CC BY
118
Я • 7universum.com
ikUNIVERSUM:
/УУ\ МЕДИЦИНА И ФАРМАКОЛОГИЯ
ОСОБЕННОСТИ КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ ГИПОТЕРМИИ
Пошелок Денис Михайлович
младший научный сотрудник лаборатории экспериментального моделирования, ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов
им. проф. М.И. Ситенко НАМН Украины»,
Украина, г. Харьков E-mail: denposhelok@smail.com
Малышкина Светлана Владимировна
канд. биол. наук,
зав. лаборатории экспериментального моделирования, ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И. Ситенко НАМН Украины»,
Украина, г. Харьков E-mail: s_malysh@Mkr.net
Никольченко Ольга Анатольевна
канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментального моделирования, ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И Ситенко НАМН Украины»,
Украина, г. Харьков E-mail: nik_olsa@Mkr.net
Пошелок Д.М., Малышкина С.В., Никольченко О.А. Особенности колониеобразования мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс после гипотермии // Universum: Медицина и фармакология : электрон. научн. журн. 2014. № 10 (11) .
URL: http://7universum.com/ru/med/archive/item/1647
FEATURES OF THE COLONY FORMATION BY BONE MARROW STROMAL CELLS OF RATS AFTER HYPOTHERMIA
Poshelok Denis
Junior Research scientist of the Laboratory of Experimental Modeling,
SI “Sitenko Institute of Spine and Joints Pathology of National Ukraine Academy of Medical Sciences ”,
Ukraine, Kharkov
Malyshkina Svetlana
candidate of Biology Sciences, Head of the Laboratory of Experimental Modeling, SI “Sitenko Institute of Spine and Joints Pathology of National Ukraine Academy of Medical Sciences ”,
Ukraine, Kharkov
Nikolchenko Olga
candidate of Biology Sciences, Junior Researcher of the Laboratory of Experimental Modeling, SI “Sitenko Institute of Spine and Joints Pathology
of National Ukraine Academy of Medical Sciences”,
Ukraine, Kharkov
АННОТАЦИЯ
В культуре мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга (КМ), выделенного из костей у молодых и старых крыс на 7 и 28 сутки после действия гипотермии, изучена способность клеток образовывать колонии. Показано, что гипотермия угнетает пролиферативную активность МСК КМ. В культивированных МСК КМ опытных животных на 7 сутки выявлено достоверное уменьшение количества колоний и клеток в них. Более выражены изменения в культуре МСК КМ старых животных. На 28 сутки после гипотермии различия между опытными и контрольными культурами были незначительными.
ABSTRACT
The ability of cells to form colonies in the culture of bone marrow stromal cells (BMSC), isolated from the bone of young and old rats at 7th and 28th days after the hypothermia was studied. It was shown, that hypothermia inhibits the proliferation of BMSC. The number of colonies and cells in experimental cultures
of BMSC at 7th day were significant decreased. The changes were statistically increased in the culture of cells of old animals. The differences between the experimental and control cultures on 28th day after hypothermia weren’t observed.
Ключевые слова: культура клеток, костный мозг, клеточные колонии, гипотермия, крысы.
Keywords: cells culture, bone marrow, colony of cells, hypothermia, rats.
Введение. Костная ткань является физиологически динамичной и чувствительной к негативным воздействиям (травма, различные вредные факторы окружающей среды, в том числе и холодовое воздействие, которое может привести к гипотермии), поскольку она тесно связана с другими системами организма [13; 17; 21]. Несовершенство гипотермических методов в лечении, а также чрезмерное холодовое воздействие в естественных условиях могут привести к морфологическим изменениям не только в отдельных органах, но и организме в целом. В литературе широко представлены исследования по влиянию гипотермии на особенности вентиляции легких, функцию головного мозга, периферические нервы, иммунную систему, сердечную деятельность и кровообращение [1; 8; 15; 16; 19]. Имеются работы и по изучению влияния гипотермии на ткани опорно-двигательной системы. Так, в эксперименте на крысах установлено, что легкая гипотермия вызывает выраженные деструктивные изменения как в клетках, так и матриксе костной ткани, которые связаны с пикнозом остеоцитов, появлением пустых и расширенных лакун остеоцитов, деструкцией кровеносных сосудов и их запустением, повышением на костных трабекулах количества полостей резорбции, заполненных остеобластами [6; 12]. Выявлены ультраструктурные изменения в клетках кости. Смоделированная гипотермия (снижение температуры тела крыс на 2—4оС) приводит к выраженным структурным изменениям в клетках костного мозга (КМ) [11]. Костный мозг содержит мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которые могут
дифференцироваться в остеогенном направлении, и поэтому их количество и структурно-функциональное состояние важно для ремоделирования и репаративной регенерации кости [2; 4].
