CC BY
24
УДК 616:579.61
Структура генома клинических изолятов Mycoplasma hominis, устойчивых к ципрофлоксацину
Е. А. Колесникова*, Н. Ф. Бруснигина, М. А. Махова, А. Е. Алексеева
Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, 603950 Россия
*E-mail: shmelevael@yandex.ru
Поступила в редакцию 04.10.2019
Принята к печати 19.02.2020
DOI: 10.32607/actanaturae.10941
РЕФЕРАТ С использованием NGS-секвенирования на платформе Illumina изучена структура генома трех устойчивых к ципрофлоксацину клинических изолятов Mycoplasma hominis. Определена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей исследуемых штаммов микоплазм. Показана ограниченность биосинтетических возможностей M. hominis (М45, М57, МН1866), связанная с преобладанием в их геноме генов, кодирующих белки, которые участвуют в катаболических процессах. Обнаружены множественные однонуклеотидные замены, обусловливающие внутривидовой полиморфизм M. hominis. Выявлены гены, кодирующие эффлюксные системы - АВС-транспортеры (ATP-binding cassette superfamily) и белки семейства MATE (Multidrug and toxic compound extrusion family). Установлено, что молекулярный механизм резистентности к ципрофлоксацину у изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 связан с заменой серина на лейцин в позиции 83 субъединицы А ДНК-гиразы, а у M. hominis МН1866 - с заменой лизина на аргинин в позиции 144 А-субъединицы топоизомеразы IV.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Mycoplasma hominis, структура генома, секвенирование, гены gyrA, parC, ABC-транспортеры, MATE.
ВВЕДЕНИЕ
Mycoplasma hominis - один из наиболее распространенных представителей класса Mollicutes, характеризуется отсутствием ригидной клеточной стенки, способностью к персистенции на мембране клеток эукариот, малым размером генома, генетическим и клеточным полиморфизмом, ограниченностью метаболических путей, устойчивостью к антибактериальным препаратам, действие которых направлено на ингибирование биосинтеза клеточной стенки [1].
Известно, что штаммы M. hominis колонизируют преимущественно органы урогенитального тракта женщин и мужчин как в норме, так и при воспалительных процессах (уретрит, цервицит, вагинит, бактериальный вагиноз и др.). Доказана способность M. hominis колонизировать верхние дыхательные пути новорожденных и вызывать респираторные инфекции [1, 2].
Полученные за последние годы данные литературы свидетельствуют об увеличении частоты выявления урогенитальных микоплазм, резистентных к препаратам фторхинолонового ряда и макролидам, наиболее часто применяемым в терапии воспалительных заболеваний органов малого таза [3-5].
Мониторинг антибиотикорезистентности бактерий, в том числе M. hominis, - возбудителей репродуктив-но-значимых инфекций, представляет важную медико-биологическую проблему, решение которой связано с изучением основ патогенности, резистентности и адаптации микоплазм к стрессовым условиям среды. Современные молекулярно-генетические технологии, в частности NGS-секвенирование, позволили приблизиться к пониманию этих процессов. Полная нуклеотидная последовательность генома M. hominis (M. hominis ATCC 23114 номер GenBank FP236530.1) была впервые секвенирована и расшифрована группой французских ученых под руководством S. Pereyre в 2009 г. [6]. В настоящее время в международной базе данных GenBank представлена информация о полногеномных последовательностях 23 штаммов M. hominis. Следует отметить, что изучение эволюционного разнообразия популяции M. hominis как в Российской Федерации, так и за рубежом сопряжено с трудностями, связанными с отсутствием информации об особенностях организации их генома, включая факторы патогенности и резистентности.
