CC BY
162
"...Структура - функция -терапевтический эффект." (к вопросу о лечебных свойствах генериков и инновационных препаратов на примере центральных холинергических веществ)
Т.Н. Саватеева, П.П. Якуцени, И.Ю. Лукьянова, В.В. Афанасьев
Появление многочисленных лекарственных препаратов, обладающих фармакологической взаимозаменяемостью с оригинальными веществами, поставило проблему биоэквивалентности лекарств в один ряд с самыми злободневными вопросами современной медицины. Для клинической практики главным является вопрос об идентичности генериков и оригинальных препаратов по показателям идентичности их действия (сила действия, время наступления и длительность действия, центральные и периферические эффекты и т.д.). По правилам фармакологии новый генерик без анализа сравнительной фармакологической активности не может рассматриваться в качестве заменителя инновационного средства и автоматически "уравниваться" с ним. На наш взгляд, в случае, если сравниваемые вещества имеют даже минимальные различия по молекулярной структуре, составу растворителя и/или уровню балластных веществ, требуется анализ биоэквивалентности с экспериментальным подтверждением и расчетами, принятыми при количественной оценке фармакологического эффекта.
Цель работы: на моделях острой ишемии сравнить показатели расчетной и экспериментальной оценки биоэквивалентности Глиатилина, церепро и церетона.
Татьяна Николаевна Саватеева - профессор, зав. лабораторией лекарственной токсикологии Института токсикологии ФМБА России, Санкт-Петербург. Павел Павлович Якуцени - профессор, гл. научн. сотр. Центра перспективных исследований Санкт-Петербургского государственного политехнического университета. Ирина Юрьевна Лукьянова - доцент кафедры неотложной медицины Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. Василий Владимирович Афанасьев - профессор кафедры неотложной медицины Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, профессор отдела ангионеврологии ФЦСКЭ им. В.И. Ал-мазова.
Задачи исследования:
1) моделирование структуры и сравнительного физико-химического поведения Глиатилина и его генериков (церепро и церетона) на моделях, представленных биофазами (внешними поверхностями и внутренними участками мембран и потенциальных белков-переносчиков), определяющими массоперенос(транспорт и перераспределение препаратов) с составляющими компонентами биологических мембран, методами молекулярной фармакологии и квантовой механики;
2) проведение сравнительной оценки выраженности специфической фармакологической активности Глиатили-на и его генериков на экспериментальных моделях цирку-ляторной гипоксии и ишемического инсульта с оценкой показателей тяжести процессов.
Материал и методы
Используемые в исследовании препараты: Глиати-лин (холина альфосцерат) (Ка^агтасо & Фармакор, Италия-Россия), серия 09046, годен до 02.2014 г.; церетон (ЗАО "ФармФирма "Сотекс"), серия 010310, годен до 03.2012 г.; церепро (ОАО "Верофарм"), серия 391009, годен до 11.2011 г.
Методы молекулярного моделирования, использованные в работе: объектами исследования являлись изолированная молекула глицерилфосфорилхолина (ГФХ) и две его формы, гидратная (церепро, церетон) и фосфатная (Глиатилин), имеющие брутто-формулу С8Н20М06Р ■ Н3Р04. В качестве факторов, определяющих транспорт и перераспределение анализируемых веществ, рассматривались: водная фаза плазмы крови и межклеточной жидкости; полярные и гидрофобные области липидного бислоя; белки, способные участвовать в переносе рассматриваемых веществ.
При расчетах свободных энергий переноса препаратов между этими фазами учитывались электростатические
взаимодействия водородных и ван-дер-ваальсовых связей, а также результирующие гидрофобные взаимодействия.
Наличие воды принималось в косвенном приближении моделей сплошной среды COSMO или моделировалось непосредственно на атомно-молекулярном уровне. Расчеты проводились стандартными методами молекулярной механики основных силовых полей MM2, MMF94x и квантовой механики, полуэмпирическими методами PM5, PM6. Поиск устойчивых конформаций изолированных молекул ГФХ проводился в диапазоне 5 или 7 ккал/моль от найденного глобального минимума. Симуляция взаимного расположения взаимодействующих молекулярных структур осуществлялась комбинациями методов систематического перебора, молекулярной динамики и минимизации без ограничений диапазона поиска.
Использованный метод позволяет рассчитывать молекулярную конфигурацию препаратов, оценивать их физико-химические свойства и массоперенос веществ через биологические мембраны, что дает возможность судить об их распределении, силе центрального действия и фарма-кокинетике в целом.
Экспериментальная часть исследования выполнена на 80 половозрелых мышах-самцах массой 20-25 г и 60 половозрелых крысах-самцах линии Sprague-Dawley с массой 200-220 г, выращенных в питомнике РАН "Рапполо-во". Перед экспериментом животных подвергали 14-дневному карантину и рандомизации. Метки и индивидуальные номера животных регистрировали в протоколах лабораторных испытаний. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе. Эксперименты выполняли согласно требованиям этического комитета [1, 2]. Контрольным группам животных вводили внутривенно очищенную воду - 10 мл/кг.
Максимальная суточная доза препаратов составляет 1000 мг pro dosi для человека, или 14,3 мг/кг. Учитывая коэффициенты переноса доз с человека на грызунов, крысам препараты вводили в дозе 93 мг/кг внутривенно в течение 7 дней, а мышам - в дозе 187 мг/кг внутривенно однократно за 30 мин до помещения в центрифугу.
Модели, использованные в работе.