Цель исследования — оценить особенности колониеобразования мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс разного возраста после холодового воздействия, вызывающего гипотермию.
Материал и методы. Использовали особенности МСК КМ образовывать в процессе культивирования колонии, количество которых и размеры (количество клеток в колонии) зависят от структурно-метаболического состояния клеток, а также их количества в КМ. Исследования in vitro выполнены в культуре клеток КМ крыс, которых содержали в течение 5 суток в холодовой камере (-20 °С) по 5 часов ежедневно, что сопровождалось снижением температуры тела животных до 36,3 °С молодых крыс (6-месячного возраста) и до 32,2 °С — у старых животных (24-месячного возраста). В норме у крыс температура тела составляет 38,5—39,5 °С.
Морфологически МСК КМ — это фибробластоподобные веретеновидные клетки, находящиеся в фазе G0 клеточного цикла и составляющие митотический резерв соединительной ткани, мобилизируемый для физиологической и репаративной регенерации. На 7 и 28 сутки после 5-суточного холодового воздействия в условиях стерильности отделяли эпифизы бедренной и большеберцовой костей крыс (контрольные и опытные) и с помощью шприца раствором Хенкса вымывали КМ из костномозгового канала. Клетки КМ осаждали путем центрифугирования (1000 об./мин., 10 мин.), затем осадок отмывали в растворе Хенкса с повторным центрифугированием и ресуспендированием в среде ДМЕМ (Sigma) с добавлением 20 % сыворотки крови эмбрионов телят (Sigma) до получения клеточной суспензии. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева [10]. Высевали клетки в пластиковые флаконы для культивирования адгезивных культур (Falcon) из расчета 1,5* 106
Л
клеток на 1 см и культивировали в одинаковых условиях (температура 37 °С, газовая смесь с 5 % содержанием СО2, влажность 95 %) с добавлением
в питательную среду ДМЕМ (Sigma) культур 2 мМ L-глутамина, 20 % сыворотки крови эмбрионов телят, а также 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Через 24 часа культивирования среду с неприкрепившимися клетками сливали и промывали культуральный флакон трижды раствором Хенкса. К флакону с прикрепившимися клетками добавляли свежеприготовленную среду для культивирования и продолжали культивировать до 12 суток. Питательную среду меняли каждые последующие 3 суток. В процессе культивирования клетки стромы костного мозга образуют колонии, число и размеры которых зависят от количества и исходного состояния клеток. На 12 сутки питательную среду сливали, клетки промывали фосфатным буфером, фиксировали фиксатором Май-Г рюнвальда и окрашивали азур-эозином по Романовскому. Культуры клеток исследовали в микроскопе OLIMPUS (Austria).
В культуре клеток определяли такие показатели:
1. количество клеточных колоний в препарате. Анализировали пять препаратов с культурой клеток. Подсчитывали крупные колонии (не менее 15—20 клеток в колонии);
л
2. площадь колоний (мкм );
3. состояние клеток в колониях.
Результаты исследований.
Исследование колониеобразующей способности МСК КМ молодых крыс.
7 суток после гипотермии. Как в контрольных, так и в опытных культурах МСК КМ наблюдались клеточные колонии, которые были представлены различным количеством клеток. Между колониями располагались одиночные фибробластоподобные клетки вытянутой формы с длинными отростками. Плотность клеток в колониях контрольной культуры была большой, часто клетки наползали друг на друга, так что границы отдельных клеток не всегда были четко различимы (рис. 1 А), т. е. имело место формирование многослойных колоний.
