CC BY
29
Статья поступила в редакцию 16. 05. 2012 г.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ IN VITRO ОСТЕОГЕННЫХ СВОЙСТВ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫХ ПОКРЫТИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ФАЗОВЫМ СОСТАВОМ
EXPERIMENTAL IN VITRO VALIDATION OF OSTEOGENIC PROPERTIES OF CALCIUM-PHOSPHATE COATINGS WITH DIVERSE PHASE COMPOSITION
Попов В.П. Хлусов И.А. Шаркеев Ю.П. Легостаева Е.В. Гнеденков С.В.
Сибирский государственный медицинский университет, Научно-образовательный центр «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при Томском политехническом университете, Сибирском государственном медицинском университете и Институте физики прочности и материаловедения СО РАН,
Popov V.P. Khlusov I.A. Sharkeev Y.P. Legostaeva E.V. Gnedenkov S.V.
Siberian State Medical University, Scientific Educational Center «Biocompatible Materials and Bioengineering» at Tomsk Polytechnic University, Institute of Strength Physics and Materials Science,
ООО «Биоконструктор-С», «Bioconstructor-S» Ltd.,
г. Томск, Россия Tomsk, Russia
Институт химии Дальневосточного отделения РАН, Institute of Chemistry,
г. Владивосток, Россия Vladivostok, Russia
Цель - изучить морфофункциональный профиль культуры мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток человека при контакте с кальций-фосфатными микродуговыми покрытиями с одинаковой шероховатостью и различным фазовым составом.
Материалы и методы. Использована культура пренатальных стромальных клеток легкого человека. Применяли пластины из титана ВТ1.0 с (TiO2) или КФ покрытием, нанесенные микродуговым оксидированием. Фазовый состав поверхности изучали на дифрактометре Shimadzu XRD-7000, элементный состав методом энергодисперсионной спектроскопии на электронном микроскопе Hitachi S5500, шероховатость поверхности покрытий с помощью Talysurf 5-120, РЭМ объектов на электронном микроскопе Phillips SEM 515, оптическую микроскопию с помощью Olympus GX-71, активность ЩФ в клетках методом азосочетания.
Результаты. При одинаковом индексе шероховатости количество ММСК на КФ покрытиях, в 2-5 раз больше по сравнению с TiO2 поверхностями (P1 < 0,006, Р < 0,004). Плотность заселения клетками МДО2 покрытий в 2 раза превышала МДО1. При одинаковой площади окраски на ЩФ оптическая плотность таких структур на МДО1 была выше (P2 < 0,001). При соотношении Ca/P ниже стехиометрического клеточная колонизация покрытий происходит за счет увеличения числа остеогенных клеток на единицу поверхности. При Ca/P > 1,667 активируются, преимущественно, качественные изменения ММСК в остеогенном направлении.
Выводы. При одинаковом показателе шероховатости микродуговых покрытий, наличие КФ слоя значительно увеличивает, по сравнению с TiO2 поверхностью, количество и оптическую плотность стромальных стволовых клеток. Различия фазового состава покрытий приводят к изменению качественных реакций ММСК in vitro.
Ключевые слова: имплантат; микродуговое покрытие; стволовые клетки.
Objective - to investigate the morphofunctional profile of culture of human multipotent mesenchymal stromal cells in contact with calcium-phosphate microarc coatings with equal asperity and different phase composition.
Materials and methods. The culture of prenatal stromal cells from human lungs was used. BT1.0 titanium plates with TiO2 or KF coating applied through microarc oxidation were used. Surface phase composition was studied with diffractometer Shimadzu XRD-7000, element composition - with energy-dispersive spectrography with Hitachi S5500 electronic microscope, surface roughness of coatings - with Talysurf 5-120, RAM objects - with Phillips SEM 515 electronic microscope, optical microscopy - with Olympus GX-71. Alkaline phosphatase cell activity was assessed with diazocoupling technique.
Results. With identical roughness index the amount of human multipotent mesenchymal stromal cells on calcium-phosphate coatings was 2-5 times higher compared to TiO2 surfaces (Pt < 0,006, P < 0,004). The cell settlement density for MDO2 was 2 times higher than MDO1. Closeness of settling MDOt exceeded in 2 times the cages of MDO2 of coverages. At the identical area of colouring on SF, the absorbancy of such structures on MDO1 was higher (P2 < 0,001). At correlation of Ca/P below stoichiometrical cellular colonization of coverages takes place due to the increase of number of osteogenic cages for unit of surface. At Ca/P > 1,667, are mainly qualitative change MMSK in osteogennom direction. Conclusions. At the identical index of roughness of anode microarc coverages, the presence of KF layer increases considerably, as compared to TiO2 by a surface, amount and absorbancy of stem cells. Distinctions of phase composition of coverages cause the change of quality reactions of MMCK in vitro.
