывать обнаруженную интенсификацию свободнорадикальных процессов в крови больных при ЭИ (табл. 1). Кроме того, имеются достоверные отличия между уровнем этих показателей при разных стадиях ЭИ. О четко выраженной зависимости возникновения аномальных особенностей в дегидратированной капле плазмы крови от уровня свободнорадикальных процессов свидетельствует и весьма значительный коэффициент детерминации ^=0,8956) при статистическом анализе на основе кусочно-линейной регрессии.
С активацией свободнорадикальных процессов при ЭИ связана ОМБ плазмы крови, что проявилось в их фрагментации и увеличении уровня ОП. Выявлена обратная зависимость между степенью интоксикации и процессами накопления продуктов ОМБ. На наш взгляд, это свидетельствует об усилении фрагментации белковых молекул в процессе развития ЭИ. Данное предположение подтверждается наличием прямой
зависимости между количеством ОП и стадией развития ЭИ.
В подтверждение вышеизложенной гипотезы о возникновении аномальных особенностей благодаря действию свободных радикалов на белки методом кусочно-линейной регрессии выявлена достоверная связь между уровнем ОП в плазме и эритроцитах крови и появлением аномальных особенностей в структурном макропортрете.
Помимо фрагментации ОМБ может приводить к образованию карбонильных производных, что не связано с распадом белковой молекулы, но сопровождается значительным изменением ее структурной кон-формации. Именно такой тип изменений в настоящее время рассматривают как возможный пусковой механизм многих патологических состояний [1].
Обращает на себя внимание существование двух типов аномальных особенностей структурного макропортрета биологической жидкости: на базе трещин и связанной с изменениями структуры полимерной пленки (см. рисунок).
Вероятно, последний тип аномальных особенностей обусловлен появлением продуктов фрагментации белковых молекул и ОП. Характерно, что морщины, ли-
нии Валнера и языки Арнольда возникают только при терминальной стадии ЭИ. Обнаружение особенностей на основе трещин не связано со степенью интоксикации. Обнаружена взаимосвязь формы таких особенностей макропортрета плазмы крови с различными патологическими состояниями. Так, нарушение липидного обмена у больных при ишемической болезни сердца проявляется наличием особенностей в виде рыбьей чешуи в промежуточной зоне. При воспалении любой этиологии в структурном макропортрете имеют место закругленные и круглые трещины, а для деструктивных процессов (сахарный диабет, инфаркт миокарда) характерно наличие трещин типа «черная сеть».
Ранее было доказано [9], что характер трещин в полимерной пленке белкового раствора обусловлен конформацией составляющих ее белков. В связи с этим можно предположить, что образование аномальных особенностей на базе трещин связано с патологи-
*
Выявлено, что активность ГГТП, являющейся высокочувствительным индикатором при заболеваниях печени, в плазме крови больных хроническим алкоголизмом была в 6,5 раз выше показателя в контрольной группе ив 1,8 раз превышала таковую в группе 3 (табл. 2).
Уровень БПобщ. при хроническом алкогольном отравлении был значительно выше, чем в контрольной группе (табл. 2). Кроме того, имело место повышение уровня БПсвяз. (по сравнению с контролем) при практически неизменном содержании свободного.
При поражениях печени неалкогольного генеза отмечался значительный рост всех фракций билирубина.
При хроническом алкогольном отравлении содержание ВНСММ в плазме крови возрастало более чем в 2 раза при практически неизменном соотношении ВНСММ в эритроцитах (по сравнению с практически здоровыми людьми) (табл. 2). У больных алкоголизмом диагностирована ЭИ от 2 до 4-й степени.
Было обнаружено повышение количества аномальных особенностей структурного макропортрета плазмы крови при хроническом алкогольном отравлении (7,37±1,75) и поражениях печени неалкогольного генеза (8,6±0,71) по сравнению с контролем (1,57±1,22). Причем количество особенностей в высохшей капле
ческим изменением структуры белков плазмы крови, вызванной их окислительной модификацией под влиянием различных субстратов ЭИ.
Обнаруженная зависимость структурных изменений молекул белков плазмы крови от вида токсического соединения исследована на примере ЭИ - хроническом алкогольном отравлении.
В группах хронического алкогольного отравления и при поражениях печени неалкогольного генеза показатели активности трансфераз значительно превышали таковые у практически здоровых людей (табл. 2). Соотношение АсАт/АлАт составляло в среднем 1,76, что является одним из признаков хронической алкогольной интоксикации [10]. Напротив, в изученных случаях поражения печени неалкогольного генеза данное соотношение активности ферментов было менее 1 (0,65) при наблюдаемой более значительной гиперфермен-тии, чем в группе алкогольной интоксикации (табл. 2).
плазмы крови при алкоголизме также возрастало по мере увеличения уровня ВНСММ.