В нашей работе проанализирована структура генома ципрофлоксацин-резистентных клинических
изолятов M. hominis, выделенных от женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Нами изучены три клинических изолята M. hominis (М45, М57, МН1866), выделенных из соскобов эпителия цервикального канала женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, от которых получено письменное информированное согласие на участие в исследовании. Обнаружение, идентификацию, определение антибиотикограммы микоплазм осуществляли с использованием коммерческих жидких дифференциально-диагностических сред производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора (РУ № ФСР 2008/03366). Все штаммы, включенные в исследование, обладали устойчивостью к ципрофлоксаци-ну. Результаты многолетнего микробиологического мониторинга распространенности и антибиотикоре-зистентности урогенитальных микоплазм, выделенных от женщин и мужчин как здоровых, так и с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, опубликованы ранее [7-10]. ДНК выделяли и очищали с использованием набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Полногеномное секвенирование проводили на секве-наторе MiSeq (Illumina, США). Концентрацию ДНК в образцах определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Австрия). Подготовку библиотеки ДНК для секвенирования осуществляли с использованием набора Nextera XT (Illumina), секвениро-вание проводили с использованием набора MiSeq reagent kit v2 (Illumina) на 500 циклов. В качестве ре-ференсной была выбрана полногеномная последовательность штамма M. hominis АТСС 23114 (GenBank FP236530.1). Нуклеотидные последовательности выравнивали с использованием встроенного программ-
ного обеспечения секвенатора MiSeq (Isis version 2.6.2.3). Полученные данные визуализировали и анализировали с помощью программного обеспечения UGENE Unipro [11] и MEGA 7.0 [12]. Аннотацию генома проводили с использованием сервера RAST (Rapid Annotationusing Subsystem Technology) [13] и NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ annotation_prok/). Филогенетический анализ полногеномных последовательностей проводили с использованием web-сервиса REALPHY [14] Online tool версия 1.12 (https://realphy.unibas.ch/fcgi/realphy). В анализ включены все полные нуклеотидные последовательности геномов M. hominis, депонированные в базу данных RefSeq NCBI (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/refseq). Построение филогенетических деревьев осуществляли методом ближайшего соседа (Neighbor-Joining) [15] с использованием программного обеспечения MEGA 7.0 [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Полные нуклеотидные последовательности геномов M. hominis депонированы в международную базу данных GenBank NCBI под номерами MRAY00000000 (M. hominis М45), MRAX00000000 (M. hominis М57) и Q0K000000000 (M. hominis МН1866). Исходные архивы ридов доступны под номерами: SUB 6713744 (M. hominis М57), SUB 6713764 (M. hominis М45), SUB 6713769 (M. hominis МН1866). В результате сек-венирования и сборки первичных прочтений получено от 18 (штамм МН1866) до 27 (штаммы М45, М57) контигов. Вероятнее всего, разрывы, обнаруженные при картировании геномов исследуемых изолятов M. hominis, связаны с отсутствием покрытия данного региона в исходном архиве ридов. Размер генома исследуемых штаммов варьировал от 633 286 п.н. (М57) до 642 227 п.н. (М45), доля GC составила 27.2%.
