CC BY
138
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Структурная динамика адгезивных клеток костного мозга при культивировании: первичный пассаж (часть 1)
Н.П. Омельяненко, В.К. Ильина, А.В. Ковалев, В.А. Кальсин, С.А. Родионов Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова, Москва
Structural dynamics of adhesive bone marrow cells by cultivation: primary passage (part 1]
N.P. Omelianenko, V.K. Ilyina, A.V. Kovalev., V.A. Kalsin., S.A. Rodionov Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics, Moscow
Исследована структурная динамика гетерогенных адгезивных клеток костного мозга человека. В работе использовались первичные культуры клеток костного мозга доноров. Для исследования клеточных культур применены различные светомикроскопические методы, в том числе модулирующий контраст Хоффмана и дифференциальный интерференционный контраст (ДИК) по Номарскому. Проводилась автоматическая цейтраферная съемка клеточных культур с постоянно поддерживаемой автофокусировкой в условиях культурального инкубатора, интегрированного с инвертированным микроскопом. Использовали четыре степени плотности посева клеток. Показан выраженный полиморфизм посеянных, прикрепившихся и в последующем культивируемых клеток. Выделено 4 группы адгезивных клеток различных по морфологии и структурной динамике. Большинство адгезивных клеток не проявляло заметной пролиферативной активности и лишь их незначительная часть имела высокие пролиферативные потенции. Детально представлена морфология адгезивных клеток во время деления, образования клонов и колоний. Выделено несколько путей формирования сплошного монослоя в зависимости от плотности посева клеток первичной культуры. Полученные данные расширяют представления о характере и структурной динамике адгезивных клеток костного мозга человека в первичной культуре ¡п vitrо.
Ключевые слова: клетки костного мозга, первичные культуры, адгезивные клетки.
Structural dynamics of heterogenic adhesive human bone marrow cells was studied using primary cultures of donor's bone marrow cells. Various light microscopic techniques including Hoffman modulation contrast and Nomarski differential interference contrast were used to study cell cultures. Automatic interval photography of cell cultures with constantly maintained focusing under conditions of culture incubator that was integrated with inverted microscope was performed. Four degrees of cell passage density were used. Marked polymorphism of passaged, adhered and subsequently cultured cells was demonstrated. Four groups of adhesive cells with different morphology and structural dynamics were isolated. The majority of adhesive cells showed no marked proliferative activity and only their insignificant part possessed high proliferative potentialities. Several ways for compact monolayer formation depending on primary culture cell passage density were determined. Achieved data broaden the notion of the nature and structural dynamics of human bone marrow adhesive cells in primary culture in vitro.
Key words: bone marrow cells, primary cultures, adhesive cells.
Интерес к исследованиям клеток костного мозга значительно возрос после того, как была обнаружена способность части этих клеток прикрепляться (клеточная адгезия) к поверхности культуральной посуды, распластываться, проявлять структурную динамику, пролиферировать, а также после установления потенциальных возможностей применяться в клинической практике (прежде всего, для активизации репаративной регенерации поврежденных тканей) [1—5]. Эти клеточные популяции могли быть представлены клетками мезен-химального происхождения: гемопоэтическими и соединительнотканными, находящимися на разных стадиях дифференцировки. Однако основное внимание исследователи обращали на малочисленную группу среди адгезивных (прикрепленных) клеток, имеющих высокий пролиферативный потенциал.
e-mail: omel156@yandex.ru
Благодаря последнему эта группа клеток в течение нескольких дней культивирования становилась самой многочисленной, а при последующих пассажах практически единственной клеточной группой в культуре, которая в дальнейшем могла быть использована для клеточной терапии. Колонии этих клеток происходят из предшественников, которые были определены А.Я. Фриденштейном как коло-ниеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф) [1—3]. Арнольд Каплан «переоткрыл» эти клетки и предложил концепцию так называемых мезенхим-ных стволовых клеток [6].
Тем не менее, при первичном посеве в течение первых нескольких дней преобладающими на поверхности пластика или стекла в культуральном флаконе являются другие адгезивные клетки, не проявляющие заметной пролиферативной активности.
Отсутствие исчерпывающих сведений об этих клетках побудило нас провести исследование морфологии и структурной динамики всех адгезивных клеток костного мозга с помощью различных микроскопических методов, включая цейтраферную съемку в условиях культурального инкубатора, интегрированного с инвертированным микроскопом, а также электронную микроскопию.