В опытных культурах клетки в колониях располагались рыхло, местами в один слой, формируя однослойные колонии (рис. 1 Б).
Б
Рисунок 1. Клеточные колонии МСК костного мозга молодых крыс на 7 сутки после холодового воздействия:
А) Контрольная культура, ув. 10;
Б) Опытная культура, ув. 200. Окраска по Романовскому.
Морфологический анализ колоний МСК КМ показал, что в обоих случаях клетки имели вытянутую — палочковидную, веретеновидную, иногда треугольную форму и несколько цитоплазматических отростков, с помощью которых клетки контактировали между собой (рис. 2). Клетки характеризовались гомогенной цитоплазмой и крупным ядром с плотными ядрышками. В клетках опытных культур, особенно на периферии колоний, выявлялись деструктивные изменения — вакуолизация цитоплазмы, разрывы мембран и пикноз ядра (рис. 2 Б). Полученные результаты свидетельствуют о негативном влиянии гипотермии на состояние клеток КМ. В литературе имеются данные о том, что неблагоприятные факторы могут вызывать нарушения структурной организации МСК костного мозга. Так, было установлено, что в МСК костного мозга крыс, которые в течение 28 суток пребывали в условиях гиподинамии, обнаруживались выраженные ультраструктурные изменения — конденсация хроматина ядра в одних
участках и деконденсация в других, деструкция мембран, выход хроматиновых фибрилл в цитоплазму и др. [14].
В контрольных культурах на поверхности культурального флакона насчитывалось 14,2±1,3 колоний, а в опыте — 9,3±0,8, что было на 34,5 % (p<0,01) меньше. Площади колоний отличались количеством клеток и размерами. Так, в контрольных культурах площадь колоний была равна 3,79±0,29 мм2, а в опытных — 2,27±0,25 мм2, что было на 40,1 % меньше, чем в контрольных культурах.
А Б
Рисунок 2. Культуры МСК костного мозга молодых крыс:
А) Контрольная культура;
Б) Опытная культура. Клетки с деструктивными изменениями.
Окраска по Романовскому. Ув. 400.
Из литературы известно, что действие неблагоприятных факторов на организм оказывает негативное воздействие на пролиферативную активность клеток КМ, а также на их способность образовывать колонии. Так, установлено, что при культивировании клеток КМ крыс, после действия на организм экспериментальной гиподинамии в течение 28 суток количество клеточных колоний и фибробластов в колониях было достоверно ниже, чем у контрольных животных [13].
28 сутки после гипотермии. Отмечено повышение на 25 % (p<0,05) количества клеточных колоний в опытной культуре по сравнению
с показателями, установленными на 7 сутки после гипотермии. Количество клеточных колоний в опытных культурах (12,4±1,02) не отличалось от числа колоний в контрольных культурах (13,9±1,2), а также от показателей контрольной культуры на 7 сутки. Зафиксировано и повышение количества клеток в колониях, что отразилось на показателях их площади (рис. 3). Так, площадь колоний в опытных культурах составляла 3,38±0,32 мм2, что было выше на 32,8 %, чем в первом опыте, и достоверно не отличалось от показателей в контрольных культурах, где площадь колоний составила
Л
3,84±0,39 мм . Обращало внимание и снижение числа клеток в опытных культурах с деструктивными изменениями.
А Б
Рисунок 3. Крупные клеточные колонии МСК костного мозга молодых крыс на 28 сутки после холодового воздействия: А) Контрольная культура;
Б) Опытная культура. Окраска по Романовскому. Ув. 200.
Исследование колониеобразующей способности МСК КМ старых крыс.
На 7 сутки после холодового воздействия в контрольных культурах выявлены немногочисленные (7,92±0,72) небольшие по размерам, чаще однослойные, клеточные колонии (рис. 4 А). Количество колоний было в 1,8 раза меньшим, чем в контрольных культурах молодых крыс.