Структурный анализ генома клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866)
Характеристика Изоляты M. hominis/ номер GenBank
М45/ MRAY00000000 М57/ MRAX00000000 МН1866/ QOKOOOOOOOOO Референсный штамм АТСС 23114
Длина сборки, п.н. 642 227 633 286 639 787 665 445
Число контигов 27 27 18 1
Кратность покрытия 599, 4945 316, 929169 256, 2492 -
Число прочтений, млн 3.8 2.6 1.3 -
N50 33.392 49.675 57.877 665.445
L50 6 4 4 1
GC, % 27.2 27.2 27.2 27.1
Число генов/псевдогенов 592/28 589/30 581/16 598/12
Число белоккодирующих последовательностей 546 543 546 557
Число оперонов16S-23S-5S 2 2 2 2
Процент идентичности аминокислотной последовательности
Лучший двунаправленный вариант .;:-;•;• г.-; ;: ": !: -: ::• ::
Лучший однонаправленный вариант ::-;•;•-;•: : : ;• - г: :: г: ~. у. : :
Скачать таблицу
очистить все фильтры
Отображать 30 элементов на странице отображение 1-30 из 542 следующий предыдущий»
процент идентичности 6666666.220762
процент идентичности 2098.29
2098.27 6666666.220762
процент идентичности 6666666.201005
* ! все ' все все все все все
660 - bi 1 1 bi 7
110 bi 1 bi 1 bi 2
49 bi 1 bi 1 bi 3
449 bi 1 bi 1 bi 4
366 bi 1 bi 1 bi 5
71 bi 1 bi 1 bi
66 bi 1 bi 1 bi z
258 bi 1 bi 1 bi 8
256 bi 1 bi 1 bi 9
10 229 bi 1 bi 1 10 bi Ш_
128 358 bi Л ТА bi 15 bi_ и
129 818 bi 4 Z5 bi 15 503 bi
130 38 bi 4 26 bi 15 104 bi_ M_
295 121 bi 13 218 bi 16 bi
296 603 bi 13 219 bi 16 506 bi
297 154 bi 13 220 bi 16 507 bi
329 185 bi 13 221 bi 16 508 bi
ззо 717 bi 13 222 bi 16 509 bi 202
331 95 bi 13 223 bi 16 510 |bS
Ш 285 bi 13 224 bi 16 511 bi 204
III 102 bi 13 225 bi 16 512 bi
зм 194 bi 13 226 bi 16 513 bi
335 180 bi 13 227 bi 16 514 bi 20б~
336 528 bi 13 228 bi 16 515 bi
337 294 bi 13 229 bi 16 516 bi_ 208
338 496 bi 13 230 bi 16 517 Iba_ 209
339 126 bi 13 231 bi 16 518 bi 210
340 72 bi 13 232 bi 16 519 bi 211
341 725 uni 13 233 bi I 16 520 [Ei
342 177 uni 13 232 bi 16 521 bi
% ч
\ A III
\ \\\ hi щ
Ш %
дисплей 1-30 из 542 следующий» последний»
pill
ten *
in I
ft
m
1 §
Рис. 1. Сравнительный анализ идентичности аминокислотных последовательностей штаммов M. hominis М45, М57 и МН1866. Результаты получены с помощью сервера RAST
Основные метрические показатели сборки генома M. hominis представлены в таблице.
Анализ данных, полученных с помощью сервера RAST (Rapid Annotationusing Subsystem Technology), выявил у штамма M. hominis М57 543 белоккодирующих гена и 546 - как у штамма M. hominis М45, так и у МН1866. В структуре генома M. hominis МН1866 обнаружено 16 псевдогенов, 30 - у штамма M. hominis М57 и 28 - у M. hominis М45. Подавляющее большинство псевдогенов представлено неполными нуклеотидными последовательностями с неизвестной функцией. Однако у части псевдогенов M. hominis выявлены преждевременные стоп-кодоны (три у штамма M. hominis М57) и мутации сдвига рамки считывания (четыре у M. hominis МН1866, по две - M. hominis М45 и M. hominis М57). В геномах всех штаммов обнаружено по две копии оперона 16S-23S-5S рРНК.
Установлено, что геномы исследуемых штаммов M. hominis являются высокогомологичными, степень гомологии на уровне аминокислотных последовательностей составляет около 95% (рис. 1).
Геномы всех трех штаммов имеют сходную структуру, поэтому на рис. 2 представлена диаграмма, отображающая распределение генов по функциям их продуктов, на примере изолята M. hominis МН1866.