1. Модель острой циркуляторной гипоксии (гравитационные перегрузки). Продольные гравитационные перегрузки, создаваемые центрифугой, вызывают нарушения кровообращения головного мозга, тяжесть и характер которых зависят от величины, продолжительности и вектора радиальных ускорений. При краниокаудальном векторе ускорений (положительное радиальное ускорение) происходит перемещение крови в каудальном направлении и возникает ишемия мозга в результате падения артериального давления во всех сосудах головы. Циркуляторную гипоксию моделировали с помощью гравитационных перегрузок в краниокаудальном направлении. Величину гравитационных перегрузок подбирали так, чтобы летальность животных (мышей-самцов) в контрольной группе превышала 50%, что составляло 18 g в течение 10 мин.
Градиент нарастания и спада нагрузки составлял 0,30-0,33 д/с [3].
2. Модель локальной ишемии головного мозга у крыс, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий, осуществляли путем тотальной перевязки сонных артерий у крыс под эфирным наркозом [3]. Операцию проводили с соблюдением правил асептики в стерильных условиях. Артерии выделяли и лигировали капроновой нитью, после чего рану ушивали послойно. Швы на коже обрабатывали 5% раствором йода и хлоргексидином. В течение 4 ч после операции из 60 прооперированных животных умерло 23. Выживших крыс распределяли случайным образом на 4 группы:
1) контроль патологии (плацебо, терапия физиологическим раствором натрия хлорида в дозе 1 мл/100 г) -7 особей;
2) препарат Глиатилин - 10 особей;
3) препарат церетон - 10 особей;
4) препарат церепро - 10 особей.
Во всех группах проводили терапию указанными растворами в объеме 1 мл/100 г массы тела путем медленного внутривенного введения в дорсальную хвостовую вену иммобилизированным в пеналах крысам. Каждая суточная доза исследуемых препаратов была введена в 3 приема.
Для оценки влияния препаратов на восстановление животных в постреанимационном периоде после перевязки сонных артерий разработаны методы оценки общего состояния животных [4]. Однако авторы этих работ признают, что уже к концу 1-х суток существенных отличий от интакт-ных животных не выявляется. Поэтому в нашем исследовании для оценки состояния животных мы выполняли углубленное тестирование неврологических функций, исследовали вегетативные показатели и сравнивали двигательную активность в "открытом поле". Полученные результаты были дополнены биохимическими методами исследования.
Клиническую картину оценивали прежде всего по показателям деятельности нервной системы на разных уровнях: спинной мозг (рефлекс сгибания задней конечности), продолговатый мозг (аудиомоторная реакция, роговичный рефлекс, глоточный рефлекс), варолиев мост и средний мозг (рефлексы переворачивания и равновесия, зрачковые реакции), кора головного мозга (тесты для исследования равновесия). Для комплексной оценки деятельности нервной системы исследовали поведение животных и реакцию на пищевой стимул [4, 5].
Оценку неврологического статуса экспериментальных животных проводили следующим образом.
1. Поведение животных. Оценивалось методом наблюдения за поведением крысы при нахождении ее в клетке и взятии в руки. Взятие в руки и помещение животного на поверхность позволило исключить у животных состояние сна. В норме отмечалась двигательная активность, сохранение позы, активная деятельность (груминг, принятие пищи и др.); сон, при взятии в руки активная целенаправленная деятельность.
> 2*2011 www.atmosphere-ph.ru
2. Реакция на обонятельный (пищевой) раздражитель. В качестве раздражителя использовали шоколад. В норме животные реагировали на предъявляемый раздражитель, точно локализуя его.
3. Аудиомоторная реакция (реакция вздрагивания на звуковой раздражитель). Крысу помещали на открытую площадку, затем подавали сильный звуковой раздражитель (громкий хлопок руками). В норме крыса реагировала мгновенным вытягиванием задних конечностей, сгибанием передних конечностей и выгибанием спины. Глаза животного закрыты, а уши прижаты назад.
4. Поисковая реакция. Животное переносили на открытую поверхность и наблюдали за реакцией. В норме поведение животных было ориентировано на физическое окружение новой для них территории, крысы активно исследовали ее. Это поведение включало локомоцию с принюхиванием, подъемы на задние лапы с принюхиванием, заглядывание в различные отверстия.
5. Рефлекс хватания за решетку. Крысу сажали на проволочную решетку, а затем пытались снять животное с решетки. В норме при поднятии животного сила держания за решетку увеличивалась.
6. Рефлекс переворачивания. Животное помещали на плоскую поверхность спиной вниз, нормальная реакция характеризовалась быстрым переворачиванием (крыса становилась на четыре лапы).
7. Тонус мышц. При взятии животного в руки оценивалось состояние мышечного тонуса, при этом в норме выявлялся упругий тонус брюшной стенки и умеренный тонус конечностей.
8. Тестирование равновесия на наклонной поверхности. Животное головой книзу помещали на решетчатую платформу, наклоненную под углом 30°. В норме крыса быстро поворачивалась мордочкой к верхней части платформы.
9. Тестирование равновесия на горизонтальном стержне (без вращения). Животное помещали на горизонтальный деревянный цилиндр диаметром 2 см и длиной 30 см, закрепленный на высоте 50 см над полом. Здоровое животное может просидеть на бруске 3 мин и более. В нашем исследовании тест считался выполненным, если животное находилось на бруске в течение 30 с.
10. Нарушение координации (атаксия). Оценивалось визуально по характеру движений.
11. Проба на нашатырный спирт. В норме на вдыхание нашатырного спирта крысы реагировали активным избеганием раздражителя.
