CC BY
96
Структура, механические характеристики и остеогенные свойства биокомпозиционного материала на основе субмикрокристаллического титана и микродугового кальций-фосфатного покрытия
Ю.П. Шаркеев, Ю.Р. Колобов, A.B. Карлов1, И.А. Хлусов1,
Е.В. Легостаева, Г.А. Шашкина
Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск, 634021, Россия 1 Центр ортопедии и медицинского материаловедения ТНЦ СО РАМН, Томск, 634029, Россия
Приведены данные по структуре, механическим характеристикам и остеогенным свойствам биокомпозиционного материала на основе субмикрокристаллического титана и микродугового кальций-фосфатного покрытия. Модифицированный микродуговой метод позволил сформировать кальций-фосфатные покрытия со слоистой пористой структурой. Биокомпозиционный материал на основе субмикрокристаллического титана с кальций-фосфатным покрытием по уровню механических свойств соответствует требованиям, предъявляемым к биоимплантатам. Титановые имплантаты с кальций-фосфатными покрытиями с высокой вероятностью способствуют формированию костной ткани в тесте эктопического костеобразования.
Structure, mechanical characteristics and osteogenic properties of a biocomposite on the basis of submicrocrystalline titanium and microarc calcium-phosphate coating
Yu.P. Sharkeev, Yu.R. Kolobov, A.V Karlov1, I.A. Khlusov1, E.V. Legostaeva, and G.A. Shashkina
Institute of Strength Physics and Materials Science SB RAS, Tomsk, 634021, Russia 1 Center for Orthopedy and Medical Materials Science TSC SB RAMS, Tomsk, 634029, Russia
The paper contains the investigation findings on the structure, mechanical characteristics and osteogenic properties of a biocomposite “submicrocrystalline titanium - calcium-phosphate coating”. The optimized microarc method has allowed us to obtain calcium-phosphate coatings with porous and lamellar structure. Properties of the biocomposite “submicrocrystalline titanium - calcium-phosphate coating” correspond to mechanical properties of bioimplants. High probability of bone tissue growth on the surface of calcium-phosphate coatings formed on titanium implants has been revealed by ectopic osteogenesis.
1. Введение
Медицинское материаловедение позволяет решать многие практические вопросы, связанные с разработкой биокомпозиционных материалов для замены поврежденных или отсутствующих участков костной ткани и внедрением их в клиническую практику. Эффективным оказалось использование биокомпозитов на основе технически чистого титана и кальций-фосфатных покрытий, поскольку титан в полной мере соответствует требованиям биологической совместимости, а нанесение кальций-фосфатных покрытий придает имплантату биоактивные свойства.
Для повышения прочностных свойств нелегированного титана недавно было предложено использовать методы интенсивной пластической деформации, такие как равноканальное угловое прессование, всестороннее прессование, ковка и др. [1, 2]. В [3] нами был предложен модифицированный метод всестороннего прессования, который представляет собой многократное одноосное прессование в специальной пресс-форме со сменой оси деформации. Получаемый титан после прессования имеет субмикрокристаллическую структуру со средним размером зерна 200 нм. Для достижения наноструктурного состояния требуется дополнительная прокатка в
© Шаркеев Ю.П., Колобов Ю.Р., Карлов A.B., Хлусов И.А., Легостаева Е.В., Шашкина Г.А., 2005
плоских или в ручьевых валках. Прессование с последующей прокаткой позволяет получить наноструктурный титан с однородной микроструктурой по всему объему и размером зерна менее 100 нм. При этом механические свойства, прежде всего, предел текучести, предел прочности и твердость наноструктурного титана повышаются до свойств высокопрочных титановых сплавов.
Нанесение биоактивных покрытий на поверхность титановых имплантатов позволяет существенно улучшить их биологические свойства. Для этих целей хорошо зарекомендовали себя кальций-фосфатные покрытия. Фосфаты кальция относятся к группе естественных метаболитов кости [4]. В работе [5] были исследованы биокерамические кальций-фосфатные покрытия, нанесенные на поверхность наноструктурного титана мик-родуговым методом. Использование модифицированного электролита на основе ортофосфорной кислоты, гид-роксилапатита и карбоната кальция позволило увеличить содержание кальция в покрытии в 3 раза по сравнению с традиционно используемыми покрытиями. Рентгеноструктурные исследования показали, что введение в состав электролита карбоната кальция обеспечивает синтез трикальцийфосфата, состав которого аналогичен составу минерализующей костной ткани.