Показано, что функции подавляющего числа генов M. hominis связаны с синтезом белка (39.1%), ДНК (13%) и РНК (11.6%) (рис. 2). Система центрального углеводного обмена (доля генов составляет 6.9%) исследуемых штаммов является усеченной и состоит из отдельных компонентов, участвующих в метаболизме пирувата, пентозофосфатов (предшественников рибозы и дезоксирибозы), глюкозы и лактозы. Отмечено, что геном микоплазм содержит гены pdP, deoD, deoB и deoC, кодирующие катаболиче-ские ферменты: пиримидин-нуклеозидфосфорила-зу, пурин-нуклеозидфосфорилазу, фосфопентому-тазу и дезоксирибоальдолазу соответственно. Эти ферменты участвуют в катаболизме дезоксирибо-зы и дезоксинуклеозида. В качестве единственного источника углерода и энергии штаммы M. hominis могут использовать 2-дезокси^-рибозильную часть 2'-дезоксирибонуклеозидов в результате каскада биохимических реакций ферментации дезоксири-бозы. Наличие генов, кодирующих ферменты цикла пуриновых оснований - аргининдезаминазу (ArcA), орнитинтранскарбамилазу (ArgF) и карбаматкиназу (ArqC), позволяет микоплазмам получать энергию в форме АТР альтернативным путем - посредством деградации аргинина и орнитина [6]. Доля продуктов мембранного транспорта, как и ферментов, преобра-
13 (5/1.3%)
1 ■ Кофакторы, витамины, простетические группы, пигменты (18)
2 Ц Клеточная стенка и капсула(4)
3 ЕЗ Вирулентность, патогенность и иммуногенность (14)
4 Метаболизм калия (3)
5 К Фотосинтез (0)
6 Разнообразие (1)
7 Фаги, профаги, транспозоны, плазмиды (0)
8 Мембранный транспорт (11)
9 Усвоение железа и обмен веществ (0)
10 Метаболизм РНК (42)
11 Нуклеозиды и нуклеотиды (11)
12 Аминокислотный метаболизм (142)
13 Деление клеток и клеточный цикл (5)
14 Подвижность и хемотаксис (0)
15 Регуляция и клеточный ответ (0)
16 Вторичный метаболизм (0)
17 Метаболизм ДНК (47)
18 .' ' Жирные кислоты, липиды и изопреноиды (8)
19 Метаболизм азота (0)
20 Анабиоз и споруляция (1)
21 Дыхание (1)
22 Реакция на стресс (9)
23 Метаболизм ароматических соединений (0)
24 Аминокислоты и производные (19)
25 Метаболизм серы (1)
26 Метаболизм фосфора (1)
27 Углеводы (25)
Рис. 2. Диаграмма распределения генов по функциональным группам на примере штамма M. hominis МН1866. Изображение получено с помощью сервера RAST. Цифры от 1 до 27 - условные обозначения подсистем в структуре генома. В скобках указано количество генов в подсистеме / % (процент генов в общей структуре генома)
зующих пурины, составляет 3% от общей структуры генома.
У каждого исследуемого изолята микоплазм выявлены гены, кодирующие эффлюксные системы, участвующие в мембранном транспорте, а именно АВС-транспортеры (ATP-binding cassette superfamily) и белки семейства MATE (Multidrug and toxic compound extrusion family). Система АВС-транспортеров представлена структурными элементами, осуществляющими транспорт олигопептидов через мембрану бактериальной клетки, а именно, тремя копиями гена oppB (кодирует транспортные белки - пермеазы OopB) и одной копией гена oppC (кодирует пермеазу OopC). Работа эффлюксных насосов системы МАТЕ обеспечивается электрохимическим градиентом ионов натрия (Na+) [16]. Полная последовательность гена, кодирующего белки семейства МАТЕ, в каждом анализируемом штамме микоплазм составила 1809 п.н.
