CC BY
3
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579
Streptomyces phaeochromogenes БВ-204 - штамм-продуцент антрахинона К-1115А, нового ингибитора биосинтеза белка
А. Р. Белик1, Ю. В. Закалюкина1,2, В. А. Алферова3, Ю. А. Буюклян1, И. А. Остерман1,4, М. В. Бирюков1,2*
Научно-технологический университет «Сириус», Сочи, 354340 Россия
2Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва, 119234 Россия 3Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997 Россия
4Сколковский институт науки и технологий, Москва, 121205 Россия
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 02.11.2023
Принята к печати 16.01.2024
DOI: 10.32607/actanaturae.27315
РЕФЕРАТ Важной проблемой при поиске новых антибиотиков является «переоткрытие», то есть обнаружение уже известных молекул и тот факт, что на их фоне могут теряться новые молекулы с перспективными механизмами действия. Возможным решением этой проблемы может быть так называемый мишень-ориентированный поиск с использованием специальных репортерных микроорганизмов, сочетающих повышенную антибиотикочувствительность со способностью демонстрировать характер повреждающего действия изучаемых молекул. Использование подобных тест-организмов позволяет обнаружить новые интересные свойства даже у известных метаболитов. В данном исследовании использован метод высокопроизводительного скрининга на основе двойной репортерной системы pDualrep2, высокая чувствительность которой, обусловленная использованием модифицированных штаммов тест-организмов, сочетается с возможностью легко и точно выявлять механизмы взаимодействия вещества с бактериальной клеткой на первичных этапах скрининга. Эта репортерная система не имеет аналогов в России и существенно превосходит мировые аналоги. Ингибирование трансляции индуцирует экспрессию флуоресцентного белка Katushka2s, а повреждение ДНК - TurboRFP. При помощи pDualrep2 нами выделен и описан штамм Streptomyces phaeochromogenes БВ-204, продуцент описанного ранее биологически активного вещества К-1115А, антибиотическая активность которого и способность ингиби-ровать бактериальную трансляцию впервые были продемонстрированы в нашей работе. Этот эффект подтвержден нами в in vitro системе бесклеточной трансляции мРНК FLuc. Антибактериальная активность вещества К-1115А проверена и подтверждена на клетках S. aureus (MRSA) и B. subtilis, а также сопоставлена с цитотоксичностью на клеточной линии HEK293. Определен терапевтический индекс данного соединения, составивший 2 и 8 соответственно. Полученные результаты и описанные нами новые свойства К-1115А открывают перспективы его дальнейшего изучения и позволяют рассматривать данное соединение как основу для получения полусинтетических производных с улучшенными терапевтическими свойствами и разработки в дальнейшем лекарственных форм.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА актиномицеты, К-1115А, антибиотики, репортерная система pDualrep2, ингибирова-ние биосинтеза белка, in vitro трансляция, «гражданская наука».
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БГК - биосинтетический генный кластер; КЖ - культуральная жидкость; ТФЭ -твердофазная экстракция; МПК - минимальная подавляющая концентрация; ХМСА - хромато-масс-спектрометрический анализ; ЛПС - липополисахарид; мРНК FLuc - матричная РНК, кодирующая светлячковую люциферазу.
ВВЕДЕНИЕ
Распространение антибиотикорезистентности среди патогенов представляет одну из острейших проблем современной медицины. Потенциал ранее найденных и введенных в медицинскую практику молекул практически исчерпан, а темпы открытия новых значительно снизились по сравнению с «Золотой эрой антибиотиков», которая приходилась на середину ХХ века. Большинство обнаруживаемых в ходе широкомасштабного скрининга [1-3] антибиотиков оказываются «переоткрытием» ранее уже обнаруженных молекул, однако новый инструментарий исследования механизмов действия позволяет взглянуть на эти вещества под новым углом и обнаружить новый потенциал их применения [4-6].
Такими инструментами могут быть мишень-ориентированный скрининг и методы определения механизма действия молекул на начальных стадиях исследования. Это позволяет сосредоточить поиск антибактериальных веществ, специфичных к наиболее перспективным мишеням, и даже может ускорить идентификацию молекул. В настоящее время нами успешно используется репортерная система, в которой соединения, ингибирующие биосинтез белка или ДНК, детектируются при помощи экспрессии репортерных генов флуоресцентных белков в ответ на это воздействие. Актуальность поиска ингибиторов трансляции заключается в том, что рибосома является ключевым элементом функционирования живой клетки, при этом в структурах рибосом про- и эукариот имеются значительные различия, что позволяет рассчитывать на возможность высокоспецифичного воздействия именно на бактериальные рибосомы и значительно повышает шансы разработки лекарственных препаратов с хорошими терапевтическими свойствами.
Актиномицеты рода Streptomyces - богатейший источник биологически активных веществ, они продуцируют примерно 50% используемых в медицинской практике антибактериальных субстанций [7-9]. Актиномицеты являются одними из обладателей самых больших геномов среди прокариот и, соответственно, имеют большой кодирующий потенциал, что приводит к структурному разнообразию продуцируемых ими вторичных метаболитов. К настоящему времени описаны десятки тысяч молекул, продуцируемых стрептомицетами, однако даже «переоткрываемые молекулы» часто демонстрируют новые, уникальные свойства.
Ранее благодаря использованию репортерной системы нам удалось установить механизм действия тетраценомицина Х [10]. Эта молекула и ее антибактериальные свойства были описаны еще в 60-х
годах. Тетраценомицин Х обладает структурным сходством с доксорубицином, поэтому считалось, что его эффект также основан на интеркаляции в двухцепочечную структуру ДНК, однако использование репортерной системы позволило предположить, а в дальнейшем и подтвердить, что эта молекула ингибирует биосинтез белка путем взаимодействия с рибосомой в новом, ранее не исследованном центре связывания, что дает надежды на разработку перспективных полусинтетических производных на ее основе.