Key words: implant; anode microarc oxidizing cover; stem cells.
Выделяют прямое и опосредо- [1]. Дизайн искусственных матриц, ванное влияние имплантатов на которые способны воспроизводить жизнедеятельность клеток и тканей клеточное и тканевое микроокруже-
ние, рассматривается как перспективное направление биоинженерии. К особенностям внеклеточного ма-
трикса относят его возможность регулировать дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) [2].
Считается, что исследования, проведенные in vitro, являются основным инструментом в определении ответа костных структур на искусственные поверхности [3]. Однако лишь в немногих комплексных работах, посвященных остеогенезу, показана взаимосвязь топографии поверхности импланта-тов с процессом развития неспециализированных клеток. Так, Boyan et al. (2003), используя культуру остеобластов, установили реакцию клеток на микроархитектонику подложки. На гладких поверхностях (пластике, стекле и титане) клетки прикрепляются и пролиферируют, но имеют относительно низкие показатели дифференцировки. При выращивании на микрорельефных титановых поверхностях с индексом шероховатости Ra = 4-7 мкм, их рост уменьшен, а дифференциация увеличена.
Создание скеффолдов из гидрок-силапатита и/или фосфатов кальция методом микродугового оксидирования (МДО) позволило выявить определенную зависимость роста костной ткани и остеогенной дифференцировки ММСК от рельефа искусственной поверхности [4, 5]. Однако, различные типы рельефных кальций-фосфатных (КФ) покрытий по-разному индуцируют in vivo остеогенную активность клеток костного мозга мышей, что подчеркивает их неоднозначное влияние на пул ММСК [4, 6].
В настоящее время продолжается дискуссия о значении химического (фазового и элементного) состава фосфатов кальция для остеогенной активности стромальных стволовых клеток.
В связи с этим представляется актуальным изучение морфофунк-ционального профиля культуры ММСК человека при контакте с КФ микродуговыми покрытиями с одинаковой шероховатостью и различным фазовым составом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристики популяций
ММСК из различных тканей очень схожи. Они обнаружены, напри-
мер, как в эмбриональной, так и в легочной тканях. В связи с этим, для эксперимента была использована культура пренатальных стро-мальных клеток легкого человека (ООО «Банк стволовых клеток», г. Томск), которые на 7-8-е сутки культивирования на пластике принимают фибробластоподобную форму.
Препараты представляют собой популяцию клеток разной формы и размеров, что характерно для пула ММСК, с ограниченным сроком жизни, сохраняющую при пассажах стабильный кариотип и онкогенную безопасность. Клетки свободны от посторонних вирусных (ВИЧ, гепатит, герпес и др.) и бактериальных (сифилис, мико-плазмы, хламидии и др.) агентов. После размораживания их жизнеспособность, определяемая согласно ISO 10993-5 в тесте с 0,4 % три-пановым синим, составляет 91-93 %. В предыдущих экспериментах in vitro показано, что они способны проявлять морфофункциональные особенности остеобластоподобных клеток [5].
В качестве подложек для культивирования ММСК применяли пластины из титана ВТ1.0 (диаметр 10-12 мм, толщина 1 мм), несущие искусственные, двусторонние, ти-танооксидные (TiO2) или КФ покрытия, нанесенные вариациями метода микродугового оксидирования (МДО) в Институте физики прочности и материаловедения СО РАН (МДО2) или Институте химии ДВО РАН (МДО4).
Фазовый состав поверхности изучали по рентгенофазовому анализу на дифрактометре Shimadzu XRD-7000. Интерпретацию результатов проводили на основе базы данных International Center for Diffraction Data (ICDD). Элементный состав нанесенного слоя исследовали методом энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС) на электронном микроскопе Hitachi S5500. Шероховатость поверхности покрытий оценивали по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы Talysurf 5-120 (разрешающая способность 10 нм). Определяли Ra как средний результат шероховатости в пределах нескольких
длин участков измерении согласно ГОСТ 2789-73.
Для культивирования клеток на созданных структурах использовали следующий состав среды: 90 % RPMI-1640, 10 % эмбриональной телячьеИ сыворотки, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина сульфата.