Б
Рисунок 4. Колонии МСК костного мозга старых крыс на 7 сутки после холодового воздействия: А) Контрольная культура;
Б) Опытная культура. Окраска по Романовскому. Ув. 200.
По территории культурального флакона за границами колоний обнаруживали многочисленные фибробластоподобые клетки, расположенные одиночно. У значительной части клеток выявлены деструктивные изменения — вакуолизация цитоплазмы и пикноз ядра. Площадь колоний составляла
Л
1,76±0,13 мм , что было в 2,15 раза меньше, чем у контрольных 6-месячных крыс, и в 1,3 раза ниже, чем в культуре опытных молодых животных.
В опытных культурах МСК КМ старых крыс преобладали одиночные клетки, которые не формировали колоний (рис. 4 Б). Встречались лишь небольшие кластеры клеток. Количество клеток в них было 10,85±2,93. Полученные данные свидетельствуют о том, что на активность формирования клеточных колоний в культуре МСК костного мозга влияет как возраст животных, так и холодовое воздействие. Наши результаты согласуются с данными литературы о том, что с возрастом количество МСК у человека и у животных уменьшается [3; 18]. Наибольшее количество стромальных колониеобразующих клеток в костном мозге крыс наблюдается в 5-месячном возрасте [3]. С возрастом снижается и колониеобразующая способность МСК КМ [20]. Показатели эффективности клонирования и числа стромальных колониеобразующих клеток значительно уменьшались к 24 месяцам [9]. Снижение пролиферативной активности и способности к дифференцировке
в остеогенном направлении МСК костного мозга in vitro было установлено у больных остеопорозом [5; 7].
28 сутки после гипотермии. В контрольных культурах МСК КМ наблюдали небольшие клеточные колонии, площадь которых составляла (2,47±0,21) мм2, что было на 35,7 % меньше от показателей контрольных культур молодых животных. Количество клеточных колоний (10,2±1,1) также было на 26,6 % меньше, чем в контроле молодых животных.
В опытных культурах количество клеточных колоний (8,25±0,86) не отличалось от показателей в контроле старых животных на этот срок, но было на 30,6 % ниже, чем у молодых животных. Также была меньшей
Л
в 1,7 раза и площадь (1,88±0,15 мм ) образовавшихся колоний по сравнению с культурами молодых животных и на 23,8 % ниже, чем в контроле старых животных.
Необходимо обратить внимание на то, что если через 7 суток холодового воздействия в культурах МСК КМ старых животных мы не обнаруживали клеточных колоний, то через 28 суток такие колонии присутствовали, что указывает на восстановительные процессы, происходящие в костном мозге крыс.
Заключение. Г ипотермия, вызванная пребыванием крыс в течение 5 суток в холодовой камере (-20 °С) по 5 часов ежедневно, негативно влияет на состояние МСК КМ, угнетая их пролиферативную активность и способность образовывать клеточные колонии. В культивированных МСК КМ опытных животных на 7 сутки наблюдаются деструктивные изменения и уменьшение по сравнению с контролем количества колоний и клеток в них. По истечению 28 суток после гипотермии различия между опытными и контрольными культурами были менее значимыми как у молодых, так и у старых животных по сравнению с показателями культур на 7 сутки. Это свидетельствует о восстановительных процессах, протекающих в КМ, однако у старых животных они выражены в меньшей степени.
Список литературы:
1. Бабийчук В.Г. Количественная оценка антиген-специфических клеток в крови человека после ритмических холодовых воздействий // Проблемы криобиологии. — 2009. — Т. 19, № 2. — С. 143—153.
2. Гололобов В.Г., Деев Р.В. Стволовые стромальные клетки и остеобластический клеточный дифферон // Морфология. — 2003. — Т. 123, № 1. — С. 9—19.
3. Горская Ю.Ф., Лациник Н.В., Шуклина Е.Ю. и др. Возрастные изменения в популяции стромальных остеогенных клеток-предшественников // Российский иммунологический журнал. — 2000. — Т. 5, № 2. — С. 149—155.
4. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Гололобов В.Г. и др. Влияние трансплантированной культуры остеогенных клеток костного мозга на репаративный остеогистогенез в области дефекта теменных костей // Цитология. — 2008. — Т. 50, № 4. — С. 293—301.