В данном исследовании нами обнаружен штамм-продуцент вещества К-1115А, механизм антибактериального действия которого основан на подавлении биосинтеза белка, что подтверждено с помощью теста в бесклеточной системе трансляции. Полученные результаты позволяют нам утверждать, что вещество К-1115А является ингибитором биосинтеза белка.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Отбор образцов, выделение и культивирование микроорганизмов
Штамм БВ-204 S. phaeochromogenes был выделен из образцов почв, отобранных на Федеральной территории Сириус. Образцы почвы отбирали весной 2021 года в парковой зоне на побережье Черного моря (43°23'53.7'^ 39°57'48.2"Е). Пробоотбор проводили согласно методике, описанной ранее [11, 12]. Верхний слой почвы (0-5 см) снимали стерильным шпателем и помещали в стерильную емкость для сбора образцов. Актинобактерии выделяли путем поверхностного посева на агаризованные питательные среды из серийных разведений почвенных суспензий согласно [13]. В качестве питательной среды использовали КР3 [13] с добавлением нистатина (250 мкг/мл) и налидиксовой кислоты (10 мкг/мл) для подавления развития микромице-тов и грамотрицательных бактерий соответственно. Посев инкубировали в течение 14 суток при температуре 28°С.
Штамм БВ-204 был отобран на основе морфологических признаков, выделен в чистую культуру из первичного посева на минеральный агар Гаузе 1 для микроморфологических исследований [14]. Для поддержания в лабораторных условиях штамм культивировали на среде КР3, для долговременного хранения - растили на жидкой среде КР3 в течение 14 суток с постоянным перемешиванием (200 об/мин при 28°С), а затем полученную суспензию смешивали с равным объемом 50% раствора глицерина и замораживали в жидком азоте; образцы хранили при -80°С.
Полифазная идентификация штамма
Культуральные признаки штамма БВ-204 (наличие и окраска воздушного мицелия, выделение растворимых пигментов) оценивали на плотных средах, рекомендованных International Streptomyces Project (ISP), после 14 суток культивирования при 28°С [15]. Морфологические признаки (наличие и форма цепочек репродуктивных спор, характер поверхности спор) оценивали с помощью светового Zeiss Axiolab A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) и сканирующего электронного микроскопа JSM-6380LA (JEOL Ltd., Япония) спустя 14 дней роста при 28°С на среде ISP3. Подготовку образцов для электронной микроскопии осуществляли в соответствии с методикой, описанной ранее [16]. Утилизацию источников углерода (моно- и полисахаридов, спиртов) оценивали на минеральном агаре ISP9 с добавлением бромкрезолового пурпурного при 28°С в течение 14 дней [15]. Способность разлагать крахмал, целлюлозу и казеин оценивали по размеру зон гидролиза полимеров согласно [17, 18]. Чувствительность к различным антибиотикам определяли с помощью бумажных дисков, пропитанных антибиотиками (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Индия).
Полногеномное секвенирование, филогенетический анализ и анализ БГК
ДНК из штамма-продуцента выделяли согласно [19]. Геном штамма БВ-204 был секвенирован de novo с использованием платформы Illumina HiSeq 4000 (Illumina, США). Сборка генома осуществлена с помощью SPAdes v3.13.0 [20]. Геном был аннотирован с использованием конвейерной технологии RASTtk на основании веб-сервиса PATRIC [21]. Целостность и качество генома, а также средние значения идентичности нуклеотидов (ANI) оценивали с помощью веб-сервиса MiGA (http://microbial-genomes.org). Филогенетическую принадлежность исследовали с использованием полногеномной последовательности и сервиса Type (Strain) Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz.de/). Геном штамма БВ-204 автоматически сопоставляли со всеми геномами, представленными в базе данных TYGS, с помощью алгоритма MASH [22]. Филогенетическое дерево получено с помощью FastME 2.1.6.1 на основании расстояний GBDP, рассчитанных исходя из нуклеотидных последовательностей генома. Длины ветвей были масштабированы по формуле расстояния GBDP d5 [23].
БГК биологически активных соединений были идентифицированы с помощью бактериальной версии браузера antiSMASH 6.1.0 (https://antismash. secondarymetabolites.org). Гомологичные области в каждом геноме идентифицировали с помощью NCBI Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Скрининг антимикробного действия
Первичное определение антибактериальной активности проводили на штамме E. coli BW25113, у которого делитированны кодоны 330-352 гена lptD, обозначаемый нами в дальнейшем E. coli SS_lptd. Данная мутация приводит к нарушению нормального синтеза липополисахаридной оболочки грамотрицательных бактерий, что делает ее более проницаемой для низкомолекулярных соединений [11]. Данный штамм содержит плазмиду pDualrep2 [10]. В присутствии ингибиторов репликации ДНК или ингибиторов биосинтеза белка штамм экспрессирует флуоресцентные белки TurboRFP или Katushka2s соответственно (Приложения, рис. S7). Скрининг проводили методом диффузии в агаре, описанном ранее [16]. Штамм БВ-204, наряду с другими штаммами, выращивали на ISP3, тестирование проводили на 3, 6 и 9 сутки; для этого из участка газона с отчетливым ростом вырезали агаровый блок диаметром 5 мм и помещали его на чашки, содержащие агаризованную среду LB, предварительно засеянные культурами тест-организмов. Флуоресцентный сигнал детектировали на следующий день после посева с помощью ChemiDoc MP (Bio-Rad) в каналах Су-3 и Су-5. Для изучения спектра действия штамм БВ-204 тестировали на других тест-организмах, таких, как S. aureus АТСС 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus SS01, S. aureus (MRSA) INA00761, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans CBS 8836, M. smegmatis Ac-1171. Антибактериальную активность оценивали с помощью методики агаровой диффузии, описанной выше. Для формирования газона бактерий использовали агаризованную среду LB, для дрожжей - глюкозо-пептонно-дрожжевой агар [24], инкубировали при 37°С в течение 24 ч, после чего оценивали размер зон подавления роста.