Диски помещали в лунки (площадь 1,77 см2) 24-луночных планшетов («Costar») и добавляли клеточную взвесь в концентрации 4 х 104 жизнеспособных кариоци-тов в 1 мл культуральнои среды.
Через 4 суток имплантаты удаляли и фиксировали клетки (30 с в парах неитрального формалина) для проведения цитохимическои окраски на щелочную фосфатазу (ЩФ) и для растровоИ электрон-ноИ микроскопии (РЭМ).
Морфологию поверхности исследовали в материаловедческом центре коллективного пользования при Томском государственном университете. РЭМ объектов осуществляли на электронном микроскопе Phillips SEM 515, оптическую микроскопию в отраженном свете — на металлографическом микроскопе Olympus GX-71.
Для подготовки образцов к РЭМ осуществляли их фиксацию в 1 % растворе четырехокиси осмия в течение 30-40 мин. с последующим двукратным отмыванием фосфатным буфером (рН = 7,2-7,4). Далее производили обезвоживание клеток в серии водных растворов этанола восходящеИ концентрации 30°,50°,-70°,90°,100° по 15 мин. в каждом, и дважды в 100 % ацетоне.
Активность ЩФ в клетках определяли методом азосочета-ния по G. Сотойв в модификации А.Г. Михеева [7]. Методика основана на использовании ASMX-нафтолфосфата, которыИ в присутствии ЩФ, ионов кальция и магния гидролизуется с высвобождением альфа-нафтола. Последний взаимодеИствует с прочным синим PP-соль с образованием нерастворимого осадка красителя в оттенках синего цвета в зависимости от концентрации тестируемого фермента.
С помощью компьютерноИ морфо-метрии выявляли количественные параметры клеток по их оптическим характеристикам [8]. Опреде-
№ 3 [сентябрь] 2012
ляли площадь и оптическую плотность объектов с применением программы ImageJ согласно статистике серых уровней в модификации [9] для непрозрачных объектов. Площадь выражали в квадратных микрометрах, оптическую плотность — в условных единицах оптической плотности (у.е.о.п.).
При оценке полученных результатов были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез, использующиеся в стандартных пакетах программ Statisti-ca (версия 6.0). Для анализа имеющихся выборок данных применяли гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). Вычисляли среднее арифметическое (X), статистическую девиацию (SD) и ошибку среднего (m). Так как в проводимом исследовании распределение показателей отличалось от нормального, с целью выявления достоверной значимости различий выборок применяли критерий Манна-Уитни (U-тест). Различия считались статистически значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Постановка текущего эксперимента in vitro позволила выяснить морфофункциональное состояние популяций стромальных стволовых клеток, прикрепляющихся непосредственно к поверхности изделия. При этом для исключения
влияния рельефа на результаты тестирования были использованы подложки с одинаковым диапазоном показателя шероховатости Иа около 2 мкм (табл.).
Оптическая микроскопия в отраженном свете (для непрозрачных объектов) позволила установить, что при одинаковом индексе шероховатости количество ММСК, окрашенных на ЩФ (т.е. начинающих созревать в остеогенном направлении) на КФ покрытиях, более чем в 2-5 раз превышало таковое для ТЮ2 поверхностей.
В свою очередь, плотность заселения клетками МДО2 покрытий более чем в 2 раза превышала таковую на МДОг Однако при одинаковой площади окраски на ЩФ оптическая плотность таких структур на МДО1 была статистически значимо выше.
ЩФ считается маркером остеобластов [10], дифференцирующихся в процессе культивирования из пула ММСК. Таким образом, КФ покрытие, по сравнению с биоинертным ТЮ2 слоем, усиливает остеогенный потенциал импланта-тов, что соответствует данным, полученным в клинических условиях при выполнении биоинертного или биоактивного накостного остеосин-теза [11]. При этом различия в химическом составе МДО покрытий могут играть роль в механизмах прямой индукции остеогенного созревания и дифференцировки стро-
мальных стволовых клеток человека.
При соотношении Ca/P ниже стехиометрического 1,667 (МД02 покрытия) отмечается в большей степени колонизация (заселение) ММСК искусственных КФ поверхностей за счет увеличения плотности прилипающих стромальных клеток. В связи с существенной тропностью ММСК следует ожидать in vivo выраженный прирост костной массы на изделиях с таким типом КФ покрытий. Однако формирующаяся костная ткань будет незрелой, грубоволокнистой. Подобный характер остеогенеза на подобных покрытиях мы наблюдали ранее в тесте эктопического косте-образования [4], что подтверждает полученные in vitro результаты.