Материал и методы
В работе использовали первичные культуры клеток костного мозга доноров, подписавших добровольное информированное согласие. Эксплантацию материала — костного мозга — для последующего выделения клеток производили посредством пункции гребня подвздошной кости специальной иглой с широким просветом под местной анестезией. Из полученного костного мозга выделяли мононукле-арную фракцию. Для этого пунктат костного мозга переносили в стерильные пробирки и разводили вдвое средой для культивирования клеток (среда F12). Клеточную суспензию наслаивали на раствор градиента плотности — фиколл 1,077 г/см3 (2:1 по объему) и центрифугировали. Интерфазное моно-нуклеарное кольцо отбирали в отдельную пробирку и отмывали центрифугированием в избытке культу-ральной среды. Клеточный осадок ресуспендирова-ли в культуральной среде с сывороткой крови. Алик-воты клеточной суспензии отбирали для проведения контрольно-измерительных работ. Нужное количество клеточной суспензии эксплантировали в культу-ральные флаконы со средой для дальнейшего культивирования (ДМЕМ, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, L-глютамин, пенициллин-стрептомици-новая смесь). Для исследования использовали четыре степени плотности посева: низкая плотность — 2—8х104на 1 см2; средняя плотность посева — 8—20х104 на 1 см2; высокая плотность - 2-4х105 на 1 см2; очень высокая плотность — 8-16х105 на 1 см2. Флакон с культуральной средой и посеянными клетками костного мозга помещали на предметный столик инвертированного светооптического микроскопа Nikon Eclipse Ti (Япония), интегрированного с культуральным инкубатором, постоянно поддерживающим температуру 37°С. При исследовании использовали специальный объектив х10 и модулирующий контраст Хоффмана. Изображение подавалось через фотокамеру на специализированный контроллер и далее на персональный компьютер. Автоматическая цейтраферная съемка с постоянно поддерживаемой автофокусировкой проводилась с помощью программного обеспечения «Нисэлемент» с интервалом 5 мин в течение 2—4 нед. Начиналась съемка через 0—12 ч после посева и смены культуральной среды. Отдельные периоды культивирования регистрировались в виде цейтраферной съемки с интервалом 20 с и фокусировкой в ручном режиме. Общее объективное увеличение составляло х90, на экране контроллера — х800. Наблюдение производили с помощью дифференциального интерференционного контраста (ДИК) по Номарскому. В некоторых флаконах культуры клеток фиксировали и окрашивали по Романовскому — Гимзе. Для ультраструктурного анализа часть полученных клеток (до культивирования и на разных этапах культивирования) исследовалась с помощью электронной трансмиссионной микроскопии.
Результаты и обсуждение
Первичный (нулевой) посев (пассаж) осуществлялся в составе всех клеток костного мозга, полученных с помощью пункции и сортированных на фиколле (плотность раствора 1,077). Выделенные таким образом клетки (в основном ядерные) помещались в культуральную среду в виде клеточной взвеси. Посеянные клетки были полиморфны (рис. 1). Большинство клеток — шаровидной формы (диаметр 10—12 мкм) с хорошо заметным поверхностным рельефом. Клетки характеризовались наличием ядер, занимающих значительную часть цитоплазмы, и многочисленных округлых «гранул» размером 0,1—0,2 мкм (очевидно, митохондрии, лизосомы, липидные капли и др.).
Вторую группу составляли активно перемещающиеся клетки неправильной, постоянно меняющейся формы, клеточная мембрана которых имела многочисленные складки. Движение и изменение формы клеток сопровождалось изменением формы ядра и перемещением цитоплазмы вместе с «гранулами-органеллами/включениями» из одной части клетки в другую. Клетки активно перемещались и постоянно касались дна флакона своей вытянутой апикальной частью, временно прикреплялись, «скользили» по дну флакона, откреплялись, «дрейфовали» в среде, опять прикреплялись и т.д. Механизм прикрепления осуществлялся за счет выделения апикальной частью клетки, которая касалась дна флакона, гелеобразного прозрачного вещества (по-видимому, гликоконъюгатной природы), «растекающегося» по дну вблизи клетки. Дальнейшее перемещение прикрепившихся клеток осуществлялось с помощью гелевой прослойки. Изменение гелеобразного секрета в процессе жизнедеятельности прикрепившихся клеток приводило к его частичному сморщиванию (вероятно, за счет дегидратирования) и образованию вокруг него складок, похожих на клеточные отростки. Прикрепление этих клеток ко дну флакона начиналось уже через 5—20 мин после первичного посева и могло продолжаться в течение нескольких суток. Такое поведение клеток в культуре, очевидно, является отражением их различного функционального состояния, степени дифференцировки и структурных различий.