Выделение и идентификация активных компонентов
В ходе первичного скрининга была установлена способность штамма БВ-204 проявлять антагонистическую активность при росте на среде ISP3. Для получения культуральной жидкости (КЖ), содержащей активное вещество, штамм культивировали в жидкой питательной среде ISP3 (7 суток, 28°С на шейке-ре New Brunswick Innova (Eppendorf), 200 об/мин). КЖ отделяли от биомассы путем центрифугирования при 4000 g, концентрировали и очищали с помощью твердофазной экстракции (ТФЭ). С этой целью КЖ наносили на хроматографическую колонку Poly-Prep Econo-Pac (Bio-Rad), содержащую 1 мл сорбента LPS-500H («Техносорбент», Россия), после чего элюировали ступенчатым градиентом вода-ацетонитрил (v/v) с фракционным сбором элюата. Исследовали антагонистическую активность со-
бранных фракций, активные фракции использовали для дальнейшей очистки методом ВЭЖХ.
ВЭЖХ-анализ и фракционирование выполняли с помощью системы Vanquish Flex с использованием детектора с диодной матрицей (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенного колонкой Luna 5 мкм C18(2) 100 Ä, 250 х 4.6 мм (Phenomenex), скорость потока 1 мл/мин, инжекционный объем 20 мкл. В качестве элюента А использовали 0.1% водный раствор ТФУУ а в качестве элюента В - ацетонитрил с добавлением 0.1% ТФУ Элюирование осуществляли путем увеличения концентрации элюента В с 25 до 95% в течение 10 мин, затем поддерживали концентрацию элюента В 95% в течение 2 мин. Собирали фракции объемом 1 мл и анализировали их антибактериальную активность (Приложения, рис. S8).
Активные фракции анализировали с использованием хромато-масс-спектрометрической системы -хроматограф UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенный колонкой Acclaim RSLC 120 C18 2.2 мкм 2.1 х 100 мм (Thermo Fisher Scientific), и qTof-масс-спектрометр аmaXis II 4G ETD (Bruker Daltonics). Измерения проводили в режиме регистрации спектра 100-1500 м/з и с выделением трех наиболее интенсивных ионов для фрагментации CID 10-40 эВ, газ столкновений - азот. Масс-спектры анализировали с помощью OpenChrom Lablicate Edition (1.4.0.202201211106), TOPPView v.2.6.0 [25]. Химические структуры идентифицировали с использованием баз данных GNPS [26], NPAtlas [27, 28] и Dictionary of Natural Products 31.1.
Активную ВЭЖХ-фракцию (1 мл) концентрировали с помощью вакуумного биоконцентратора CentriVap (Labconco) и растворяли в 500 мкл 10% водного раствора ДМСО; полученный раствор именовали «рабочий раствор антибиотика».
Ингибирование трансляции in vitro
Подавление трансляции изучали в бесклеточной системе с использованием коммерческого набора E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA (Promega) согласно инструкции фирмы. В реакционную смесь (4 мкл) вносили рабочий раствор антибиотика (0.5 мкл), а затем 0.5 мкл 200 нг/мкл мРНК FLuc и инкубировали в течение 1 ч при 37°С.
Активность люциферазы определяли с использованием набора Luciferase Assay Reagent (Promega) по интенсивности хемилюминесценции на планшетном ридере ClarioStar (BMG Labtech) на длине волны 580(80) нм.
Исследование МПК и цитотоксичности
Ночные культуры штаммов E. coli SS_lptd, S. aureus INA00761 (MRSA), S. aureus SS01 и B. subtilis ATCC
6633 разбавляли свежей средой LB до OD600 = 0.6, а затем полученный посевной материал разводили в 1000 раз для получения рабочей суспензии. В лунки стерильного 96-луночного планшета вносили по 100 мкл рабочей суспензии, кроме первого и последнего рядов. В первый ряд вносили по 180 мкл суспензии, последний ряд заполняли 100 мкл стерильной питательной среды и использовали в качестве отрицательного контроля. Далее в первый ряд планшета вносили 20 мкл рабочего раствора антибиотика и получали серию двукратных разведений, последовательно перенося 100 мкл из лунки одного ряда в лунку следующего. В качестве положительного контроля использовали предпоследний ряд, в который антибиотик не вносили. Затем планшет инкубировали при перемешивании (200 об/мин, 37°С). Рост клеток регистрировали через 24 ч на планшетном ридере ClarioStar на длине волны 590 нм. В качестве МПК принимали концентрацию вещества, при которой наблюдалось полное подавление роста бактерий.
Для определения цитотоксичности клеточные линии подготавливали согласно [29]. Культуру клеток НЕК293 культивировали на питательной среде DMEM, содержащей 10% FBS, 4 мМ L-глутамина, 4.5 г/л глюкозы. В ряд подготовленных микроцентрифужных пробирок вносили по 100 мкл питательной среды, затем в первую пробирку добавляли 80 мкл среды и 20 мкл рабочего раствора антибиотика, после чего производили двукратные последовательные разведения, перенося по 100 мкл из первой пробирки во вторую и далее по всему ряду. В качестве отрицательного контроля использовали двукратные разведения доксорубицина в диапазоне от 75.9 до 0.16 мкМ; в качестве положительного контроля оставляли ряд лунок с клетками без антибиотиков. Содержимое пробирок переносили в соответствующие лунки заранее подготовленного планшета, содержащие клетки, и инкубировали в течение 3 суток в СО2-инкубаторе при 37°С. По истечении времени инкубации в лунки, содержащие питательную среду, вносили 20 мкл раствора резазурина (0.15 мг/мл), перемешивали покачиванием для равномерного распределения красителя в лунках и выдерживали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 3 ч. Далее интенсивность флуоресценции измеряли с помощью планшетного ридера ClarioStar (Ех = 545 нм, Ет = 600 нм).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Генетический и филогенетический анализ
По результатам полногеномного секвенирования и последующей сборки размер генома клеток штам-
БB-204
Streptomyces phaeochromogenes JCM 4958 Streptomyces umbrinus JCM 4521 Streptomyces liliifuscus ZYC-3 Streptomyces albicerus TRM 68295 Streptomyces tauricus JCM 4837 Streptomyces ortus A15ISP2-DRY2 Streptomyces dioscori A217 Streptomyces liliiviolaceus BH-SS-21 Streptomyces glomeroaurantiacus JCM 4677 Streptomyces apricus SUN51 Streptomyces fructofermentans JCM 4956
Рис. 1. Филогенетическое дерево, основанное на полном геноме штамма S. phaeochromogenes БВ-204. Указаны значения бутстрэп-анализа выше 60%
Рис. 2. Электронная микрофотография штамма S. phaeochromogenes БВ-204 на 14 сутки инкубации в среде №3 при 28Х. Размерный отрезок соответствует 2 мкм
ма БВ-204 составляет 11 380 121 п.н., содержание G+C равно 70.2%, что характерно для представителей рода Streptomyces [30].