Как уже сказано, исследуемые штаммы M. hominis (М45, М57, МН1866) характеризуются устойчивостью к ципрофлоксацину. Поиск мутаций, определяющих устойчивость к фторхинолонам, проводили путем анализа QRDR-области в генах, кодирующих топоизомеразы - gyrA и gyrB (субъединицы ДНК-гиразы), parC и parE (субъединицы топоизомеразы IV). Детальная характеристика генов gyrA, gyrB, paгС и parE у изолятов M. hominis М45 и M. hominis
М57 приведена в ранее опубликованной работе [16]. Установлено, что резистентность изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 к ципрофлоксацину связана с заменой серина (Ser) на лейцин (Leu) в позиции 83 А-субъединицы ДНК-гиразы [16]. Определено, что гены gyrA, gyrB, pa^ и parЕ изолята МН1866 содержат большое количество нуклео-тидных полиморфизмов. Так, в гене gyгА обнаружено 47 точечных замен, в gyrB - 10, в pa^ - 45, в parЕ -19. Показано, что устойчивость M. hominis МН1866 к ципрофлоксацину обусловлена мутацией в QRDR-участке гена paгС, приводящей к замене лизина (Lys) на аргинин (Arg) в позиции 144 большой субъединицы топоизомеразы IV (рис. 3).
Значимые замены в QRDR-области генов gyrA, gyrB и parЕ у M. hominis МН1866 нами не обнаружены.
Дендрограмма полной нуклеотидной последовательности генома штаммов M. hominis (М45, М57, МН1866) относительно геномов M. hominis, депонированных в базу данных GenBank, представлена на рис. 4.
Результаты филогенетического анализа показали, что изолят M. hominis М45 занимает обособленное положение относительно российских изолятов мико-плазм и представляет отдельную филогенетическую ветвь. Изолят M. hominis MH1866 генетически близок к M. hominis МН1817 и формирует с ним единый
Mycoplasma hominis Топоизомераза IV субъединица А PG21 (parC) Последовательность ID: 3апрос_143601 Длина 933 Количество совпадениий:1
Уровень 1: 1 до 933 График
Следующее совпадение ▼ Предыдущее совпадение ▲
Основание 1873 бит(4852)
МН1866
PG21
МН1866
PG21
МН1866
PG21
МН1866
PG21
МН1866
PG21
МН1866
PG21
1 1 61 6 1 121 121 181 181 241 241 301 601
Ожидаемое совпадение Метод
0.0 настройка
упорядоченной матрицы
MKKDRKEEIQEVTENIIEKNMADIMSDRFGRYSKYIIQQRAIPDARDGLKPVQRRILYSM MKKDRKEEIQEVTENIIEKNMADIMSDRFGRYSKYIIQQRAIPDARDGLKPVQRRILYSM MKKDRKEEIQEVTENIIEKNMADIMSDRFGRYSKYIIQQRAIPDARDGLKPVQRRILYSM
WNLHLKNSEPFKKSARIVGDVIGRYHPHGDSSIYEALVRMAQDWKSNFPLIEMHGNKGSI WNLHLKNSEPFKKSARIVGDVIGRYHPHGDSSIYEALVRMAQDWKSNFPLIEMHGNKGSI WNLHLKNSEPFKKSARIVGDVIGRYHPHGDSSIYEALVRMAQDWKSNFPLIEMHGNKGSI
DDDPAAAMRYTESRLEKISELMLRDLDRKVVKMAPNFDDSEYEPIVLPALFPNLLVNGAK DDDPAAAMRYTESRLEKISELML+DLDRKVVKMAPNFDDSEYEPIVLPALFPNLLVNGAK DDDPAAAMRYTESRLEKISELMLKDLDRKVVKMAPNFDDSEYEPIVLPALFPNLLVNGAK
GIAAGFATEIPPHNLGEVIDATIALIKNPTISIEELSEIVKGPDFPTGAIINGINEIKKA GIAAGFATEIPPHNLGEVIDATIALIKNPTISIEELSEIVKGPDFPTGAIINGINEIKKA GIAAGFATEIPPHNLGEVIDATIALIKNPTISIEELSEIVKGPDFPTGAIINGINEIKKA
LSSGQGRITISSKYHYVYDKKDESKIIGIEIIEIPFGVVKSKLVADIDAIAIDKKISGIK LSSGQGRITISSKYHYVYDKKDESKIIGIEIIEIPFGVVKSKLVADIDAIAIDKKISGIK LSSGQGRITISSKYHYVYDKKDESKIIGIEIIEIPFGVVKSKLVADIDAIAIDKKISGIK
EVLDQTDRNGISIFIQLEDGANADAIIAYLMNKTELSISYSYNMVAIDNNRPVILNLYSA EVLDQTDRNGISIFIQLEDGANADAIIAYLMNKTELSISYSYNMVAIDNNRPVILNLYSA EVLDQTDRNGISIFIQLEDGANADAIIAYLMNKTELSISYSYNMVAIDNNRPVILNLYSA
Идентичность Позитивность Разрывы 926/933(99%) 930/933(99%) 0/933(0%)
60 60 120 120 180 180 240 240 300 300 360 360
Рис. 3. Выравнивание аминокислотной последовательности А-субъединиц топоизомера-зы IV клинического изолята M. hominis МН1866 и референсного штамма M. hominis АТСС 23114 (PG21). Красным цветом выделена замена лизина (К) на аргинин (R)в позиции 144
кластер. Штамм M. hominis М57 выделен в отдельную ветвь среди основной группы российских изолятов микоплазм.