Третья группа клеток состояла из мелких клеток шаровидной формы, диаметром 2—5 мкм. Ядра у них окружены узким ободком цитоплазмы с единичными органеллами. В костном мозге одних доноров такие клетки встречались редко, у других определялись их целые скопления. В литературе описано четыре разновидности «микроклеток», которые могут быть стволовыми [7, 8].
Четвертая группа представлена клетками эритро-идного ряда: ядерными — эритробластами, нормо-цитами и др. и безъядерными — ретикулоцитами и эритроцитами.
В выделенной клеточной фракции определялись тромбоциты, имеющие характерную дискоидную форму и один или несколько отростков, похожих на жгутики. Большая часть тромбоцитов локализовалась вокруг и на поверхности мегакариоциов, также находящихся в культуре (рис. 1). Количество тромбоцитов в клеточной взвеси костного мозга зависело от доноров.
• « > Ч
Б • "
• • • « _ Ф-
•
«
е
О?
4
Г
Рис. 7. Клетки костного мозга человека сразу после выделения: 1 - эритроцит; 2 - нормоцит; 3 - липоцит;
4 - мегакариоцит; 5 - лейкоциты; 6 - гелеобразная субстанция; 7 - прикрепившаяся адгезивная клетка;
8 - клетки, меняющие форму; 9 - ядро; 10 - цитоплазма; 11 - вакуоли.
А, Б - световая микроскопия; В, Г - трансмиссионная электронная микроскопия.
Окр.: Б - азур-эозин. Ув.: А, Б х800; В х4000; Г х10 000
Следует также отметить, что все вышеуказанные клетки имели вакуолизированную в разной степени цитоплазму и, в некоторых случаях, разреженное ядро, что, вероятно, являлось результатом обводнения клеток, попавших в культуральную среду.
Следующим этапом было исследование структурной динамики клеток, обладающих адгезивными свойствами. В процессе культивирования все неприкрепившиеся клетки удалялись при смене культуральной среды. Кроме этого нас интересовало, как быстро после посева клетки начинают прикрепляться к дну флакона. В связи с этим были исследованы пассажи средней (8—20х104 на 1 см2) и высокой (2—4х105 на 1 см2) экспланта-цинной плотности, в которых смена среды производилась через 5, 10, 15, 30, 60 мин, 2, 4, 8, 12 и 24 ч после посева клеток. Оказалось, что уже через 5 мин после смены среды на дне флакона оставалось примерно 0,5—1% от общего количества посеянных ядросодержащих клеток. Очевидно, что оставшиеся (прикрепившиеся в разной степени) клетки обладали адгезивными свойствами (рис. 2).
Рис. 2. Клетки костного мозга человека, прикрепившиеся ко дну культурального флакона: 1 - клетки; 2 - гелеобразное вещество; 3 - микроклетки; 4 - тромбоциты. Световая микроскопия, дифференциальный интерференционный контраст по Номарскому. Ув.: х800
Среди них могли быть стромальные клетки костного мозга (СККМ), представляющие совокупность соединительнотканных клеток, находящихся на разной стадии дифференцировки, включая мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), а также среди прикрепившихся клеток могли присутствовать клетки моноцитарного дифферона, включающего макрофаги и остеокласты, которые при 2-3-х пересевах (пассажах), вероятно, выводились из культуры или не обнаруживались в связи с относительным уменьшением их количества. Не исключалось присутствие клеток других гемопоэтических линий. Распределение прикрепившихся клеток на дне флакона было неравномерно, а их количество зависело от эксплантационной плотности посева, используемого костного мозга и времени, через которое производилась смена среды после первичного посева. Более длительный период от первичного посева до первого «сброса» обеспечивал прикрепление большего количества клеток, при этом увеличивалось количество структурно различных клеток. Часть прикрепленных клеток сразу становились уплощенными. Объем клетки при этом заметно не менялся. Вокруг прикрепившихся и уплощенных клеток присутствовал геле-образный секрет. Форма этих клеток была различной: округлой (10—20 мкм в диаметре), овально-вытянутой или узкой вытянутой (10—15 мкм в толщине и 20—30 мкм и более по длине) (рис. 2). Сохранялись микроклетки: округлые (2—5 мкм в диаметре) и вытянутые (2—5 мкм по толщине и 10— 15 мкм по длине). Часть микроклеток располагалась обособленно, другие — прикреплялись к поверхности больших клеток и, постоянно сопровождая их, выполняли роль своеобразных клеток-сателлитов.