12. Тактильно-болевая чувствительность. Оценивалась путем сжатия хвоста пинцетом. В норме животное локализовало источник боли - с резким поворачиванием в сторону болевого стимула или реакцией избегания.
13. Рефлекс сгибания задних конечностей. Оценивался путем сжатия пинцетом пальцев задних конечностей, при этом ступня немедленно отдергивалась и конечность ненадолго оставалась в согнутом положении. Интенсивность реакции пропорциональна интенсивности стимула.
14. Состояние зрачков. При рассеянном освещении размер зрачка у животных составлял около 2 мм.
15. Зрачковый рефлекс. В норме после усиления яркости света (фонариком) отмечалось быстрое сокращение зрачка, уменьшение уровня интенсивности освещения приводило к обратному эффекту.
16. Корнеальный рефлекс. Зафиксированному животному осторожно прикасались к роговице волоском. В норме крыса быстро смыкала веки, и они на некоторое время оставались закрытыми.
17. Глоточный рефлекс. Раздражение внутрижелудоч-ным зондом корня языка и глотки крысы приводило к сгла-тыванию.
Неврологические показатели были разделены по степени тяжести и выражены в баллах:
• поведение животных: активная деятельность (груминг, принятие пищи и др.), сон, активные целенаправленные реакции при взятии в руки - 4 балла; лежит, при взятии в руки движения замедленные, но сохраняется их целенаправленность к избеганию, поворот головы - 3 балла; лежит на животе или боковое положение, при взятии в руки движения нецеленаправленные - 2 балла; лежит на животе или боковое положение, при взятии в руки движения отсутствуют - 1 балл;
• реакция на обонятельный (пищевой) раздражитель (шоколад): активная, с движением, точная ориентация к стимулу - 3 балла; ослабленная реакция в виде поворота головы с движением по направлению к стимулу - 2 балла; отсутствует - 1 балл;
• аудиомоторная реакция: выражена (проявляется реакцией избегания, вытягиванием задних конечностей, сгибанием передних конечностей, выгибанием спины) -3 балла; ослаблена (в том числе сокращением круговой мышцы глаза) - 2 балла; отсутствует - 1 балл;
• поисковая реакция: активная деятельность (обнюхивание, двигательная активность) - 3 балла; сидит, поисковая реакция не выражена - 2 балла; поисковая реакция отсутствует, лежит на животе или боковое положение - 1 балл;
• рефлекс хватания за решетку: выражен (при поднятии крысы сила держания возрастает) - 3 балла; снижен -2 балла; отсутствует - 1 балл;
• рефлекс переворачивания: сохранен - 4 балла; замедлен - 3 балла; отсутствие переворачивания при сохраненных попытках - 2 балла; отсутствует - 1 балл;
• тонус мышц: нормальный тонус (упругий тонус брюшной стенки, тонус конечностей умеренный) - 3 балла; дисто-нус (снижен или повышен) - 2 балла; атония - 1 балл;
• тестирование равновесия на наклонной поверхности: животное быстро поворачивается мордочкой к верхней части платформы или обследует платформу - 4 балла; замедленно переворачивается, сидит или лежит, отдельные целенаправленные движения - 3 балла; отсутствует переворачивание, могут быть некоординированные движения - 2 балла; отсутствуют движения, боковое положение - 1 балл;
• тестирование равновесия на горизонтальном стержне (без вращения): животное сидит более 30 с - 3 балла; животное неуклюже выполняет данный тест и быстро падает (менее 30 с) - 2 балла; не выполняет тест (падает), не удается посадить на стержень - 1 балл;
• нарушение координации (атаксия): отсутствует - 3 балла; отмечается атаксия - 2 балла; невозможно проверить (отсутствие движений, боковое положение) - 1 балл;
• проба на раствор аммиака: выраженная реакция на раздражитель в виде избегания - 3 балла; ослабленная реакция, сохранен чихательный рефлекс - 2 балла; отсутствует - 1 балл;
• тактильно-болевая чувствительность: реагирует на одиночное воздействие агрессией или избеганием - 4 балла; слабая реакция в виде отползания или поворота - 3 балла; нелокализованный ответ, в том числе в виде сокращения брюшной стенки - 2 балла; отсутствует - 1 балл;
• рефлекс сгибания задних конечностей: быстрое сгибание ступни, которое ненадолго сохраняется, - 4 балла; замедленное сгибание ступни, которое длительно сохраняется, - 3 балла; отсутствие сгибания ступни после одиночного стимула, нелокализованный ответ в виде сокращения брюшной стенки - 2 балла; отсутствует, даже после многократного стимула - 1 балл;
• состояние зрачков: норма - 2 балла; миоз или мидриаз -
1 балл;
• зрачковый рефлекс (реакция зрачков на свет): выраженный - 3 балла; ослаблен - 2 балла; отсутствует - 1 балл;
• мидриаз и отсутствие зрачкового рефлекса: сочетание мидриаза и отсутствия реакции зрачка не выявляется -
2 балла; зрачок расширен и на свет не реагирует - 1 балл;
• корнеальный рефлекс: выражен - 3 балла; ослаблен -2 балла; отсутствует - 1 балл;
• глоточный рефлекс: выражен - 3 балла; ослаблен -2 балла; отсутствует - 1 балл.
Полученные результаты неврологического тестирования животных суммировали и использовали для дальнейшего статистического анализа.
0
Вегетативные показатели определяли путем визуального подсчета частоты дыхательных движений, выражали в количестве движений в 1 мин. Для получения сведений о регуляции температуры тела как одного из основных параметров гомеостаза определяли ректальную температуру с помощью прибора ТПЭМ-1.