Филогенетический анализ, основанный на полногеномных последовательностях, показывает, что штамм БВ-204 наиболее близко кластеризуется со штаммом S. phaeochromogenes JCM 4958 (ранее S. ederensis JCM 4958) и вместе с ним, а также со штаммами & итЬппи JCM 4521, S. Ш^^си ZYC-3, S. аТЬШсеги TRM 68295 образует монофилетиче-скую группу с максимальным значением поддержки ветвления 100% (рис. 1).
Фенотипические и морфологические свойства штамма БВ-204
Штамм S. phaeochromogenes БВ-204 является грам-положительной аэробной бактерией с неподвижными клетками, активно растущими на питательных средах КР2 и КР3 и умеренно - на средах КР5 и КР6. Окраска субстратного мицелия варьируется от темно-бурой до бежевого, воздушный мицелий палевый с розовыми оттенками, на среде КР6 воздушный мицелий не образуется. Кроме того, штамм БВ-204, растущий на среде КР3, выделяет темно-бурый растворимый пигмент (Приложения, табл. S1).
Клетки S. phaeochromogenes БВ-204 имеют такой же спектр утилизации углеводов, как и штаммы S. phaeochromogenes JCM 4958(Т) и S. umЬrinus JCM 4521, описанные ранее: не выявлено отличий в способности БВ-204 и близкородственных видов использовать моно-, дисахариды и спирты. У штамма S. phaeochromogenes БВ-204 обнаружена способ-
ность гидролизовать карбоксиметилцеллюлозу, т.е. этот штамм обладает целлюлазной активностью, не описанной ранее у других представителей этого таксона (Приложения, табл. S2).
Штамм S. phaeochromogenes БВ-204 образует прямые, длинные цепочки спор с гладкой поверхностью, что согласуется с описанием типовых штаммов [14] (рис. 2).
Таким образом, результаты филогенетического анализа, полученные с использованием полифазного таксономического подхода, и сравнение фенотипиче-ских признаков позволяют отнести штамм БВ-204 к виду S. phaeochromogenes.
Антибактериальная активность
В ходе первичного скрининга была обнаружена антибактериальная активность S. phaeochromogenes БВ-204 в отношении E. coli SS_lptd pDualrep2. Вещество, выделяемое продуцентом, индуцировало экспрессию Katushka2s, что позволяет предположить возможность ингибирования синтеза белка (рис. 3). В качестве положительного контроля использовали 0.05 мкг эритромицина (ингибитора биосинтеза белка), который вызывает экспрессию Katushka2s, и 1 нг норфлоксацина (ингибитора ДНК-гиразы), который вызывает экспрессию TurboRFP. Для удобства сигналы Katushka2s и TurboRFP визуализируются программным обеспечением ChemiDoc MP - красным и зеленым цветом соответственно. На штамме E. coli JW5503 AtolC pDualrep2 ингибирование и индукция репортерных флуоресцентных белков отсутствовали.
Рис. 3. Активность агаровых блоков с S. phaeochro-
mogenes БВ-204 в отношении штамма E. coli SS_lptd
pDualrep2 на 3-и (а), 6-е (б) и 9-е (в) сутки роста
Обнаружено, что штамм S. phaeochromogenes БВ-204 подавляет рост грамположительных бактерий B. subtilis ATCC 6633, S. aureus SS01, S. aureus INA00761 (MRSA); однако не ингибиру-ет штаммы S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, C. albicans CBS 8836, M. smegmatis Ac-1171. Оптимальной средой для синтеза активного метаболита штаммом БВ-204 была как агаризованная, так и жидкая среда ISP3.
Идентификация активного вещества
Активный метаболит получали в чистом виде с помощью твердофазной экстракции КЖ S. phaeochromogenes БВ-204, активный метаболит детектировался во фракциях, содержащих 30-40% ацетонитрила. Эти фракции были сконцентрированы и подвергнуты дальнейшему разделению и фракционированию с помощью ВЭЖХ. Обнаружено, что активность ассоциирована с компонентом, элюируемым на 9.47 мин (Приложения, рис. S10 и S11), имеющим максимумы поглощения при 276 и 407 нм. ХМСА этого вещества показал, что оно практически не ионизируется в режиме регистрации положительных ионов, однако дает интенсивный аддукт [M-H]-, соответствующий точной массе 326.0805 Да (Приложения, рис. S12). С учетом характерного спектра поглощения выделенного соединения в базах NPAtlas, Dictionary of Natural Products и PubChem выявлен кандидат с брутто-формулой C18H14O (точная масса 326.0790, откло-
О
Рис. 4. Структура идентифицированного активного компонента К-1115А (3,8-дигидрокси-9,10-диоксо-1-пропилантрацен-2-карбоновая кислота)
Концентрация, мкг/мл
Рис. 5. Подавление in vitro трансляции гена люцифера-зы под действием К-1115А и эритромицина
нение 4.5 м.д.) и структурной формулой, представленной на рис. 4.
K-1115A, как и алнумицин, имеет биосинтетическое происхождение и продуцируется стрептоми-цетами [31]. В спектре фрагментации аддукта [M-H]- с m/z 325.07 наблюдается основной фрагментный ион [M-44] с m/z 281.08, что согласуется с наличием в молекуле карбоксильной группы.
Исследование подавления биосинтеза белка соединением К-1115А in vitro
Изучена способность очищенной с помощью ВЭЖХ фракции К-1115А подавлять бесклеточную трансляцию. В качестве референсного ингибитора трансляции использовали эритромицин. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Результаты определения концентрационной зависимости доза-эффект представлены на рис. 5. Значения EC50 составили 0.004 и 0.606 мкг/мл для эритромицина и К-1115А соответственно.