Прикрепление клеток не означало их полную фиксацию к дну флакона. Клетки продолжали перемещаться по дну флакона с разной скоростью, используя механизм выделения гелеобразного секрета, могли удлиняться или сокращаться. Кадры цейтраферной съемки этого процесса у одной клетки представлены на рис. 3.
Через 2—3 ч после смены среды в культуре наблюдалось открепление части клеток, которые были «заякорены» только апикальными частями. В дальнейшем (примерно через сутки) могло происходить повторное прикрепление части этих клеток по механизму, описанному выше. Неоткрепившиеся клетки также реагировали на смену среды: они несколько сокращались.
Примерно через 12—24 ч клетки начинали следующий этап жизнедеятельности культивируемых клеток, общеизвестный (определенный) как распластывание. Этот процесс начинался с уплощения, при котором уменьшалась высота клеток над поверхностью дна, сохранялась овальная, округлая и слегка вытянутая форма. На стадии распластывания у всех клеток наблюдалась характерная структурная динамика: уменьшалось количество складок цитоплаз-матической мембраны, т.е. мембрана расправлялась, и ее поверхность становилась более гладкой, визуализировались ядра, эндоплазма с гранулами (органеллами и включениями), небольшая эктоплазма и гелеобразный субстрат, разный по ширине по периферии клеток. Клетки продолжали периодически выделять этот гель, что, очевидно, связано с перемещением клеток и адаптацией к культуральным условиям. Следует отметить постоянное движение
гранул в цитоплазме клеток. Одни гранулы выполняли только колебательные движения вокруг какой-то одной точки, другие перемещались по всей клетке в различные ее области. На поверхности многих прикрепившихся и распластывающихся клеток находились тромбоциты.
Необходимо отметить, что форма и размеры, которые приобретали клетки, а также скорость этого процесса были различны. Это позволило выделить несколько групп клеток.
Раньше других клеток (через 12—24 ч) распластывались, достигая своего конечного размера, редко встречающиеся клетки овальной или неправильной формы, имеющие несколько ядер (от 3 до 8) и размеры: поперечные 30—40 мкм и продольные 80—120 мкм. Вероятно, эти клетки являлись остеокластами (рис. 4). Они постоянно меняли свою форму и перемещались.
К этому времени несколько увеличивались размеры других уплощенных округлых клеток (25x40 мкм, 20x60 мкм, 30x30 мкм и др.), что, соответственно, увеличивало площадь покрытия ими поверхности дна флакона.
Дальнейшее распластывание клеток (через 48 и более часов) проявлялось в развитии вышеуказанной тенденции к изменению формы. Часть клеток становились округлыми с эквивалентным диаметром 30—50 мкм. Центр каждой клетки занимало округлое ядро, окруженное эндоплазмой, а эктоплазма со своеобразной «бахромой» располагалась по периферии (рис. 5А). Такие клетки по форме напоминали «розетки».
Другая часть клеток приобретала вытянутую форму (напоминающую форму «ракеток») при которой средний поперечный размер (10—20 мкм) был в несколько раз меньше продольного размера (30—100 мкм и более). Один конец у таких клеток имел овальную форму с поперечным размером 30—50 мкм, другой — вытянутую, шириной 5—15 мкм (рис. 5Б). Расширенная часть клетки по периферии была окружена «бахромой», которая указывала на направление ее движения. Большую периферическую часть расширенного отдела клетки занимала эктоплазма. В центральной части клетки располагалось овальное ядро с ядрышками, окруженное эндоплазмой, заполненной гранулами. За узкой противоположной частью клетки тянулись тонкие нити, вероятно, остатки гелеобразного вещества. Клетка перемещалась путем сокращения-вытягивания. Отдельно отметим, что существовали переходные по форме клетки. При цейтраферном исследовании установлена возможность изменения клеток в пределах вышеописанных форм («розетки» и «ракетки»).