5. Ильина В.К., Прохорова Е.В. Клеточно-генетические особенности стромальных клеток костного мозга при различных формах остеопороза / 3-й симп. по остеопорозу: тезисы докладов. — СПб., 2000. — С. 65.
6. Киреев А.А. Регенерация костной ткани при холодовой травме в условиях лечения изотиорбамином: автореф. дис. ... канд. мед. наук: спец. 14.00.22. — Якутск, 2006. — 21 с.
7. Коваленко В.Н., Лысенко И.В., Панченко Л.М. Культура стволовых стромальных клеток костного мозга человека для изучения прямого влияния фармакологических препаратов при остеоартрозе // Украинский ревматологический журнал. — 2006. — Т. 25, № 3. — С. 45—48.
8. Колшко Я.О. Стан проводникового апарату та мжроциркуляторного русла сщничного нерва щура на сьому добу тсля ди загально! глибоко! гшотермп // Украинский морфологический альманах. — 2010. — Т. 8, № 2. — С. 91—94.
9. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю. и др. Возрастные изменения количества стромальных клеток-предшественников в костном мозге животных // Морфология. — 2004. — Т. 126, № 6. — С. 46—49.
10. Методические рекомендации по получению, культивированию и использованию в научных и производственных ветеринарных лабораториях первичных, перевиваемых и диплоидных культур клеток живого происхождения. — М., 1978. — 30 с.
11. Пошелок Д.М., Дедух Н.В., Малишкина С.В. Влияние гипотермии на ремоделирование трабекулярной кости крыс / Сборник статей по материалам XXXIII международной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальные вопросы». — Новосибирск, 2014. — Т. 7, № 33. — С. 70—85.
12. Пошелок Д.М., Малышкина С.В. Структурная организация компактной кости после общей гипотермии // Таврический медико-биологический вестник. — 2013. — Т. 16, № 1. — С. 197—201.
13. Родионова Н.В. Цитолопчш мехашзми перебудов у юстках при гшокшезп та мшрогравггацп. — Кшв: ДНВП «Видавництво «Наукова думка» НАН Украши», 2006. — 239 с.
14. Шалимов В.А. Некоторые особенности межклеточных цитоплазмоцитоплазматических, ядерно-цитоплазматических и ядерно-ядерных соединений в костном мозге контрольных крыс, подвергающихся воздействию гиподинамии. — Киев: Знание Украины, 2004. — 28 с.
15. Baylor K., Stecker M.M. Peripheral nerve at extreme low temperatures 2: pharmacologic modulation of temperature effects // Cryobiology. — 2009. — Vol. 59, № 1. — P. 12—18.
16. Bennet L., Roelfsema V., George S. et al. The effect of cerebral hypothermia on white and grey matter injury induced by severe hypoxia in preterm fetal sheep // J. Physiol. — 2007. — Vol. 578, Pt. 2. — P. 491—506.
17. Вuckwaher J., Glimcher M., Cooper R. et al. Bone biology// J. Bone Jоint Surg. 1995. — V. 77-A, № 8. — Р. 1256—1275.
18. D'Ippolito G., Schiller P.C., Ricordi C. et al. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow // J. Bone Miner. Res. — 1999. — Vol. 14, № 7. — P. 1115—1122.
19. Duebener L.F., Hagino I., Sakamoto T. et al. Effects of pH management during deep hypothermic bypass on cerebral microcirculation: alpha-stat versus pH-stat // Circulation. — 2002. — Vol. 106, № 12. — Suppl. 1. — P. 103—108.
20. Nishida S., Endo N., Yamagiwa H. et al. Number of osteoprogenitor cells in human bone marrow markedly decreases after skeletal maturation // J. Bone Miner. Metab. — 1999. — Vol. 17, № 3. — P. 171—177.
21. Robling A.G., Castillo A.B., Turner C.H. Biomechanical and molecular regulation of bone remodeling // Annu. Rev. Biomed. Eng. — 2006. — Vol. 8. — P. 455—498.