Биохимические показатели оксидативного стресса оценивали методом определения малонового диальдеги-да (МДА) в головном мозге крыс. Для определения уровня МДА к 0,15 г гомогената коры мозга добавляли 1,5 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты и 0,5 мл 0,6% раствора тиобарбитуровой кислоты (2'-ТБК). Полученную смесь помещали в кипящую водяную баню на 45 мин. После охлаждения проб цветной комплекс в течение 10 мин экстрагировали в 2,0 мл n-бутанола. Оптическую плотность окрашенного бутанольного экстракта определяли на спектрофотометре при трех длинах волн: 440, 532 и 600 нм против контроля, где вместо гомогената вносили 0,15 мл 0,9% раствора NaCl.
Расчет уровня МДА (нмоль/мг) проводили по формуле
СТБК-РП = [[(Ao532 - Ao600) - (Ak532 - Ak600) -- ((Ao440 - Ao600) x0,0571)]/157000] x 106,
где Ao - абсорбция опытной пробы при указанной длине волны, Ak - абсорбция контрольной пробы при указанной длине волны, ТБК-РП - ТБК-реактивные продукты, 0,0571 -поправочный коэффициент, 157000 - коэффициент молярной экстинции аддукта МДА с ТБК, 106 - коэффициент перевода молярной экстинции в наномоли на 1 мг ткани.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакетов программ Excel, Graph Pad Prism, Mebistat. Различия между выборками оценивали с помощью критерия t Стьюдента и ф-критерия Фишера.
Результаты исследования
Аналитическая часть
Анализ позиционирования молекулы ГФХ. Рассмотрение структуры изолированной молекулы позволяет констатировать, что глицерилфосфорилхолин является соединением, обладающим выраженными гидрофильными свойствами (Log Po/w = -5,15), что определяется наличием двух гидроксильных OH-групп, полярной и легкоио-низируемой фосфорсодержащей группировки и положительно заряженного фрагмента четвертичного азота (левая, средняя и правая части молекулы соответственно, рис. 1).
В гидратной форме вещества (C8H20NO6P ■ nH2O) молекула ГФХ связывается с несколькими молекулами воды. Фосфатная форма (C8H20NO6P ■ H3PO4) представляет собой молекулярный комплекс ГФХ с фосфатом, замещающим часть водной оболочки гидрата.
С точки зрения своего пространственного строения ГФХ является конформационно гибкой молекулой.
Общее число устойчивых вариантов ее пространственного строения в зависимости от метода поиска колеблется
Рис. 1. Структурная формула L-альфа-глицерилфосфо-рилхолина. Представлен фармакологически активный оптический ^)-изомер. Стрелками показаны возможности внутримолекулярных вращений, определяющих возникновение множества конформаций, представляющих варианты пространственного строения молекулы.
N
от 250 до 700 конформеров. Расчеты молекулярной и квантовой механики показывают, что правая часть молекулы ГФХ (см. рис. 1) принимает энергетически выгодные состояния, свойственные основным конформациям фосфа-тидилхолина и других фосфолипидов биомембран. В частности, фосфорно-азотный фрагмент молекулы чаще всего принимает характерную для фосфолипидов так называемую клешнеобразную конформацию (рис. 2).
В левой части молекулы наблюдаются два предпочтительных конформационных семейства. В первом из них пространственное строение молекулы оказывается подобным строению липидов (см. рис. 2). В другом появляются квазициклические конформации, обусловленные внутримолекулярными водородными связями между ОН-группа-ми левой части молекулы с фосфорсодержащим фрагментом (рис. 3).
Доли липидоподобных и квазициклических конформа-ций изолированных молекул сбалансированы, так как выгода от образования внутримолекулярных водородных связей требует энтропийно невыгодной остановки вращений вдоль шести валентных связей молекулы (см. рис. 1, левая часть молекулы).
Анализ позиционирования молекулы ГФХ гидрата. В полярной среде у кислородсодержащих групп ГФХ возникает возможность образования водородных связей с ближайшими молекулами окружения. Расчеты показывают, что в водной фазе первая сольватная оболочка ГФХ состоит из 20-30 молекул воды. Около 4-5 из них связаны с энергией до 5 ккал/моль, т.е. особенно интенсивно, что соответствует случаю гидрата ГФХ (С8Н20М06Р ■ пН20). При взаимодействии с полярными фрагментами фосфолипи-дов начинается обобществление и частичное вытеснение молекул гидратной воды. В средах с низким рН (жидкость оригинальной субстанции или гидрофобная фаза углеводородных цепочек липидных мембран, см. рис. 2) реализуется и случай моногидрата. То есть происходит преимущественное связывание одиночной молекулы воды, а энергия взаимодействия с фосфорной и частично азотной группировками ГФХ превышает 6-7 ккал/моль.
Наличие межмолекулярных взаимодействий с водой или полярными фрагментами фосфолипидов конкурентно снижает вероятность образования внутримолекулярных связей. Доля квазициклически свернутых состояний снижается, а вероятность возникновения липидоподобных конформаций растет. На участке полярной части бислоя гидратная форма молекулы ГФХ оказывается идентичной формуле липидов (см. рис. 2), а следовательно, может распознаваться этой частью мембраны и избирательно накапливаться в ней. В гидрофобной части мембраны диссоциация воды оказывается невыгодной, сохраняется форма моногидрата, что частично экранирует отрицательный заряд фосфорной группировки молекулы ГФХ. Распределение электронной плотности на положительно заряженной группировке четвертичного азота (рис. 4, см. рис. 1) остается практически неизменным.