Л
гН _ (М _ <Г)>-1СОЧ1Л (0КСЧ
ан 1М». V 2 г а. О х I- ест гг О1/1 щ ® < г* сч м нсксс—Хесо:
с с ее с с с с с с ^ с с с ^ с с с с с с с с сссссссс с
1йС«|1)<мСяа11 тт иМ сЬ
Б
ос " «ч-з Х 2 ^ а О а. н к ^ ч Оьл ц© ш < сею какк—Хкс н
с £ с£ .£ с с с с с с с _с с с с е с с с сс сссс^сссе с
ниавшташнмвАшм ни Ш
|Транспортные | ■ Дополнительные гены Ц Регуляторные
гены биосинтеза гены
| Щругие гены | Основные гены биосинтеза
Рис. 6. БГК алнумицина и К-1115А в геноме штамма Streptomyces sp. CM020 (А); S. phaeochromogenes БВ-204 (Б)
Анализ БГК
С помощью биоинформатических методов в геноме 5. phaeochromogenes БВ-204 найден БГК алнумицина с К-1115А в качестве шунтирующего продукта, гомологичный кластеру генов, ранее аннотированному у Streptomyces sp. СМ020 (рис. 6) [32]. БГК содержит 32 открытых рамки считывания, которые могут участвовать в биосинтезе алнумицина и К-1115А. В него входит 22 предположительно структурных гена и 10 генов, несущих регулятор-ную и транспортную функцию. Общая длина кластера составляет 31030 п.н. Синтез антибиотика осуществляется поликетидсинтазой II типа.
ОБСУЖДЕНИЕ
Род Streptomyces является самым обширным среди актиномицетов, большинство известных клинически значимых антибиотиков, начиная со стрептомицина, были выделены именно из представителей этого таксона. Усилиями многочисленных научных коллективов к 1980 году опубликованы данные о десятках тысяч соединений, проявляющих антагонистическую активность. Большинство соединений, впрочем, не были полноценно охарактеризованы в силу ограниченности методологической базы того времени. Одним из подобных соединений оказалось вещество с индексом К-1115А, продуцируемое штаммом БВ-204, обнаруженным нами в ходе широкомасштабного скрининга, осуществляемого с применением «гражданской науки», с использованием мишень-ориентированной репортерной системы pDualrep2.
Штамм-продуцент БВ-204, атрибутированный на основе полифазного анализа как представитель вида 5. phaeochromogenes, при росте на овсяной среде демонстрировал способность ингибировать модельные штаммы и вызывать индукцию репор-терной системы, свидетельствующую о подавлении синтеза белка.
В результате последовательных стадий твердофазной экстракции КЖ 5. phaeochromogenes
БВ-204 с последующим ВЭЖХ-фракционированием удалось выделить активную субстанцию в чистом виде. Последующий ХМСА позволил предложить в качестве кандидата соединение K-1115A (3,8-дигидрокси-9,10-диоксо-1-пропилантрацен-2-карбоновая кислота), что подтверждается совпадением точной массы и характерным УФ-спектром, соответствующим опубликованным ранее данным [33]. Биоинформатический анализ выявил в геноме штамма S. phaeochromogenes БВ-204 БГК, ответственный за продукцию алнумицина и других родственных веществ, включая К-1115А, что дополнительно подтверждает способность БВ-204 синтезировать К-1115А. При этом ранее об антибактериальной активности К-1115А не сообщалось.
Известно, что некоторые продукты БГК ал-нумицина обладают антибактериальной активностью [31], однако механизм действия этих соединений не изучен. Анализ референсного генома (ГенБанк RefSeq:GCF_026343615.1) штамма S. phaeochromogenes NBC 00034 также выявил у него БГК алнумицина и сопряженных с ним соединений. Этот кластер был аннотирован ранее на основе штамма Streptomyces sp. CM020 [32], данные филогенетического атрибутирования которого не опубликованы, но на основе высокой гомологии БГК алнумицина Streptomyces sp. CM020, S phaeo-chromogenes NBC 00034 и S phaeochromogenes БВ-204, а также сходства фенотипических признаков можно предположить, что Streptomyces sp. CM020 также относится к таксону S. phaeochromogenes.
Согласно опубликованным данным, S. phaeochro-mogenes NBC 00034 продуцирует различные изомеры фаэхромацетина (A, B, C, D, E) [34-38], а также моэномицин и бамбермицин [38], однако ХМСА не выявил этих продуктов в спектре метаболитов S. phaeochromogenes БВ-204. Стоит также отметить, что ХМСА не выявил алнумицина в спектре метаболитов. Нарушение функционирования генов aln4 и aln5 может влиять на биосинтез алнумици-на [34] и приводить к переключению биосинтеза на образование К-1115А в качестве основного продукта [32]. Выравнивание генов выявило, что aln4 у Streptomyces sp. CM020 и S. phaeochromogenes NBC 00034 полностью идентичны, тогда как нуклео-тидная последовательность aln4 S. phaeochromogenes БВ-204 отличается от них несколькими заменами. Генетические последовательности гена aln5 у проанализированных штаммов различаются значительно сильнее (Приложения, рис. S9). Вероятно, именно с этим связано, что наш штамм продуцирует только К-1115А.
Анализ генома штамма БВ-204 выявил участки, ответственные за синтез многих вторичных
метаболитов, как например, сидерофор коелихелин, однако исследование способности штамма образовывать соединения, хелатирующие железо, с применением метода диффузии в агар [39] дало отрицательные результаты.