Еще одним вариантом распластывания могли быть палочковидные клетки длиной 100—120 мкм и относительно равномерной шириной 5—10 мкм по всей протяженности клетки с закругленными концами (рис. 5В). Овальное несколько вытянутое ядро с ядрышками располагалось в центре. Его поперечный размер почти полностью соответствовал ширине клетки. По обеим сторонам от ядра присутствовала эндоплазма, эктоплазма располагалась по периферии клетки. В отдельных местах визуализировалось гелеобразное вещество, выделенное клеткой локально. В этой группе клеток можно идентифицировать веретенообразные клетки, у которых толщина центральной части достигала 15—20 мкм.
Рис. 3. Прикрепившаяся уплощенная клетка. Динамика изменения формы, движения и выделения гелеобразной субстанции. Световая микроскопия, дифференциальный интерференционный контраст по Номарскому. Ув.: х800
Рис. 4. Прикрепившиеся крупные распластанные многоядерные клетки, вероятно, остеокласты:
1 - ядра с ядрышками; 2 - эндоплазма; 3 - эктоплазма.
Световая микроскопия, модулирующий контрастХоффмана. Ув.: х800
Рис. 5. Уплощенные и распластанные адгезивные клетки костного мозга in vitro: А - клетки в форме «розеток»; Б - клетки в форме «ракеток»; В - палочковидные клетки; Г - древовидные (дендритоподобные) клетки; 1 - ядро с ядрышками; 2 - эктоплазма; 3 - эндоплазма; 4 - актиновые нити цитоскелета; 5 - изменяющиеся отростки; 6 - гелеобразная субстанция; 7 - клетка-сателлит. Световая микроскопия, дифференциальный интерференционный контраст по Номарскому. Ув.: х800
Вышеописанные группы клеток составляли большинство из общей фракции адгезивных клеток. При длительном наблюдении с помощью цейтраферной съемки было установлено, что размеры клеток «розеток», «ракеток» и их промежуточных форм постепенно увеличивались со временем культивирования (2—3 нед.), вероятно, за счет уплощения и некоторого роста. Однако деление этих клеток выявлено не было.
Часть клеток имели узкое небольшое тело и толстые отростки, которые постоянно меняли свою длину и направленность (рис. 5Г). Вероятно, эти клетки представляли собой дендритные (древовидные) анти-ген-презентирующие клетки костномозгового происхождения. Эта группа клеток проявляла наибольшую активность в движениях и изменении формы. Деление данной популяции также не наблюдалось.
Среди прикрепленных клеток существовала еще одна очень малочисленная группа, полностью распластывающаяся через 12—24 ч после первичного посева (рис. 6). Распластанные клетки имели полигональную форму и длину 110—140 мкм. В наиболее широкой (20—30 мкм) центральной части клетки располагалось овальное вытянутое ядро (8—10 мкм) с ядрышками и эндоплазма. В более узкой (10— 15 мкм) периферической части находилась эктоплазма с органеллами и включениями, которые совершали колебательные движения, а также перемещались из эндоплазмы в эктоплазму. Отчетливо визуализировался цитоскелет клеток в виде тонких нитей. Количество распластавшихся клеток последней группы после 24 ч не увеличивалось за счет остальных прикрепившихся клеток. Именно в этой группе клеток начиналось деление.
Все процессы прикрепления, уплощения, распластывания у разных клеток происходили не одновременно в связи с тем, что в культуре такие клетки находились на разных стадиях своего жизненного цикла.
Форма, приобретенная клетками после взвешенного состояния, в определенной степени подобна той, которую имели клетки, находясь в экстрацел-люлярном матриксе костного мозга, контактируя с волокнистыми элементами, интегративно-буфер-ной метаболической средой и другими клетками непосредственно или обмениваясь сигналами.
Рис. 6. Адгезивная распластанная фибробластоподобная клетка in vitro: 1 - ядро с ядрышками; 2 - эктоплазма; 3 - эндоплазма. СМ-микрофото. Световая микроскопия, дифференциальный интерференционный контраст по Номарскому. Ув.: х800
Отсутствие контактного торможения, стабилизирующего действия окружающей среды и естественного тканевого микроокружения, наличие полноценной питательной среды и потенциальных возможностей к пролиферации являются благоприятными условиями для начала деления. Однако только клетки последней малочисленной группы проявляли способность к делению.