ОБСУЖДЕНИЕ
Современные молекулярные методы позволяют понять, как функционирует один из самых малых по размеру геномов прокариот - геном M. hominis, а также оценить его эволюцию. Впервые полная структура генома M. hominis ATCC 23114 (GenBank FP236530.1) длиной 665 445 п.н. была расшифрована группой французских ученых под руководством S. Pereyre в 2009 г. [6]. В настоящее время (на 23 августа 2019 г.) в базе данных GenBank/NCBI доступна информация о полной структуре геномов семи штаммов M. hominis и неполных геномах 16 штаммов в виде контигов (пять штаммов) и скаффолдов (11 штаммов). Размер генома исследуемых изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) оказался меньше, чем у геномов микоплазм, депонированных в GenBank/ NCBI. Однако результаты биоинформатического анализа, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что основные характеристики (количество генов, псевдогенов, РНК, белоккодирующих последовательностей) генома штаммов M. hominis (М45, М57, МН1866) и референсного штамма M. hominis ATCC 23114 являются одинаковыми. Следует отметить, что полученные нами данные соответствуют информации о других представителях вида M. hominis,
представленной в NCBI Genome (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/genomes/3075?).
Биоинформатический анализ структуры генома M. hominis (М45, М57, МН1866) выявил большое число псевдогенов. Известно, что псевдогены рассматриваются в качестве резерва последовательностей, которые рекомбинируют с функциональными паралогичными генами, и таким образом создают их генетическое разнообразие [17]. Отмечено, что количество псевдогенов в геноме изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 в 2 раза превышало аналогичные показатели у референсного штамма. Вероятно, что множественные псевдогены микоплазм обеспечивают ассортимент последовательностей, необходимый для создания генетического разнообразия поверхностных антигенов [17].
Филогенетические взаимоотношения между изученными штаммами и штаммами, геномы которых депонированы в GenBank, оценивали на основе сравнения однонуклеотидных полиморфизмов. Данные филогенетического анализа свидетельствуют о генетической гетерогенности исследуемых ципрофлокса-цин-резистентных изолятов M. hominis. Однако сравнительный анализ с использованием сервера RAST [13] выявил высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей белков штаммов микоплазм. Большое количество точечных мутаций в геноме M. hominis обусловливает их высокую генетическую пластичность и склонность к быстрой эволюции.