В то же время, МД01 при не-стехиометрическом Ca/P > 1,667 активируют, преимущественно, качественные изменения ММСК в остеогенном направлении. Эти качественные изменения связаны с увеличением экспрессии ЩФ, одного из главных ферментов ре-моделирования костной ткани [1, 10]. При этом, в тесте эктопического остеогенеза [6] такие покрытия также способствовали формированию грубоволокнистой костной ткани.
Согласно оптической микроскопии, ММСК заселяли светлые поверхностные участки МД01 покрытий (сферолиты) (рис. 1), по-ви-
Таблица
Результаты компьютерной морфометрии окрашенных на щелочную фосфатазу стромальных стволовых клеток на покрытиях с
одинаковой шероховатостью, Х ± SD (т)
Группа, n = 3 Ra, мкм Основной фазовый состав Число ЩФ-позитивных клеток в 1 мм2 Оптическая плотность (D) ЩФ-позитивных клеток, у.е.о.п. Площадь окраски ЩФ-позитивных клеток, мкм2
МДО1, П = 116 1,81 ± 0,30 (0,17) ^(РОД; Саш(Р04)6(ОН)2; другие фосфаты кальция 50 ± 21 (9) P1 < 0,006 8,73 ± 0,80 (0,46) P1 < 0,05 91 ± 6 (3) P1 < 0,05
МДО2, П = 130 1,84 ± 0,44 (0,25) Саз(Р04)2; другие фосфаты кальция 104±24 (14) P1 < 0,004 P2 < 0,001 5,77 ± 1,62 (0,94) P2 < 0,047 143 ± 77 (44)
TiO2, n, = 45 1,47 ± 0,99 (0,57) ТЮ2-анатаз 21 ± 5 (3) 2,33 ± 2,58 (1,49) 169 ± 63 (36)
Примечание: п - число исследованных образцов; п1 - число подсчитанных окрашенных клеток на образцах; у.е.о.п. - условные единицы оптической плотности; (Р1) - указаны статистически значимые различия с группой ТЮ2; (Р2) - указаны статистически значимые различия с группой МДО1 согласно и-критерию Вилкоксона.
димому, в зонах повышенного содержания гидроксилапатита (ГАП) и трикальцийфосфата (ТКФ). В то же время, на МДО2 покрытиях основное расположение стромаль-ных стволовых клеток наблюдалось в углублениях поверхности (рис. 2).
РЭМ подтвердила данные оптической микроскопии. В случае МДО1 покрытий стромальные стволовые клетки располагались поверхностно и принимали уплощенную форму (рис. 3). При тестировании изделий с МДО2 слоем ММСК заселяли, в основном, углубления между сферолитами и принимали
неправильную, фибробластоподоб-ную форму (рис. 4).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При одинаковом показателе шероховатости микродуговых покрытий наличие КФ слоя значительно увеличивает, по сравнению с метал-локерамической (титанооксидной) поверхностью, количество и оптическую плотность стромальных стволовых клеток, окрашенных на щелочную фосфатазу, что указывает о созревании клеток по остеоген-ному пути.
Различия фазового состава покрытий приводят к изменению
качественных реакций ММСК ш vitгo. Так, при соотношении Са/Р ниже стехиометрического отмечается, в большей степени, клеточная колонизация (заселение) покрытий за счет увеличения числа остеоген-ных клеток на единицу поверхности.
При нестехиометрическом Са/ Р > 1,667 активируются, преимущественно, качественные изменения ММСК в остеогенном направлении, связанные с увеличением оптической плотности клеток, окрашенных на ЩФ, считающуюся одним из главных ферментов ремоделиро-вания костной ткани.
Рисунок 1 Рисунок 2
Расположение окрашенных на щелочную Расположение окрашенной на щелочную фосфатазу
фосфатазу стромальных стволовых клеток (синяя стромальной стволовой клетки (указано стрелкой)
окраска, стрелки) на поверхности микродугового в углублении микродугового кальцийфосфатного
кальцийфосфатного покрытия МДОг Увеличение 500. покрытия МД02. Увеличение 1000.
Рисунок 3
РЭМ стромальных стволовых клеток на поверхности микродугового КФ покрытия МДОг Увеличение 2500.