В то же время, в зависимости от физико-химических свойств (степень кристалличности и пористости, растворимость, шероховатость поверхности и т.д.) кальций-фосфатные покрытия способны в разной степени поддерживать костеобразование [6, 7]. Материалы для изготовления имплантатов должны быть также совместимы и по биомеханическим параметрам. Прочностные свойства имплантатов должны быть существенно выше таких характеристик костной ткани, в частности, предел прочности имплантата должен быть в 5^10 раз выше предела прочности кости.
В связи с этим, представляет интерес исследование механических характеристик титановых имплантатов с кальций-фосфатными покрытиями и изучение влияния физико-химических характеристик микродуговых покрытий на процесс костеобразования.
2. Методика исследований
В качестве образцов применяли диски из технически чистого титана ВТ1-0 (диаметр — 12 мм, толщина — 1 мм) в субмикрокристаллическом состоянии. Субмик-рокристаллическое состояние было получено методом многократного одноосного прессования в специальной пресс-форме со сменой оси деформации [3]. На поверхность образцов титана были нанесены биоактивные кальций-фосфатные покрытия с помощью микродугового метода в электролите следующего состава: 20 % ортофосфорной кислоты, гидроксилапатита и карбоната кальция [5].
Морфологию поверхности кальций-фосфатных покрытий исследовали методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) на электронном микроскопе SEM 515 (Phillips) с приставкой для микроспектрально-го анализа EDAX. Элементный количественный состав определяли путем анализа характеристических спектров рентгеновского излучения исследуемых покрытий. Фазовый состав покрытия определяли на дифрактометре ДРОН-3 посредством рентгенофазового анализа (РФА) с использованием Со и Cu Ка-излучений.
Испытания на одноосное статическое растяжение были проведены на испытательной машине ИМАШ-2078 при комнатной температуре со скоростью деформации 3 • 10-5 с-1. Испытания на циклическую стойкость были выполнены при знакопостоянном нагружении от нуля при равномерном изгибе плоских образцов по боковой поверхности цилиндрической оправки [8]. Частота циклирования составляла 1.4 Гц. Точность определения остаточной деформации составляла 5 • 10-7.
В биологических исследованиях использовались 12 мышей-самцов линии BALB/c. Шести животным под эфирным наркозом подкожно вводили по одному имплантату с нанесенным в асептических условиях столбиком сингенного костного мозга (средняя площадь мозга 7.5 мм2), взятого из бедренной кости мышей. Для адгезии клеток органную культуру костного мозга на подложке культивировали в течение 45 мин в культуральной среде, содержащей 95 % среды RPMI-1640 (ICN) и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN). При раздельном подкожном введении мышам подложки и фрагментов костного мозга не наблюдается образования тканевых пластинок.
Через 45 суток имплантаты извлекали, фотографировали в отраженном свете с фиксированными параметрами. Проводили количественную морфометрию оптической плотности и площади исходного костного мозга (до имплантации) и тканевых пластинок, выросших на поверхности кальций-фосфатных покрытий, посредством программы PhotoShop 7.0 [9]. Для проведения гистологического анализа применяли стандартные методы световой микроскопии тонких срезов. После декальцинации тканевых пластинок, выросших на имплантатах, осуществляли обычную окраску гематоксилином-эозином серийных парафиновых срезов, выполненных параллельно поверхности дисков.
3. Результаты эксперимента и обсуждение
Типичная структура кальций-фосфатных покрытий, сформированных на поверхностях субмикрокристалли-ческого титана микродуговым методом, а также их основные характеристики представлены соответственно на рис. 1 и в табл. 1. Кальций-фосфатные покрытия обладают ярко выраженным микрорельефом поверхности. Основными элементами структуры кальций-фосфатно-
Рис. 1. РЭМ-изображение поверхности кальций-фосфатного покрытия, сформированного на поверхности субмикрокристаллического титана
го покрытия являются сферолиты и чешуйчато-осколочные элементы, которые формируют слоистую структуру покрытия. Сферолиты имеют внутренние полости, переходящие в глубокие поры сферической формы. Между сферолитами находятся чешуйчато-осколочные элементы (рис. 1). Модификация микродугового метода нанесения биоактивных слоев [5] позволила получить покрытие, рентгеновская дифрактометрия которого показывает наличие трикальцийфосфата.