M. hominis 621 M. hominis штамм H34 M. hominis штамм TOA M. hominis 1019 M. hominis 1817 M. hominis 1866 M. hominis 1002 M. hominis штамм M57 M. hominis 529 M. hominis штамм Sprott M. hominis штамм AF1 M. hominis штамм AF3 M. hominis ATCC 27545 M. hominis 1991 M. hominis 1861 M. hominis штамм M45* M. hominis штамм PL5 M. hominis ATCC 23114
M. hominis штамм 387 MHOM 107 14438 1052663 M. hominis штамм 403 MHOM 10 5714 76960
Рис. 4. Дендрограмма полных нуклеотидных последовательностей генома штаммов M. hominis, депонированных в международной базе данных GenBank/ NCBI. *Выделен клинический изолят M. hominis М45, наиболее удаленный от других российских изо-лятов
Преобладание в геноме M. hominis генов, кодирующих белки с катаболическими функциями, подтверждает ограниченность биохимических возможностей микоплазм. Импорт питательных веществ в клетку микоплазм из клеток хозяина происходит преимущественно при помощи транспортных белков [1], менее специфичных, чем аналогичные белки других бактерий. Транспортные белки микоплазм выполняют несколько функций. Так, белки OopB и OopC, входящие в систему АВС-транспортеров, участвуют не только в транспорте олигопепти-дов, но и в выведении лекарственных препаратов из бактериальной клетки [18]. При характеристике неспецифического механизма устойчивости M. hominis (М45, М57, МН1866) к фторхинолонам следует отметить, что геном каждого исследуемого изолята содержит одну копию гена, кодирующего белки множественной лекарственной резистентности MATE. В состав этого гена входят гомологичные последовательности генов norM и mepA Staphylococcus aureus, которые, как доказано, участвуют в удалении катионных антибактериальных препаратов из бактериальной клетки [19].
Установлено, что молекулярный механизм устойчивости анализируемых клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) к фторхинолонам обусловлен нуклеотидными заменами в генах gyrA (Ser83Leu) и parC (Lys144Arg), приводящих к изменению первичной структуры больших субъединиц ДНК-гиразы и топоизомеразы IV. Такой механизм описан у ряда классических бактерий (E. coli, Streptococcus spp, Staphylococcus spp.) [20]. Многочисленные однонуклеотидные замены в генах gyrA, gyrB, parC и parЕ изолятов M. hominis являют-
ся причиной высокого генетического полиморфизма и играют ведущую роль в формировании анти-биотикорезистентности, что согласуется с данными [21-23].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного нами исследования выявлено сходство в организации геномов ципроф-локсацин-резистентных клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) и референсного штамма M. hominis ATCC 23114 (GenBank FP236530.1). Установлено преобладание в геноме генов, кодирующих белки, участвующие в катаболических процессах, что подтверждает ранее предложенную теорию об ограниченности биосинтетических возможностей M. hominis [1, 6]. В геноме изученных нами клинических изолятов микоплазм обнаружено большое количество нуклеотидных замен, не затрагивающих первичную структуру белка, что свидетельствует об их внутривидовом генетическом и эволюционном разнообразии. Отсутствие у изученных штаммов детерминант резистентности с конъюгативным механизмом передачи объясняет доминирование классического молекулярного механизма устойчивости микоплазм к фторхинолонам (ципрофлок-сацину), а именно, мутаций в области QRDR генов gyrA и parC. Вероятно, обнаруженные нами гены, кодирующие белки системы MATE, в определенных условиях могут обусловливать процессы выведения антибактериальных препаратов из клеток M. hominis. Проведение подобных исследований необходимо как для понимания эволюции M. hominis, так и для оценки структуры генома популяции уро-генитальных микоплазм в целом.
СПИСОК ЛИТЕРAТУРЫ
1. Борхсениус CH., Чернова ОА., Чернов В.М., Вишняков И.Е. Микоплазмы в биологии и медицине начала XXI века. СПб.: ^ука, 2016. 333 с.
2. Белова A3., ^конов A.П. // Aльманах клинической медицины. 2015. № 39. С. 140-150.
3. Заручейнова О.В., Вербов В.К, Семенов КВ. // Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии
к диагностике актуальных инфекций». 2014. Т. 4. № 1. С. 67.