Рис. 2. Устойчивая конформация молекулы ГФХ, соответствующая пространственному строению фосфати-дилхолина в молекулярном кристалле. В реальной мембране молекулы внутренне и взаимно подвижны, что приводит к появлению многочисленных дефектов идеализированной структуры мембраны.
Рис. 3. Пример квазициклической конформации молекулы ГФХ, стабилизированной внутренними водородными связями (показаны пунктирными линиями).
Рис. 4. Распределение электронной плотности изолированной молекулы ГФХ (слева) и ГФХ моногидрата (справа). Объемность правой части молекулы показывает распределение неизменно выраженного положительного заряда в области четвертичного азота 1\Г(СН3)3. Видно, что в левой и центральной части гид-ратного комплекса отрицательные заряды гидроксиль-ных ОН-групп и фосфорной группировки РО- оказываются частично компенсированными.
Рис. 5. Пространственное строение ГФХ фосфата. Вариант взаимодействия привнесенного фосфата с азотной группировкой молекулы.
Таблица 1. Влияние изучаемых препаратов на устойчивость мышей-самцов к циркуляторной гипоксии (гравитационные перегрузки)
Изучаемые показатели Экспериментальные группы
контроль Глиатилин церепро церетон
Погибло/всего 13/20 6/20 7/20 8/20
Гибель, % 65 30 35 40
Выживаемость, % 35 70* 65* 60*
* р < 0,05 по отношению к контролю.
Анализ позиционирования молекулы ГФХ фосфата. Моделирование структуры фосфата ГФХ дает два основных варианта строения комплекса. В одном из них при-
Рис. 6. Пространственное строение комплекса ГФХ фосфата с боковым предлежанием.
Рис. 7. Распределение электронной плотности в комплексах ГФХ фосфата. С левой части молекулы - комплекс с торцевым прилеганием фосфата, справа - с боковым. Видно,что в сравнении с изолированной молекулой ГФХ или ГФХ моногидратом в структуре фосфатного комплекса заряды гидроксильных ОН-групп и фосфорной группировки РО- оказываются еще более скомпенсированными, а распределение выраженного положительного заряда в области четвертичного азота 1\Г(СН3)3 практически исчезает.
60 -
40 - __
20 -
0-^-^-^-
Контроль Глиатилин Церепро Церетон
Рис. 8. Частота развития птоза (%) после лечения Глиа-тилином, церепро и церетоном (крысы, ОНМК, М ± т).
внесенный фосфат располагается в правом конце молекулы ГФХ вблизи положительно заряженного фрагмента четвертичного азота (рис. 5). В другом варианте наблюдается боковое прилегание фосфата к молекуле ГФХ (рис. 6).
В классическом расчете электростатики первый из этих вариантов - случай торцевого прилегания фосфата -определяется преимущественно электростатическими взаимодействиями между положительным зарядом азота и отрицательным зарядом фосфата. В гидрофобной среде стабильность такой структуры не вызывает сомнений. В полярной фазе интенсивность взаимодействий между зарядами резко снижается, что предопределяет ее распад. В случае бокового прилегания фосфат также остается способным вступать в электростатическое взаимодействие с азотом, а взаимное отталкивание сближающихся отрицательно заряженных фосфорных групп компенсируется возникновением нескольких водородных связей, показанных на рис. 6. Привнесенная фосфатная группа взаимодействует с азотсодержащей, форсфорной группами и ОН- группой. Такой вид комплекса имеет около 36 вариантов строения, что сохраняет возможности конформацион-ных вращений ГФХ, и должен существовать как в гидрофобной, так и в полярной среде.
Результаты расчетов квантовой механики показывают, что энергия образования обсуждаемых комплексов превышает 10 ккал/моль, это свидетельствует о высокой стабильности связывания ГФХ с фосфатом и малой вероятности самопроизвольного превращения фосфата в гидрат. Кроме того, формирование комплексов как с торцевым, так и с боковым прилеганием фосфата не ограничивает внутримолекулярной подвижности молекулы ГФХ, что позволяет ему принимать как липидоподобные, так и свернутые, квазициклические конформации. И наконец, выясняется, что образование фосфатного комплекса означает существенное перестроение электронной плотности взаимодействующих молекул, приводящее к практически полной нейтрализации положительного заряда в области четвертичного азота (рис. 7), т.е. главного фактора, препятствующего транспорту ГФХ через гематоэнцефаличес-кий барьер.
В целом в результате сравнительного рассмотрения гидратного и фосфатного комплексов ГФХ можно констатировать следующие основные обстоятельства.
Гидратные формы ГФХ преимущественно принимают частично вытянутые, липидоподобные конформации. Полярность гидроксил- и фосфорсодержащего фрагментов оказываются частично компенсированы взаимодействиями с молекулами воды гидратной оболочки.
Фосфатная форма ГФХ отличается достоверно большей стабильностью. Молекула ГФХ способна принимать как частично вытянутые (см. рис. 5), так и свернутые конформации (см. рис. 6). Взаимодействие молекулы ГФХ с привнесенным фосфатом обеспечивает компенсацию полярности не только гидроксил- или фосфорсодержащих фрагментов, но и четвертичного азота М+(СН3)3.