Пролиферация распластавшихся клеток последней группы начиналась через 36—72 ч после посева и имела ряд особенностей. Первая заключалась том, что деления как материнских, так и дочерних клеток было асинхронным, причем разница между последующими делениями дочерних клеток могла составлять несколько часов. Второй особенностью являлась структурная динамика делящихся клеток. В отдельных случаях одна из дочерних (впервые поделившихся) клеток могла возвращаться к нерас-пластанной овальной форме и на длительное время (или полностью) прекращать заметные перемещения (и деление). При этом, другая дочерняя клетка, полностью распластываясь, могла относительно далеко мигрировать от своей соседней дочерней клетки и продолжать в последующем делиться также асинхронно. В ряде случаев дочерние клетки оставались в непосредственной близости, контактируя друг с другом. Механизм такого поведения делящихся клеток пока неизвестен.
Детальная структурная динамика процесса деления представлена на последовательных кадрах цей-траферной фотосъемки (рис. 7). Начинался этот процесс с сокращения клеток сначала по ширине вдоль продольной оси клетки. Их периферические части на месте распластанной эктоплазмы сжимались и принимали вид нескольких толстых длинных отростков от 2 до 5 (чаще двух разнополюсных) толщиной 5—10 мкм и длиной 20—50 мкм. Если у клетки остались два разнополюсных отростка, она приобретала веретеновидную форму. Перпендикулярно от отростков отходили тонкие нити в виде лучей. Далее отростки сокращались по длине, приближаясь к центральной части клетки. Их сокращение могло быть неравномерным. Один отросток (или отростки) сокращались быстрее, другие медленнее. За сокращенными частями клетки оставались вышеуказанные тонкие нити в виде лучей. Центральная часть клетки также меняла свою форму: становилась менее распластанной, но более выпуклой и округлой. По бокам клетки также оставались лучистые нити. Клетка более выраженно возвышалась над поверхностью дна флакона. Отростки (чаще оставались два разнополюсных) становились узкими (2—3 мкм) и более короткими (10—30 мкм). Следует отметить, что отростки полностью не втягивались в клетку и не откреплялись от дна флакона, удерживая клетку, подобно «якорным тросам», при этом сама клетка могла полностью оторваться от дна флакона. Вышеуказанные изменения клеток соответствовали профазе митоза. Далее клетка переходила в следующую стадию — метафазу. Она приобретала округло-овальную или шаровидную форму размером 20x30 мкм, значительно возвышаясь над дном флакона, что проявлялось в разности фокусировки самой клетки и её отростков, прикрепленных ко дну флакона. Ядро клетки в таком состоянии не определялось. Видны были только гранулы-органеллы в цитоплазме и хромо-
сомы на экваторе клетки, образующие метафазную пластинку или материнскую звезду. Далее клетка приобретала овально-вытянутую форму и происходило расхождение хромосом по двум частям клетки (стадия — анафаза). Сразу после этого по ее экватору появлялась перетяжка деления. По мере углубления перетяжки клетка принимала форму гантели. Таким образом, клетка переходила в телофазу, существенным моментом которой являлась цитото-мия. На образующихся двух дочерних клетках появлялись многочисленные локальные выбухания ци-топлазматической мембраны, размером от 1 мкм, которые увеличивались по мере углубления перетяжки деления до 5 мкм. Выбухания втягивались в одной части клетки и вновь появлялись в другой, в них могла перемещаться цитоплазма с гранула-ми-органеллами. В период появления выбуханий будущие дочерние клетки принимали неправильную причудливую форму. В процессе деления между будущими самостоятельными клетками оставалась тонкая перемычка, или клеточный мостик. Такое состояние определено как незавершенная цитотомия, так как через перемычку сохранялось сообщение между цитоплазмами дочерних клеток [9]. Далее выбухания уменьшались в размерах и количестве. Дочерние клетки приобретали более округлую форму, появлялись контуры ядер. Клетки сближались и плотно контактировали между собой, после чего происходило медленное удлинение клеток и их расхождение. В сохраненные отростки или отросток, с помощью которых клетки прикреплялись ко дну флакона, перемещалась часть цитоплазмы. Если у одной из дочерних клеток отросток полностью втянулся в клетку при сокращении, то у нее на месте бывшего отростка, т.