При хронической алкогольной интоксикации преобладающими типами особенностей являются круглые трещины и трещины типа «черная сеть», расположенные в центральной зоне высохшей капли. Сходные особенности наблюдаются и при поражениях печени неалкогольного генеза.
Процессы катаболизма алкоголя приводят к интенсификации свободнорадикальных процессов [11], что является одной из причин повреждений, вызываемых алкоголем. Анализ имеющихся данных позволил выделить основные, связанные с этапами катаболизма алкоголя, механизмы ускорения реакций сво-боднорадикального окисления: образование активных форм кислорода и гидроксиэтильного радикала при окислении этанола микросомальной этанолокисляю-щей системой; взаимодействие ацетальдегида и его аддуктов с биогенными тиолами; продукция супероксидного радикала в результате окисления ацетальде-гида ксантиноксидазой и альдегидоксидазой.
Рассматривая уровень ВНСММ как отражение патологического белкового метаболизма при активации свободнорадикальных процессов [12], можно констатировать, что и при алкогольной интоксикации коли
Таблица 2
Величина некоторых биохимических показателей при хронической алкогольной интоксикации и поражениях печени неалкогольного генеза (М±т)
Показатель Норма, n=12 Алкогольное отравление, n=21 Неалкогольное поражение печени, n=8
ВНСММ пл., усл. ед 8,55± 2,973* 21,86± 3,53* 30,35± 4,49*
ВНСММ эр., усл.ед 21,66± 6,870 26,06± 3,98 36,71± 5,88*
БД общ., мкмоль/л 11,42± 2,00* 17,74± 2,57 22,67±7,52
БПсвяз, мкмоль/л 2,97± 0,81* 8,79 ± 3,03 8,8±3,34
БПсвоб., мкмоль/л 8,45± 1,58 6,27± 2,38 13,87±4,69*
АсАт, ед/л 24,52± 6,60* 64,75± 11,03* 186,50±56,78*
АлАт, ед/л 15,2± 4,24* 36,75± 9,25* 285,5±73,15*
ГГТП, ед/л 19,84±1,51* 127,8±23,47* 71,68±18,25*
- различия между показателями групп достоверны (р<0,05) (критерий Ньюмана-Кейсла).
чество аномальных особенностей структурного макропортрета плазмы крови коррелировало со степенью нарушения гомеостаза протеинов. Последнее определялось токсическим поражением печени, которое сопровождалось увеличением ферментативной активности трансфераз, ГГТП и уровня БПобщ. и БПсвяз.
Таким образом, изменение структурной конфор-мации молекул белков плазмы крови сопровождает как экзогенную, так и эндогенную интоксикацию и обусловлено такой неспецифической реакцией организма на токсикант, как активация свободноради-кальных процессов.
Литература
1. Лопухин Ю.М., Добрецов Г.Е., Грызунов Ю.А. Конфор-
мационные изменения молекул альбумина: новый тип реакции на патологический процесс // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2000. Т. 130, № 7. С. 4.
2. Буеверов А.О., Маевская М.В., Ивашкин В.Т. Алкоголь-
ная болезнь печени // Рос. мед. журн. 2001. Т. 3, № 2. С. 61.
3. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологиче-
ских жидкостей человека. М., 2001. 304 с.
4. Рапис Е. Самоорганизация и супермолекулярная химия
пленки белка от нано- до макромасштаба // Журн. техн. физики. 2004. Т. 74, № 4. С. 117.
Поступила в редакцию_
5. Малахова М.Я. Метод регистрации эндогенной интокси-
кации: пособие для врачей. СПб., 1995. С. 33.
6. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Приме-
нение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободнорадикальных реакций в биологических субстратах // Биохимия и биофизика микроорганизмов: межвуз. сб. Горький, 1983. С. 179.
7. Окислительная модификация белков сыворотки крови
человека. Методы ее определения / Е.Е. Дубинина [и др.] // Вопросы мед. химии. 1995. Т. 41, № 1. С. 24.
8. Габриелян Н.И., Липатова В.И. Опыт использования
показателей средних молекул в крови для диагностики нефрологических заболеваний у детей // Лаб. дело. 1984. № 2. С. 138.
9. Белова Л.М. Морфофизиологический анализ биологиче-
ски активных продуктов пчелиной семьи : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Н. Новгород, 2002. 24 с.
10. Костюкевич О.И. Алкогольное поражение печени: со-
циальное звучание, клинические последствия и аспекты патогенетической терапии // Рус. мед. журн. 2007. Т. 9, № 2.С. 62.
11. 1-Hydroxyethyl radical formation during NADPH- and NADH-dependent oxidation of ethanol by human liver microsomes / D.N. Rao [et al.] // Mol. Pharmacol. 1996. Vol. 49, № 5. P. 814.
12. Карякина Е.В., Белова С.В. Молекулы средней массы
как интегральный показатель метаболических нарушений // Клин. лаб. диагностика. 2004. № 3. С. 3.
15 мая 2009 г.