N
Экспериментальная часть
Влияние Глиатилина, церепро и церетона на переносимость циркуляторной гипоксии (гравитационные перегрузки). Полученные результаты представлены в табл. 1. Каждая экспериментальная группа содержала по 20 особей. Как следует из данных, представленных в таблице, введение как Глиатилина, так и его генериков привело к увеличению выживаемости животных по сравнению с показателями в контрольной группе мышей, что свидетельствует о наличии протекторной активности в условиях ишемии головного мозга, вызванной гравитационными перегрузками. Достоверных различий в эффективности препаратов в данной модели ишемии не выявлено.
Оценка нейропротективной активности препаратов в условиях локальной ишемии головного мозга у крыс, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий. Эксперименты выполнены на крысах, перенесших тотальную перевязку сонных артерий. В каждой группе после начала введения изучаемых растворов погибло еще по 1 крысе. В контрольной группе на фоне введения воды гибель животного наступила в течение 1-2 мин после первого введения. В группах, получавших изучаемые препараты, животные погибали в течение 2 ч после окончания терапии.
По результатам оценки состояния животных с использованием разработанной балльной системы не выявлено существенных различий в показателях у животных из группы негативного контроля и у животных, получавших изучаемые препараты (табл. 2).
Одним из очаговых неврологических симптомов, характеризующих наличие последствий острой ишемии мозга, является развитие птоза. У прооперированных животных, не получавших лечения, развился птоз правого или левого глаза в 100% случаев. Применение всех препаратов привело к достоверному снижению процента животных с данной патологией (регистрация после окончания терапии). Максимальную эффективность при этом проявил Глиатилин (рис. 8). Так, при лечении острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) птоз в группе животных "Глиатилин" развивался в 2 раза реже, чем в группе "церепро" (р < 0,05), и в 2,4 раза реже, чем в группе "цере-тон" (р < 0,01).
Данные о восстановлении температуры тела животных после лечения Глиатилином, церепро и церетоном представлены на рис. 9.
Данные по влиянию препаратов на функцию дыхания и систему терморегуляции представлены в табл. 3. У животных, перенесших операцию и ОНМК, снижались частота дыхания и температура тела. Как следует из данных, представленных выше, у животных, получавших Глиатилин, вегетативные показатели (частота дыхательных движений и температура тела) были достоверно выше, чем у крыс из группы контроля, что свидетельствует о восстановлении систем терморегуляции и дыхания (уровень показателей при этом не выходил за пределы обобщенного контроля
37,5
37,0
О
36,5
36,0
35,5
Вариант Контроль Глиатилин Церепро Церетон нормы
Рис. 9. Восстановление температуры тела животных после лечения Глиатилином, церепро и церетоном (крысы, ОНМК, М ± т).
? 6
З2 2 1
Вариант Контроль Глиатилин Церепро Церетон нормы
Рис. 10. Концентрация ТБК-РП (МДА, в нмоль/мг ткани) при лечении Глиатилином, церепро и церетоном (крысы, ОНМК, М ± т [^2]. Л - р < 0,001 по отношению к обобщенному контролю (интактные животные); * - р < 0,001 по отношению к контролю; t - р < 0,05 по отношению к церепро и церетону.
нормы и данных собственных исследований). В случае препаратов церепро и церетон изменения данных показателей носили лишь характер тенденции.
Таблица 2. Результаты неврологического тестирования, в баллах (М ± т)
Экспериментальные группы Неврологический статус
Контроль 56,75 ± 0,25
Глиатилин 56,60 ± 0,38
Церепро 56,90 ± 0,23
Церетон 56,82 ± 0,36
Таблица 3. Влияние препаратов на частоту дыхания и температуру тела (М ± т)
Экспериментальные группы Частота дыхания, в 1 мин Ректальная температура, °С
Обобщенный 126,3 ± 14,1 37,2 ± 0,2
контроль в фоне
Контроль 88,5 ± 11,3* 36,3 ± 0,1*
Глиатилин 111,8 ± 5,9** 37,0 ± 0,2**
Церепро 99,8 ± 10,3 36,7 ± 0,1
Церетон 98,7 ± 9,4 36,7 ± 0,2
* р < 0,05 по отношению к обобщенному контролю (интактные
животные). ** р < 0,05 по отношению к контролю.
Рис. 11. Строение липидной мембраны, мембранооб-разующего липида фосфатидилхолина и структурирования в нее глицерилфосфохолина. а - молекула фос-фатидилхолина (1,2-с1^еагоу1-8п-д1усего1-3-рЬю8рЬю-сИоИпе). Показан биологически значимый L-стереоизо-мер. Центр и тип оптической асимметрии обозначен как Степень ионизации фосфорсодержащей группы может различаться; б - условное изображение фосфо-липидов, принятое для иллюстраций. В составе липид-ных мембран область полярных головок липидов содержит большое количество молекул воды и различных биологических ионов. Сами полярные головки находятся в электростатической, водородной или катионной связи. Между полярными группами липидов могут образовываться водородные мостики сложной конфигурации; в - организация липидного бислоя клеточной мембраны. Полярные головки показаны серыми кружками. Алкильные цепочки липидов находятся в гидрофобном взаимодействии и формируют область, препятствующую всасыванию гидрофильных веществ в клетку; г -ГФХ, фармакологически активный L-стереоизомер.
Операция по перевязке сонных артерий обусловила активацию свободнорадикальных процессов в ткани мозга, а именно наблюдалось значимое увеличение уровня ТБК-ре-активных продуктов, в частности МДА. Как следует из данных, представленных на рис. 10, терапия всеми препаратами способствовала уменьшению выраженности окислительного стресса и снижению уровня МДА в ткани мозга. Максимальную эффективность в отношении данного пока-
зателя перекисного окисления липидов продемонстрировал Глиатилин.