Впервые вещество 3,8-дигидрокси-9,10-диоксо-1-пропилантрацен-2-карбоновая кислота было выделено из штамма S. griseorubiginosus (Mer-K1115A), описано как соединение антрахинонового ряда и названо К-1115А [33]. Были изучены противовоспалительные свойства этого соединения, но данные о противомикробной активности К-1115А в литературе не представлены. Существуют публикации об антагонистической активности структурно близкой молекулы 3,8-дигидрокси-1-пропилантрахинон-2-карбоновой кислоты в отношении грамположи-тельных бактерий [40]. Диски с нагрузкой 40 мкг активного вещества давали на газонах S. aureus и S. viridochromogenes зоны ингибирования диаметром 14 и 12 мм соответственно, активности в отношении дрожжей и микромицетов не было выявлено [40]. Необходимо отметить, что, вероятно по ошибке, авторы именовали исследуемую ими молекулу как «К-1115А», при том, что она имеет иную формулу. Еще одно близкородственное соединение, 3,8-дигидрокси-1-метилантрахинон-2-карбоновая кислота, подавляло образование биопленок, формируемых метициллин резистентным стафилококком с ЕС50 200 мкг/мл [41]. Считаем необходимым упомянуть, что на это исследование ссылались в недавней работе, в которой антибактериальная активность была ошибочно приписана «К-1115А». Впервые достоверно антибактериальная активность К-1115А показана в настоящей работе. Существуют данные, что алнумицин и некоторые другие продукты БГК, например, 6-дигидро-8-пропилантрахинон, активны против E. coli AtolC [42], однако в наших опытах К-1115А против E. coli AtolC активности не показал. К-1115А действовал на вариант штамма E. coli SS_lptd с нарушенным синтезом липополи-сахаридов оболочки с повышенной проницаемостью клеточной мембраны соответственно. Согласно опубликованным данным, соединения антрахинонового ряда действуют преимущественно на грамположи-тельные микроорганизмы, в частности представителей Staphylococcus, Bacillus, Streptomyces и т.д., но не действуют на грамотрицательные микроорганизмы и грибы [40].
Для веществ антрахиноновой природы в целом характерно ингибирование процессов, вовлеченных в биосинтез ДНК, однако продукты и интермедиа-ты алнумицинового БГК, в частности сам алнумицин и 1,6-дигидро-8-пропилантрахинон, не связываются с двухцепочечной ДНК и не ингибируют ДНК-гиразу
[43]. Исследование К-1115А с помощью репортерной системы pDualrep2 также не обнаружило ингибиру-ющего эффекта на синтез ДНК, однако выявило его способность ингибировать биосинтез белка.
Нами изучено влияние К-1115А на трансляцию в бесклеточной системе in vitro и показано, что данное соединение является ингибитором биосинтеза белка. Установлено, что ЕС50 К-1115А составляет 97% от его МПК, при этом ЕС50 эритромицина в этом исследовании составило 0.8%. Таким образом, для подавления роста клеток концентрация эритромицина должна быть в 125 раз больше, чем для ингибирования собственно трансляции, тогда как в случае К-1115А эти концентрации практически одинаковы. Такой эффект К-1115А несколько отличает его от распространенных ингибиторов трансляции, но не делает его уникальным. Например, аналогичный эффект оказывает известный ингибитор трансляции - хлорамфеникол, имеющий дополнительные механизмы действия, помимо связывания с рибосомой [44]. Это может говорить о том, что ин-гибирование бактериальной трансляции не единственный механизм противомикробного действия К-1115А либо, например, какие-то ферментные системы микробной клетки модифицируют К-1115А таким образом, что полученная молекула обладает существенно большим ингибирующим действием, чего мы не можем наблюдать в in vitro системе.
Можно также предположить, что нарушение синтеза клеточной мембраны бактерии не является альтернативным механизмом действия, так как в нашем случае вещество действует на штамм с уже нарушенным синтезом ЛПС, но не на штамм, у которого эта структура сохранена. Можно предположить, что дополнительная мишень не связана с взаимодействием с ДНК, несмотря на то, что это характерно для антрахиноновых производных, иначе мы наблюдали бы в эксперименте дополнительно индукцию TurboRFP, свидетельствующую о SOS-ответе.
Стоит отметить, что специфичность данного вещества в отношении грамположительных бактерий и рекомбинантного штамма E. coli SS_lptd с деле-цией в гене lptD свидетельствует о том, что активность К-1115А в отношении бактериальных клеток в значительной степени определяется проницаемостью клеточных барьеров для этой молекулы.
Для перспективности соединения в качестве агента антимикробной терапии огромную роль играет специфичность его воздействия на клетки патогенных микроорганизмов и безопасность для клеток животных, характеризуемая показателем «терапевтический индекс» (ТИ). Мы исследовали способность К-1115А ингибировать клеточную линию HEK293, для которой EC50 составила 5 мкг/мл, и несколь-
Таблица 1. Способность К-1115А подавлять модельные патогенные штаммы микроорганизмов
ких модельных патогенов (табл. 1), рассчитали ТИ как отношение EC50 HEK293 к МПК штаммов микроорганизмов.
ТИ разных исследованных штаммов, в которых наблюдалось подавляющее действие, находился в диапазоне от 2 до 8, это дает надежды на возможность разработки на основе К-1115А полусинтетических производных, обладающих хорошими клиническими перспективами.
Получены также данные о наличии у продуктов и интермедиатов алнумицинового БГК противоопухолевой активности за счет параптоза [45], аутофа-гии [45], предотвращения аберрантного клеточного метаболизма [46], повышения радиочувствительности раковых клеток [47], апоптоза и др. [48]. Показано также, что К-1115А обладает противовоспалительными свойствами, оно ингибирует прямое связывание транскрипционного фактора АР-1 с олигонуклеотидом АР-1 и выработку коллагеназы в стимулированных IL-1a синовиальных клетках крыс in vitro. Установлено также, что вещество ослабляет воспалительную реакцию, опосредованную АР-1, за счет снижения активности орнитиндекар-боксилазы у мышей, индуцированных форболмири-статацетатом [31]. Паттерсон и соавт. использовали вещество К-1115А для создания физиологически активных конъюгатов [49].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование современных механизм-ориентированных подходов к классическому скринингу позволяет найти не только новые биологически активные вещества, но и обнаружить новые перспективные свойства ранее открытых, но малоиз-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Abdel-Razek A.S., El-Naggar M.E., Allam A., Morsy O.M., Othman S.I. // Processes. 2020. V. 8. № 4. P. 470.