На рис. 2 приведены кривые растяжения субмикрокристаллического титана в исходном состоянии и с каль-ций-фосфатным покрытием. Видно, что нанесение кальций-фосфатного покрытия практически не ухудшает прочностных характеристик субмикрокристаллического титана. Предел прочности субмикрокристаллического титана с кальций-фосфатным покрытием составил 650 МПа, что на порядок больше такового для костной ткани. Предел прочности для костной ткани в зависимости от типа кости варьирует от 50 до 150 МПа [10]. Первые трещины в кальций-фосфатных покрытиях при испытаниях на растяжение появляются только при деформации 1.5 %, что свидетельствует об удовлетворительной пластичности самих кальций-фосфатных покрытий.
Таблица 1
Характеристика микродуговых кальций-фосфатных покрытий
Толщина покрытия, мкм 30-50
Фазовый состав Ca3(PO4)2, CaTi^PO^, TiP2O7, CaTiO4
Размеры сферолитов, мкм 10-20
Диаметр пор, мкм 3-5
[Ca] (атомные %) 9.4
[P] (атомные %) 13.4
Ca/P 0.70
P1 тканевой пластинки (%) 83
P2 образования кости (%) 80
Площадь тканевой пластинки (% от костного мозга) 123
300 -I—1—|—■—|—1—|—1—
0 5 10 15 20
8, %
Рис. 2. Кривые растяжения субмикрокристаллического титана в исходном состоянии (1) и с кальций-фосфатным покрытием (2)
Испытания на циклическую усталость, проведенные для субмикрокристаллического титана, свидетельствуют о том, что нанесение кальций-фосфатных покрытий повышает сопротивление микропластической деформации (рис. 3). Субмикрокристаллический титан с нанесенным кальций-фосфатным покрытием способен выдерживать 106 циклов при максимальном напряжении 500 МПа, что значительно больше по сравнению с костной тканью, которая выдерживает 106 циклов при максимальном напряжении 35 МПа [10].
Таким образом, субмикрокристаллический титан с кальций-фосфатным покрытием соответствует предъявляемым требованиям к имплантатам по уровню механических свойств. Нанесение кальций-фосфатных покрытий на поверхность субмикрокристаллического титана улучшает его биологические свойства. Однако, как отмечалось выше, успешная интеграция имплантата определяется не только его биосовместимыми свойствами, но и способностью поддерживать костеобразование при введении в организм. Поэтому следующим этапом было исследование влияния физико-химических характеристик микродуговых кальций-фосфатных покрытий на их остеогенные свойства.
0 2 4 6
IgN
Рис. 3. Кривые накопления микропластической деформации при циклическом нагружении для субмикрокристаллического титана в исходном состоянии (1) и с кальций-фосфатным покрытием (2)
Рис. 4. Различные типы биологических тканей, выросших на поверхности кальций-фосфатного покрытия в тесте эктопического костеобразования: 1 — кальций-фосфатная подложка; 2 — костная ткань; 3 — элементы кроветворной и жировой тканей. Окраска гематоксилином-эозином. х 100
Исследование реакции тканей показало, что через 45 суток после подкожной имплантации изучаемых подложек из субмикрокристаллического титана с кальций-фосфатными покрытиями, несущих сингенный костный мозг, не отмечалось признаков воспалительной реакции. Следует отметить высокую биосовместимость имплантатов, вызывающих только слабую инкапсуляцию, что свидетельствует о незначительной реакции подкожной клетчатки на их введение.
Адгезия клеток костного мозга является начальным этапом, определяющим в дальнейшем их кондукцию (продвижение и миграцию) по поверхности, что можно зафиксировать по площади формирующейся тканевой пластинки. Тест эктопического (подкожного) остеогенеза (биореактор in vivo) показал, что кальций-фосфат-ные покрытия способствуют миграции родоначальных клеток и их потомков. Площадь тканевой пластинки увеличивается на 23 % по сравнению с площадью исходного костного мозга (табл. 1).