■" "йС^'У^»у*
■ | У
Ъ'
Рисунок 4
РЭМ стромальных стволовых клеток на поверхности микродугового КФ покрытия МДО2. Увеличение 2500.
№ 3 [сентябрь] 2012
75
Литература:
1. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. 2nd edition /B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F.J. Schoen, J.E. Lemons, editors. - San Diego: Elsevier Academic Press, 2004. - 851 p.
2. Kolf, C.M. Mesenchemal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation /C.M. Kolf, E. Cho, R.S. Tuan //Arthritis Res.Ther. - 2007. - Vol. 9. - P. 204-219.
Basic reactions of osteoblasts on structured material surface /U. Meyer, A. Buchter, H.P. Wiesmann [et al.] //European Cells and Materials. - 2005. - Vol. 9. - P. 39-49.
Osteogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow in Situ: Role of Physicochemical Properties of Artificial Surfaces /I.A. Khlusov, A.V. Karlov, Yu.P. Sharkeev [et al.] //Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2005. - Vol. 140, N 1. - P. 144152.
Пилотное исследование in vitro параметров искусственной ниши для остеогенной дифференцировки пула стромальных стволовых клеток человека /И.А. Хлусов, М.Ю. Хлусова, К.В. Зайцев
3.
4
5
[и др.] //Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010.
- № 4. - С. 216-224.
6. Кальций-фосфатные биоактивные покрытия на титане /С.В. Гне-денков, Ю.П. Шаркеев, С.Л. Синебрюхов [и др.] //Вестник ДВО РАН. - 2010. - № 5. - С. 47-57.
7. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник /под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 364 с.
8. Культура животных клеток. Методы: пер. с англ. /под ред. Р. Фрешни. - М., 1989. - 332 с.
9. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей /В.П. Шахов [и др.]; под ред. В.В. Новицкого [и др.].
- Томск: STT, 2004. - 386 с.
10. Риггз, Б.Л. Остеопороз: пер. с англ. /Б.Л. Риггз, Л.Дж. Мелтон III. - СПб.: БИНОМ, Невский диалект, 2000. - 560 с.
11. Маркеры остеогенеза в периферической крови как патогенетические факторы и предикторы системных эффектов импланта-тов для остеосинтеза /Т.В. Дружинина, И.А. Хлусов, А.В. Карлов, А.В. Ростовцев //Гений ортопедии. - 2007. - № 4. - С. 83-88.
Сведения об авторах:
Попов В.П., к.м.н., ассистент, кафедра травматологии, ортопедии, Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск, Россия.
Хлусов И.А., д.м.н., профессор, кафедра морфологии и общей патологии, Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск, Россия.
Гнеденков С.В., д.х.н., заместитель директора, Институт химии Дальневосточного отделения РАН, г. Владивосток, Россия.
Шаркеев Ю.П., д.ф.-м.н., профессор, заведующий лабораторией физики наноструктурных биосовместимых композитов, Научно-образовательный центр «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при Томском политехническом университете, Сибирском государственном медицинском университете и Институте физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск, Россия.
Легостаева Е.В., к.ф.-м.н., старший научный сотрудник, Научно-образовательный центр «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при Томском политехническом университете, Сибирском государственном медицинском университете и Институте физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск, Россия.
Адрес для переписки:
Попов В.П., ул. Каспийская, 87, г. Томск, Россия, 634021
Тел: +7-903-915-5763
E-mail: [email protected]
Information about authors:
Popov V.P., candidate of medical sciences, chair of traumatology, orthopedics and military field surgery, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia.
Khlusov I.A., MD, PD, professor, chair of morphology and general pathology, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia.
Gnedenkov S.V., doctor of chemistry sciences, deputy director of Chemistry Institute, Vladivostok, Russia.
Sharkeev Y.P., doctor of physical and mathematical sciences, professor, head of laboratory of physics of nanostructured biocompatible composites, Scientific Educational Center «Biocompatible Materials and Bioengineering», Tomsk Polytechnic University, Siberian State Medical University, Institute of Strength Physics and Materials Sciences, Tomsk, Russia.
Legostaeva E.V., candidate of physical and mathematical sciences, senior researcher, Scientific Educational Center «Biocompatible Materials and Bioengineering», Tomsk, Russia.
Address for correspondence:
Popov V.P., Kaspiyskaya St., 87, Tomsk, Russia, 634021 Tel: +7-903-915-5763 E-mail: [email protected]
m