Обсуждение
Основным способом всасывания и проникновения лекарственных веществ является пассивная диффузия сквозь липидные мембраны. При моделировании этого процесса мембрану представляют в виде бислоя, образованного молекулами фосфолипидов, внутри которого выделяют полярную зону липидов (рис. 11а, верхняя часть молекулы, содержащая атомы фосфора, азота и кислорода) и внутреннюю гидрофобную зону длинных углеводородных цепочек (см. рис. 11а, нижняя часть молекулы).
Глицерилфосфорилхолин содержит 6 атомов кислорода и 2 гидроксильных водорода (рис. 11г, см. рис. 1). В воде или другой полярной среде каждый из перечисленных атомов будет участвовать в образовании сетей водородных связей с кислород-, азотсодержащими или иными до-норно-акцепторными группами молекул своего окружения. Возникновение каждой связи означает энергетический выигрыш в 3-5 ккал/моль. В зоне длинных углеводородных цепочек фосфолипидов (см. рис. 11а) водородные связи не возникают и перенос ГФХ, как и других полярных веществ, в гидрофобную зону мембраны оказывается энергетически невыгодным. Потеря каждых 3-5 ккал/моль означает снижение скорости массопереноса препарата примерно в 1000 раз. Общее число образуемых водородных связей ГФХ с молекулами полярного окружения определяется двумя гидроксильными группировками-донорами водородной связи и шестью кислородами-акцептора-ми, что должно на порядки снижать вероятность переноса вещества через мембрану.
Другим фактором, запрещающим транспорт через бислой ГФХ и других подобных соединений, являются электростатические взаимодействия. Известно, что группировка Ы+(СН3)3 несет положительный заряд, объемно распределенный вокруг атомов водорода СН3-групп. В воде или полярной части мембраны этот заряд притягивается электроотрицательными атомами кислорода молекул воды или отрицательно заряженными фосфорными фрагментами полярных головок липидов. Отрицательно ионизированный фосфорный фрагмент ГФХ, в свою очередь, взаимодействует с противоположно поляризованными атомами водорода молекул воды или положительно заряженными азотсодержащими фрагментами головок липи-дов. Возникающее кулоновское притяжение определяет предпочтительность нахождения ГФХ в полярной среде. Например, энергия переноса Ы+(СН3)3 в гидрофобную зону мембраны составляет уже более 10 ккал/моль, что фактически отменяет процесс переноса через мембраны веществ, содержащих ионизованные группировки.
В целом оказывается, что молекула ГФХ выступает в качестве участника образования водородных связей (см. рис. 1, левая и центральная часть молекул), обладает отрицательно ионизованным фосфорным фрагментом (сред-
N
няя часть) и несет положительный заряд на группировке азота (правая часть молекулы), а следовательно, не должна всасываться через гематоэнцефалический барьер.
С другой стороны, эффективность транспорта через этот барьер зависит от произведения разности концентраций переносимых веществ до и после мембраны и вероятности их перехода из одной части мембраны в другую.
В результате структурного и конформационного анализа рассматриваемых веществ ГФХ оказывается близким аналогом полярного фрагмента липидов. В частности, структурно молекула ГФХ является точным аналогом полярной части наиболее типичного мембранообразующего липида - фосфатидилхолина (см. рис. 2а и 2д); с точки зрения стереоизомерии ГФХ оказывается полностью идентичным фосфолипидам клеточных мембран человека; выясняется, что в полярной части мембраны ГФХ гидрат и ГФХ фосфат принимают конформации, свойственные липидам. Это обстоятельство означает, что ГФХ по всем показателям оказывается соединением, способным избирательно накапливаться в гидрофильной зоне липидных мембран, что увеличивает его эффективную концентрацию перед гидрофобным барьером, является первым фактором, компенсирующим затруднения фармакокинетики, связанные с гидрофильностью вещества. Кроме того, при этом возникает возможность для альтернативного транспорта, продольной диффузии ГФХ, обеспечивающей равномерное распределение препарата вокруг всей внешней поверхности клеток в обход проникновения молекул через внутриклеточную среду. Возможности переноса молекулы с клетки на клетку могут быть связаны с морфологией клеточного контакта или с прямыми перескоками молекул, обусловленными отсутствием у ГФХ длинных углеводородных цепочек, а следовательно, не слишком избыточной энергией мембранного связывания вещества.
Вторая группа факторов, описываемая в традиционной модели транспорта сквозь липидный барьер, связана с тем, что межмолекулярные водородные связи препятствуют переходу из полярной в неполярную часть мембраны. При этом переходе ГФХ в форме фосфата и в меньшей степени гидрата сворачивается в те конформации, где возникновение внутренних водородных связей вместо межмолекулярных увеличивает вероятность переноса через барьер.
При рассмотрении электростатических взаимодействий было установлено, что в составе гидратного комплекса ГФХ выраженность зарядов и в левой, и в центральной фосфорсодержащей части молекулы ниже, чем в ГФХ. При этом в ГФХ фосфате степень присутствия зарядов снижается во всех трех гидрофильных фрагментах, включая группировку азота Ы+(СН3)3, что практически отменяет запрет на перенос вещества через гематоэнцефалический барьер. То есть вместо периферического распределения ГФХ фосфата увеличивается его поступление в мозг.