Однако прилипание и продвижение по поверхности имплантата стромальных клеток (в том числе остеогенных) является необходимым, но недостаточным условием для остеогенеза. Только на поверхности пяти из шести образцов (Р1 = 83 %, табл. 1) с кальций-фосфат-ными покрытиями наблюдалось формирование тканевых пластинок.
Гистологические исследования позволили доказать, что кальций-фосфатные покрытия с высокой вероятностью (P2 = 80 %, табл. 1) способствуют дифференци-ровке стволовых клеток в остеогенном направлении. На окрашенных срезах тканевых пластинок выявляется пластинчатая костная ткань (рис. 4), в лакунах которой могут располагаться элементы кроветворной и жировой тканей.
Таким образом, биологические исследования показали, что микродуговые кальций-фосфатные покрытия активно влияют на остеогенные свойства стволовых клеток.
4. Выводы
1. Использование модифицированного микродуго-вого метода позволяет формировать кальций-фосфат-ные покрытия со слоистой пористой структурой.
2. Биокомпозиционный материал на основе субмикрокристаллического титана с кальций-фосфатным покрытием по уровню механических свойств соответствует требованиям, предъявляемым к имплантатам, и может быть рекомендован для применения в медицинской практике.
3. Субмикрокристаллический титан с кальций-фосфатным покрытием, нанесенным модифицированным методом, с высокой вероятностью способствует формированию костной ткани в тесте эктопического костеобразования, что указывает на высокий уровень остеогенных свойств покрытия.
Авторы выражают благодарность д.ф.-м.н. Кашину О.А., д.ф.-м.н. Дудареву Е.Ф.за помощь при выполнении экспериментов по механическим испытаниям. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (проект № 11.1), РФФИ-БФФИ (грант № 0402-81038 Bel2004a) и РФФИ (грант № 05-03-32617).
Литература
1. Валиев Р.З., Александров И.В. Наноструктурные материалы, полу-
ченные методом интенсивной пластической деформации. - М.: Логос, 2000. - 272 с.
2. Колобов Ю.Р., Валиев Р.З., Грабовецкая Г.П. и др. Зернограничная
диффузия и свойства наноструктурных материалов. - Новосибирск: Наука, 2001. -232 с.
3. Шаркеев Ю.П., Братчиков А.Д., Колобов Ю.Р., Ерошенко А.Ю., Легостаева Е.В. Наноструктурный титан биомедицинского назначения // Физ. мезомех. - 2004. - Т.7. - Спец. выпуск. - С. 107110.
4. Lacefield W. An introduction in bioceramics. - New York: World Scien-
tific Publishing Co. Pte. Ltd, 1996. - 375 р.
5. Шашкина Г.А., Иванов М.Б., Легостаева Е.В., Колобов Ю.Р., Хлу-сов И.А., Поженъко Н.С., Карлов А.В. Биокерамические покрытия с высоким содержанием кальция для медицины // Физ. мезомех.-2004. - Т.7. - Спец. выпуск. - 4.2. - С. 123-126.
6. Асимов М.М., Асимов Р.М., Рубинов А.Н. Спектр действия лазерного излучения на гемоглобин кровеносных сосудов кожи // Журнал прикладной спектроскопии. - 1998. - Т. 65. - № 6. - С. 877880.
7. Klein C., De Groot K., Chen W. et al. Osseous substance formation induced in porous calcium phosphate ceramics in soft tissues // Biomaterials. - 1994. - V. 15. - P. 31-34.
8. Сагымбаев Е.Е., Колобов Ю.Р., Кашин О.А., Бушнев Л.С., Дударев Е.Ф., Карлов А.В. Комплексное исследование структуры и свойств композита субмикрокристаллический титан - биопокрытие // Труды Второй Международной научно-технической конференции ЭМФ 2001. - Барнаул: Алтайский государственный университет, 2001. - C. 197-204.
9. Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц., Зайцев К.В., Егорова А.Б., Шахова С.С., Загребин Л.В., Волгушев С.А. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей. - Томск: STT, 2004. - 386 с.
10. Карлов А.В., Шахов В.П. Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики. - Томск: STT, 2001.- 478 с.