ученных молекул, что дает им шанс стать потенциальным лекарственным средством. Несмотря на то, что соединение К-1115А открыто более 25 лет назад и получены некоторые данные об антибактериальной активности его гомологов, активность данного вещества и механизм его действия до сих пор не были изучены. В этом исследовании нам удалось с помощью двойной репортерной системы pDualrep2 обнаружить продуцента К-1115А, установить, что это соединение ингибирует синтез белка, а также подтвердить этот эффект путем ингибирования трансляции in vitro с использованием мРНК FLuc.
Антрахиноновое производное К-1115А, продуцируемое штаммом S. phaeochromogenes БВ-204, показало активность штамма E. coli SS_lptd с ослабленной клеточной мембраной, а затем на ряде клинически релевантных изолятов S. aureus, в том числе MRSA, B. subtilis. Отсутствие активности в отношении S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, C. albicans CBS 8836, M. smegmatis Ac-1171 дает надежды на специфичность действия в отношении бактериальных мишеней. К-1115А продемонстрировало новое для продуктов БГК алнумицина свойство - способность ингибировать биосинтез белка.
Терапевтический индекс для К-1115А относительно невелик (2-8 у разных штаммов), однако данное вещество может стать основой для разработки полусинтетических производных для антимикробной терапии. Ранее было показано, что К-1115А и его полусинтетические производные обладают противовоспалительной активностью, что вместе с антимикробными свойствами позволяет рассматривать их в качестве перспективных соединений для разработки препаратов комплексной противо-микробной и противовоспалительной терапии (например, для обработки ран).
Высокопроизводительный скрининг с использованием системы pDualrep2 значительно повышает эффективность поиска новых ингибиторов синтеза белка даже среди известных соединений, открывая новые свойства и перспективы для целых классов молекул. •
Финансирование работы осуществлялось Министерством науки и высшего образования
Российской Федерации (соглашение № 075-10-2021-093; проект [BTH-RND-2127]).
Приложения доступны на сайте https://doi.org/10.32607/actanaturae.27315.
2. Newman D.J., Cragg G.M. // J. Nat. Prod. 2020. V. 83. № 3. P. 770-803.
3. Dai J., Han R., Xu Y., Li N., Wang J., Dan W. // Bioorganic
Тест-объект МПК, мкг/мл ТИ
E. coli SS_lptd 0.625 8
S. aureus (MRSA) INA00761 2.5 2
B. subtilis ATCC 6633 1.25 4
S. aureus SS01 0.625 8
S. aureus 29213 нет* -
S. aureus ATCC 25923 нет -
M. smegmatis Ac-1171 нет -
C. albicans CBS 8836 нет -
'Подавление отсутствует в исследованном диапазоне.
Chem. 2020. V. 101. P. 103922.
4. Wright G.D. // Chem. Biol. 2012. V. 19. № 1. P. 3-10.
5. Zhu Y., Huang W.E., Yang Q. // Infect. Drug Resist. 2022. V. 15. P. 735-746.
6. Alferova V.A., Maviza T.P., Biryukov M.V., Zakalyukina Y.V., Lukianov D.A., Skvortsov D.A., Vasilyeva L.A., Tashlitsky V.N., Polshakov V.I., Sergiev P.V., et al. // Biochimie. 2022."
V. 192. P. 63-71.
7. Mahajan G.B. // Front. Biosci. 2012. V. E4. № 1. P. 240-253.
8. Sousa J.A.D.J., Olivares F.L. // Chem. Biol. Technol. Agric. 2016. V. 3. № 1. P. 24.
9. Tian X., Zhang Z., Yang T., Chen M., Li J., Chen F., Yang J., Li W., Zhang B., Zhang Z., et al. // Front. Microbiol. 2016. V. 7. № 5. P. 17-18.
10. Osterman I.A., Komarova E.S., Shiryaev D.I., Korniltsev I.A., Khven I.M., Lukyanov D.A., Tashlitsky V.N., Serebryako-va M.V., Efremenkova O.V., Ivanenkov Y.A., et al. // Antimi-crob. Agents Chemother. 2016. V. 60. № 12. P. 7481-7489.
11. Volynkina I.A., Zakalyukina Y.V., Alferova V.A., Belik A.R., Yagoda D.K., Nikandrova A.A., Buyuklyan Y.A., Udalov A.V., Golovin E.V., Kryakvin M.A., et al. // Antibiotics. 2022. V. 11. № 9. P. 1198.
12. ISO. https://www.iso.org/standard/65223.html. (Accessed November 1, 2023)
13. Baranova A.A., Chistov A.A., Tyurin A.P., Prokhorenko I.A., Korshun V.A., Biryukov M.V., Alferova V.A., Zakalyuki-na Y.V. // Microorganisms. 2020. V. 8. № 12. P. 1948.
14. Gause G.F., Preobrazhenskaya T.P., Terekhova L.P., Maksimova T.S. Guide for Determination of Actinomycetes: Genera Streptomyces, Streptoverticillium, and Chainia. 1st ed. M.: Nauka, 1983. P. 84-89.
15. Shirling E.B., Gottlieb D. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1966. V. 16. № 3. P. 313-340.
16. Zakalyukina Y.V., Osterman I.A., Wolf J., Neumann-Schaal M., Nouioui I., Biryukov M.V. // Antonie Van Leeuwenhoek. 2023. V. 116. № 6. P. 597-598.
17. Williams S.T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M.H., Sneath P.H.A., Sackin M.J. // Microbiology. 1983. V. 129. № 6. P. 1743-1813.
18. Zakalyukina Y.V., Birykov M.V., Lukianov D.A., Shiri-aev D.I., Komarova E.S., Skvortsov D.A., Kostyukevich Y., Tashlitsky V.N., Polshakov V.I., Nikolaev E., et al. // Biochimie. 2019. V. 160. P. 93-99.
19. Zakalyukina Yu.V., Biryukov M.V., Golichenkov M.V., Netrusov A.I. // Mosc. Univ. Biol. Sci. Bull. 2017. V. 72. № 1. P. 13-19.