Третьей группой фармакокинетических факторов являются возможные белки-переносчики. У ЭассИаготусев
cerevisiae известен транспортер глицерофосфоинозито-ла/глицерофосфохолина [6], участвующий в захвате и переносе ГФХ через плазматическую мембрану внутрь клетки. У человека наличие таких транспортеров только предполагается. В любом случае транспорт, связанный с белком-переносчиком, может явиться альтернативой или дополнением к пассивной диффузии лекарственных веществ через мембраны. Однако в соответствии с законами электростатики оказывается, что связывание ионизованных или цвиттер-ионных соединений на поверхности переносчика только частично облегчает транспорт соединений (облегченная диффузия с переносчиком), а связывание "заряженных" веществ в глубине переносчика требует существенных энергетических затрат, необходимых для активного транспорта через мембрану. Исходя из общих соображений следует констатировать, что фосфатная форма ГФХ может иметь преимущества и в случае транспорта вещества, опосредованного белками.
И наконец, четвертая группа фармакокинетических факторов связана с биотрансформацией формы гидрата в фосфат. При молекулярном моделировании различающихся форм ГФХ мы констатировали энергетическую предпочтительность комплекса ГФХ фосфата. В норме в крови человека присутствует количество свободных фосфатов, сравнимое с диапазоном применяемых доз препаратов. Для гидратных форм ГФХ (церепро, церетон) можно ожидать in vivo их самопроизвольного превращения в фосфат. При этом полная биотрансформация фактически полностью исчерпывает резерв свободных фосфатов в крови и протекает во времени, в течение которого большая часть препарата оказывает преимущественно периферические эффекты.
Выводы
1. В результате структурно-конформационного анализа ГФХ показано, что он способен связываться с полярной частью мембраны, при этом возникает эффект предбарь-ерной концентрации вещества, способствующий его транспорту к центральным и другим, забарьерным мишеням головного мозга.
2. Внутримолекулярная подвижность ГФХ обеспечивает возникновение таких свернутых конформаций, которые компенсируют его гидрофильные свойства и способствуют его прохождению через гидрофобные части липидных мембран. Такие квазициклические конформации особенно выражены у фосфатной формы ГФХ.
3. В отличие от гидратной формы ГФХ фосфатная форма обеспечивает более эффективную нейтрализацию полярных свойств гидрофильных группировок, что определяет преимущества поступления в центральную нервную систему для ГФХ фосфата.
4. Комплекс ГФХ фосфата оказывается достаточно стабильным, что практически затрудняет самопроизвольное внеэнзиматическое превращение фосфатной формы в гидратную. Напротив, частичное превращение в
организме гидратных форм в фосфатные весьма вероятно.
5. При экспериментальной оценке биоэквивалентности на модели циркуляторной гипоксии (гравитационные перегрузки) у мышей установлено отсутствие достоверных различий в балльной оценке показателей в контрольной группе животных, а также в группах "Глиатилин", "церепро" и "церетон".
6. У крыс, перенесших острую церебральную ишемию, Глиатилин в наибольшей степени препятствует развитию очаговой симптоматики и предотвращает птоз у 67% животных (церепро - у 33%, церетон - у 22%), причем различий по частоте дыхания выявлено не было.
7. У крыс, перенесших острую церебральную ишемию, Глиатилин в наибольшей степени препятствует снижению ректальной температуры по сравнению с показателем у
нелеченых животных (8% - группа "Глиатилин" и 2% - группы "церепро" и "церетон").
Список литературы
1. Porter D.G. // Nature. 1992. V. 356. P. 101.
2. Public Health Service on Human Care and Use of Laboratory Animals. Washington, 1996.
3. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств. Одобрены ФК МЗ СССР 11.04.90 г., приказ № 7. М., 1990.
4. Лысенков С.П. и др. // Клиника, патогенез и лечение неотложных состояний: Науч. тр. Новосибирск, 1982. С. 8-13.
5. Буреш Я. и др. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Пер. с англ. Е.Н. Живописцевой. М., 1991.
6. Almaguer C.F.E., Patton-Vogt J. // Curr. Genet. 2006. V. 50. № 6. P. 367.
Книги Издательского холдинга "АТМОС
Архитектоника коры мозга человека: МРТ-атлас. Авторы И.Н. Боголепова, М.В. Кротенкова, Л.И. Малофеева, Р.Н. Коновалов, П.А. Агапов
Атлас посвящен макроскопии мозга человека на МРТ-изображениях в сагиттальных, коронарных и аксиальных направлениях, содержит оригинальные рисунки и фотоснимки. 216 с., ил. Для нейрорентгенологов, неврологов, нейрохирургов, нейроанатомов, нейрофизиологов и других специалистов, интересующихся проблемой прижизненной нейроанатомии мозга.
Руководство по экспериментальной хирургии. Авторы Б.К. Шуркалин, В.А. Горский, А.П. Фаллер
Руководство включает в себя наиболее важные и необходимые разделы экспериментальной хирургии. Оно состоит из 8 глав. В первой главе излагаются основные сведения по сравнительной анатомии экспериментальных животных; во второй - общие принципы проведения экспериментов на животных; в третьей - общая хирургическая техника; в четвертой - основные операции на различных системах и органах, способы воспроизведения экспериментальных моделей важнейших заболеваний человека; пятая глава посвящена минимально инвазивной хирургии; шестая - основам трансплантации органов; седьмая - применению клеевых субстанций, а восьмая - физическим методам в экспериментальной хирургии. 176 с., ил.
Для студентов лечебного и медико-биологического факультетов, хирургов-экспериментаторов.
Всю дополнительную информацию можно получить на сайте
www.atmosphere-ph.ru
N