е. в апикальной полюсной части начинала выпячиваться цитоплазматическая мембрана и в это выпячивание перемещалась часть цитоплазмы. Перед этим клетка выделяла гелеобра-ный секрет, по которому и распространялась выпячивающаяся часть клетки. Воспроизводился тот же механизм, что и при передвижении, уплощении и распластывании клеток. Сначала выделялось ге-леобразное вещество, потом на него наслаивалось выбухание клеточной оболочки, в нее перемещалась цитоплазма и т.д. Вытягивание дочерних клеток продолжалось, и они начинали перемещаться в противоположных направлениях. При этом происходил разрыв сохранявшегося очень тонкого клеточного мостика, т.е. завершение цитотомии. Клетки расходились. Они могли распластываться или принимать вытянутую веретеновидную форму. В последнем варианте на поверхности веретеновидных клеток по всей длине появлялись и быстро исчезали локальные выбухания. Независимо от того, какая из дочерних клеток раньше начала распластывание, в итоге обе клетки распластывались и продолжали делиться, хотя и неодновременно (см. рис. 7). Первой в следующее деление, как правило, входила дочерняя клетка, которая распласталась раньше. Деление второй клетки могло задержаться. Распластанные клетки принимали различные формы — вытянутую, многоугольную, треугольную, звездчатую. При этом их форма могла постоянно меняться. Соседние клетки своими отростками контактировали друг с другом («изучали» или «обследовали») или частично наползали друг на друга, образуя клеточную ассоциацию, похожую на синцитий (рис. 8А).
Межклеточные пространства были сопоставимы с размерами клеток. Постепенное увеличение количества клеток за счет пролиферации приводило к уменьшению этих пространств, и в дальнейшем клетки располагались более плотно, порой сдавливая друг друга. При этом ограничивалось перемещение, менялась форма и характер распластывания как появляющихся в ходе деления, так и ранее образовавшихся клеток. Таким образом, формировались моноклональные или поликлональные клеточные колонии. Этот процесс имел на дне флакона многоочаговый характер и зависел от количества прикрепившихся клеток с пролиферативными потенциями. После слияния колоний и заполнения всех свободных пространств вновь образованными клетками возникало контактное торможение, замедляющее клеточную пролиферацию. Таким образом, формировался сплошной клеточный монослой, в котором большая часть клеток приобретала вытянутую форму и располагалась комплексами, в которых они имели параллельную или веерную (расходящуюся) ориентацию (рис. 8Б, В). Возможные варианты форм клеток, образовавшихся в результате пролиферации в монослое, подробно описаны [10]. В клетках четко видны гранулярные структуры, а также нитевидные, образующие цитоскелет. Преимущественное направление ориентации клеток в соседних комплексах отличалось. Встречались места, в которых клетки имели многоугольную (не вытянутую) форму. Скопления таких клеток были окружены комплексами вытянутых клеток с преимущественной ориента-
цией. Следует отметить, что полностью деление клеток не останавливалось. По краям флакона клетки наползали на стенки или друг на друга.
Среди вышеуказанных клеток встречаются мелкие, или микроклетки, веретеновидной формы, размеры которых составляли по длинной оси 15— 20 мкм и поперечной — 3—5 мкм. Деление таких клеток не наблюдалось.
Формирование сплошного монослоя могло происходить несколькими путями. При низкой плотности посева (2—4х104 на 1 см2) распластанные и имеющие потенции к делению клетки располагались относительно далеко друг от друга. При делении каждая из них могла образовывать колонии-клоны, которые достигали достаточно больших размеров и, сливаясь друг с другом, формировали сплошной монослой. Рост колоний шел неравномерно, что связано с неодновременным (несинхронным) началом деления прикрепившихся клеток и скоростью их последующей пролиферации. Колонии также отличались друг от друга размером и плотностью расположения клеток, их образующих (плотные и рыхлые). Некоторые колонии могли быть многослойными. Формирование сплошного монослоя было достаточно долгим.
При средней плотности посева (8—20х104 на 1 см2) и наличии большего количества прикрепившихся клеток, потенциально способных к делению и расположенных недалеко друг от друга, колонии-клоны состояли из небольшого количество клеток и, в этой связи, имели небольшие размеры. Они сливались, образуя поликлональные колонии, состоящие
из нескольких небольших клонов исходных (посеянных) клеток. Монослой при этом образовывался быстрее.