20. Prjibelski A., Antipov D., Meleshko D., Lapidus A., Ko-robeynikov A. // Curr. Protoc. Bioinforma. 2020. V. 70. № 1. P. e102.
21. Brettin T., Davis J.J., Disz T., Edwards R.A., Gerdes S., Olsen G.J., Olson R., Overbeek R., Parrello B., Pusch G.D., et al. // Sci. Rep. 2015. V. 5. № 1. P. 8365.
22. Ondov B.D., Treangen T.J., Melsted P., Mallonee A.B., Bergman N.H., Koren S., Phillippy A.M. // Genome Biol. 2016. V. 17. № 1. P. 132.
23. Lefort V., Desper R., Gascuel O. // Mol. Biol. Evol. 2015. V. 32. № 10. P. 2798-2800.
24. Zakalyukina Y.V., Pavlov N.A., Lukianov D.A., Marina V.I., Belozerova O.A., Tashlitsky V.N., Guglya E.B., Osterman I.A., Biryukov M.V. // Insects. 2022. V. 13. № 11. P. 1042.
25. Kohlbacher O., Reinert K., Gröpl C., Lange E., Pfeifer N., Schulz-Trieglaff O., Sturm M. // Bioinformatics. 2007. V. 23. № 2. P. e191-e197.
26. Wang M., Carver J.J., Phelan V.V., Sanchez L.M., Garg N., Peng Y., Nguyen D.D., Watrous J., Kapono C.A., Luz-
zatto-Knaan T., et al. // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 828-837.
27. van Santen J.A., Poynton E.F., Iskakova D., McMann E., Alsup T.A., Clark T.N., Fergusson C.H., Fewer D.P., Hughes A.H., McCadden C.A., et al. // Nucleic Acids Res. 2022. V. 50. № D1. P. D1317-D1323.
28. Van Santen J.A., Jacob G., Singh A.L., Aniebok V., Balu-nas M.J., Bunsko D., Neto F.C., Castano-Espriu L., Chang C., Clark T.N., et al. // ACS Cent. Sci. 2019. V. 5. № 11.
P. 1824-1833.
29. Segeritz C.-P., Vallier L. // Basic Science Methods
for Clinical Researchers. Elsevier. Academic Press, 2017. P. 151-172.
30. Nouioui I., Carro L., Garcia-Lopez M., Meier-Kolthoff J.P., Woyke T., Kyrpides N.C., Pukall R., Klenk H.-P., Goodfellow M., Göker M. // Front. Microbiol. 2018. V. 9. P. 2007.
31. Goto M., Masegi M.-A., Yamauchi T., Chiba K.-I., Kuboi Y., Harada K., Naruse N. // J. Antibiot. (Tokyo). 1998. V. 51. № 6. P. 539-544.
32. Oja T., Palmu K., Lehmussola H., Leppäranta O., Hän-nikäinen K., Niemi J., Mäntsälä P., Metsä-Ketelä M. // Chem. Biol. 2008. V. 15. № 10. P. 1046-1057.
33. Naruse N., Goto M., Watanabe Y., Terasawa T., Dobashi K. // J. Antibiot. (Tokyo). 1998. V. 51. № 6. P. 545-552.
34. Ritacco F.V., Eveleigh D.E. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 35. № 9. P. 931-945.
35. Graziani E.I., Ritacco F.V., Bernan V.S., Telliez J.-B. // J. Nat. Prod. 2005. V. 68. № 8. P. 1262-1265.
36. Bycroft B.W., Higton A.A., Roberts A.D. Dictionary of antibiotics and related substances. London; New York. 1988. P. 944.
37. van Pee K.-H., Lingens F. // FEBS Lett. 1984. V. 173. № 1. P. 5-8.
38. Söhngen C., Podstawka A., Bunk B., Gleim D., Vetcininova A., Reimer L.C., Ebeling C., Pendarovski C., Overmann J. // Nucleic Acids Res. 2016. V. 44. № D1. P. D581-D585.
39. Schwyn B., Neilands J.B. // Anal. Biochem. 1987. V. 160. № 1. P. 47-56.
40. Poumale H.M.P., Ngadjui B.T., Helmke E., Laatscha H. // Z. Für Naturforschung B. 2006. V. 61. № 11. P. 1450-1454.
41. Song Z.-M., Zhang J.-L., Zhou K., Yue L.-M., Zhang Y., Wang C.-Y., Wang K.-L., Xu Y. // Front. Microbiol. 2021. V. 12. P. 709826.
42. Sagurna L., Heinrich S., Kaufmann L.-S., Rückert-Reed C., Busche T., Wolf A., Eickhoff J., Klebl B., Kalinowski J., Bandow J.E. // Antibiot. Basel Switz. 2023. V. 12. № 7. P. 1116.
43. Tian W., Wang C., Li D., Hou H. // Future Med. Chem.
2020. P. fmc-2019-0322.
44. Pavlova J.A., Khairullina Z.Z., Tereshchenkov A.G., Naz-arov P.A., Lukianov D.A., Volynkina I.A., Skvortsov D.A., Makarov G.I., Abad E., Murayama S.Y., et al. // Antibiotics.
2021. V. 10. № 5. P. 489.
45. Liu Y., Zhong Y., Tian W., Lan F., Kang J., Pang H., Hou H., Li D. // Anticancer. Drugs. 2019. V. 30. № 10. P. 1038-1047.
46. Hitosugi T., Zhou L., Elf S., Fan J., Kang H.-B., Seo J.H., Shan C., Dai Q., Zhang L., Xie J., et al. // Cancer Cell. 2012. V. 22. № 5. P. 585-600.
47. Wang D., Wang S., Liu Q., Wang M., Wang C., Yang H. // Oncol. Rep. 2013. V. 29. № 6. P. 2341-2347.
48. Stanojkovic T., Markovic V., Matic I.Z., Mladenovic M.P., Petrovic N., Krivokuca A., Petkovic M., Joksovic M.D. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2018. V. 28. № 15. P. 2593-2598.
49. Ijaz T., Tran P., Ruparelia K.C., Teesdale-Spittle P.H., Orr S., Patterson L.H. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. № 3. P. 351-353.