4. Байтяков В.В., Сыркина М.Г., Радаева ОА. // Aкушерство. Гинекология. 2016. Т. 93. № 1. С. 72-75.
5. Lee M.Y., Kim M.H., Lee W., Kim M.H., Lee W.In., Kang So.Y., Jeon Y.La. // Yonsei Med. J. 2016. V. 5. № 57. P. 1271- 275. doi: 10.3349/ymj.2016.57.5.1271
6. Pereyre S., Sirand-Pugnet P., Beven L., Charron A., Renaudin H., Barré A., Avenaud P., Jacob D., Couloux
A., Barbe V., et al. // PLoS Genet. 2009. V. 5. № 10. e1000677. doi: 10.1371/journal.pgen.1000677
7. Колесникова E.A., Бруснигина КФ. // Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию ФБУH HHИИЭМ им. академика И.К Блохиной. Hижегородский HИИ эпидемиологии и микробиологиии им. академика KH. Блохиной. 2014. С. 208-213.
8. Колесникова E.A., Бруснигина КФ., Ефимов Е.И. // Современные технологии в эпидемиологическом надзоре за актуальными инфекциями: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию со дня рождения академика РAМH И.H. Блохиной. 2016. С. 166-173.
9. Колесникова ЕА., Бруснигина КФ., Ефимов Е.И. // Русский медицинский журн. Медицинское обозрение. 2018. № 2(1). С. 4-7.
10. Колесникова ЕА., Бруснигина КФ., Кишоян К.Г. // учное обеспечение противоэпидемической защиты населения: актуальные проблемы и решения: Сборник научных трудов Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием, посвященной 100-летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. 2019. С. 167-170.
11. Okonechnikov K., Golosova О., Fursov М. /У J. Bioinformatics. 2012. № 28. Р. 1166-1167. doi: 10.1093/ bioinformatics/bts091
12. Kumar S., Stecher G., Tamura K. // Mol. Biol. Evol. 2016. V. 33. № 7. P. 1870-1874. doi: 10.1093/molbev/msw054
13. Aziz R.K., Bartels D., Best A.A., DeJongh M., Disz
T., Edwards R.A., Formsma K., Gerdes S., Glass E.M., Kubal M., et al. // BMC Genomics. 2008. V. 9. P. 75. doi: 10.1186/14712164-9-75
14. Bertels F., Silander O.K., Pachkov M.l., Rainey P.B., Nimwegen E. // Mol. Biol. Evol. 2014. V. 31. № 5. P. 1077-1088. doi: 10.1093/molbev/msu088
15. Saitou N., Nei M. // Mol. Biol. Evol. 1987. № 4. P. 406-425. doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454
16. Колесникова Е.А., Бруснигина Н.Ф., Махова М.А., Алексеева А.Е. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018. Т. 20. № 1. С. 68-72.
17. Балакирев Е.С., Айала Ф.Дж. // Журн. общей биологии. 2004. Т. 65. № 4. С. 306-321.
18. Raherison S., Gonzalez P., Renaudin H., Charron A., Bebear C., Bebear C.M. // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2005. V. 49. № 1. Р. 421-429. doi: 10.1128/AAC.49.1.421-424.2005
19. Sun J., Deng Z., Yan A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014. № 453. Р. 254-267. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.05.090
20. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M. // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 1990. V. 34. № 6. Р. 1271-1272. doi: 10.1128/aac.34.6.1271
21. Meng D.Y., Sun C.J., Yu J.B., Ma J., Xue W.C. // Brazilian J. Microbiol. 2014. V. 45. № 1. P. 239-242. doi: 10.1590/s1517-83822014000100034
22. Chernova O.A., Medvedeva E.S., Mouzykantov A.A., Baranova N.B., Chernov V.M. // Acta Naturae. 2016. V. 8. № 2 (29). P. 24-34.
23. Рахматулина М.Р., Кириченко С.В. // Вестник дерматологии и венерологии. 2013. № 3. С. 17-25.