При плотном посеве (2—4х105 на 1 см2) делящиеся клетки распределялись достаточно равномерно и располагались близко друг от друга, поэтому формирование четко отграниченных колоний не происходило. Сплошной монослой образовывался быстро.
При очень плотном посеве (8—16х105 на 1 см2) прикрепившиеся клетки образуют агрегаты. Деление клеток, имеющих пролиферативные потенции, замедленно за счет ограничения жизненного пространства. Рассев такой плотно посеянной культуры дает возможность соответствующим клеткам проявить свои пролиферативные возможности и образовывать сплошной монослой.
При любой плотности посева преобладающими (около 90%) среди всех прикрепившихся клеток являются неделящиеся клетки.
После формирования сплошного монослоя в клетках начинали накапливаться вакуоли более крупные по размеру, чем гранулы-органеллы. Очевидно, это имеет определенную связь с повышением в культуральной жидкости концентрации коллагена и гликоконъюгатов. При дальнейшем культивировании возможна гибель части клеток. Несмотря на некоторое увеличение размеров прикрепившихся, но не делящихся клеток, их размеры значительно меньше
размеров распластывающихся и затем делящихся клеток.
При рассеве или пересеве (пассировании) выращенной клеточной культуры пролиферативный процесс будет продолжаться. При этом количество неделя-щихся клеток будет относительно уменьшаться.
Заключение
Таким образом, показана гетероморфность адгезивных клеток костного мозга человека в первичной культуре и в процессе культивирования. При исследовании их структурной динамики обнаружено, что большинство прикрепленных клеток не пролифери-ровали, хотя их морфология изменялась в процессе наблюдения. Деление клеток проявлялось у небольшой клеточной популяции костного мозга. Эти клетки имели морфологические особенности, по которым их можно опознать с первых моментов адгезии к подложке. Представлена детальная динамика этапов их клеточного деления. В процессе пролиферации эта небольшая клеточная популяция, закономерно, становилась преобладающей при формировании сплошного монослоя, хотя неделящиеся адгезивные клетки сохранялись. Дальнейшая структурная динамика адгезивных пролиферирующих и неделящихся клеток костного мозга в последующих пассажах будет представлена во второй части работы, вместе с обсуждением исследования в целом.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Friedenstein A.J. Precursor cells of mechanocytes. Int. Rev. Cytol. 1976; 47: 327-59.
2. Friedenstein A.J., Ivanov-Smolenski A.A., Chailakhyan R.K. et al. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochimeras and heterotopic transplants. Exp. Hematol. 1978; 6: 440-4.
3. Latsinik N.V., Gorskaya U.F., Grosheva A.G. et al. Content of stromal colony-forming cells tCFUf) in mouse bone marrow and the clonal nature of fibroblast colonies formed by them. Sovjet. J. Dev. Biol. 1986; 17: 22-9.
4. Osepjan I.A., Chailakhjan R.K., Garibjan E.S. et al. Treatment of nonunions, pseudoarthroses, and long bone defects by transplantation of autologous bone marrow fibroblasts grown in vitro and embedded into a spongeous bone matrix. Orthop. Traumatol. 1987; 9: 59-61.
5. Yoshikawa T., Ohgushi H., Tamai S. Immediate bone forming capability of prefabricated osteogenic hydroxyapatite. I. Biomed Mater. Res. 1996; 32: 481-92.
6. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res. 1991; 9(5): 641-50.
7. Krebsbach P.H., Kuznetsov S.A., Robey B.P. et al. Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999; 10(2): 165-81.
8. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7.
9. Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Старостин В.И. Мезенхим-ные стволовые клетки: источники, фенотип и потенции к диффе-ренцировке. Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2006; 6 (1): 6-25.
10. Ratajczak M.Z., Zuba-Surma E.K., Wysoczynski M. et al. Very small embryonic-like stem cells: characterization, developmental origin, and biological significance. Exp. Hematol. 2008; 36(6): 742-51.
11. Боровая Т.Г., Данилов Р.К. Основы учения о клетке - структурно-функциональной единице тканей. В: Данилов Р.К., ред. Руководство по гистологии. Том.1. Гл.1. Изд. С-П.: СпецЛит; 2011. С. 23-81.
12. Sekiya I., Larson B.L., Smith J.R. et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells 2002; 20(6): 530-41.
Поступила 27.11.12
