CC BY
36
48
Актуальные вопросы гематологии
новного лиганда для CXCR2, коррелировал с неблагоприятным прогнозом и летальностью в группе критически больных пациентов с системным воспалительным ответом. Наличие тесной положительной корреляции между рCXCR2 и HNP, являющихся маркером активации нейтрофилов, свидетельствует о лейкоцитарном происхождении рCXCR2 в локальном участке воспаления, поскольку именно на ПМН экспрессируется наибольшее количество рецепторов CXCR2, которые при активации нейтрофилов ФНО, липополисахаридом или фагоцитарными стимулами про-теолитически отщепляются с поверхности клеток и переходят в растворимую форму. Мы предполагаем, что в сайте воспаления могли бы формироваться комплексы анионного рCXCR2 с катионными HNP, модулируя эффекты друг друга.
Заключение
Таким образом, рCXCR2, образующийся в месте воспаления может участвовать в защит-
ных иммунных реакциях in vivo. В нашем исследовании у двух умерших пациентов, повторно оперированных из-за развившихся хирургических осложнений и исключенных из исследования, высокое содержание HNP в перитонеальной жидкости (95,01 и 34,06 мкг/мл) сопровождалось низкой концентрацией рCXCR2 (0,29 и 0,12 нг/мл), соответственно. Это может свидетельствовать о большом количестве функционально неактивных нейтрофилов, обусловленном массовой гибелью клеток под действием бактериальных продуктов и медиаторов воспаления, которая сопровождалась нарушением отщепления CXCR2 с поверхности ПМН.
Мы предполагаем, что определение рCXCR2 в перитонеальной жидкости наряду с ИЛ-6 и HNP, может служить дополнительным диагностическим инструментом раннего распознавания ин-траабдоминальных осложнений перитонита.
УДК 612.112.95
СТИМУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 В КУЛЬТУРЕ МОНОЦИТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ РАСТВОРИМОГО РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 CXCR2
К. В. Котлинский1, Ю. В. Котлинская1, Н. Н. Войтенок2
Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, г. Минск 2Фонд развития молекулярной гематологии и иммунологии, г. Москва
Интерлейкин-8 (ИЛ-8) является основным хемотактическим фактором для полиморфноядерных нейтрофилов (ПМН) при воспалении. Ранее нами было показано, что стимуляция ПМН in vitro вызывает резкое снижение экспрессии рецептора ИЛ-8 второго типа CXCR2 на мембране ПМН и появление растворимого гликопептида CXCR2 ^CXCR2) в супернатанте. В данной работе мы изучили влияние рCXCR2 на синтез ИЛ-8 в культуре моноцитов крови и бронхоэпителиальных клеток человека A549. Было показано, что рCXCR2 достоверно стимулировал синтез ИЛ-8 в культуре моноцитов с выраженным дозозависимым эффектом. В культуре бронхоэпителиальных клеток человека A549 рCXCR2 не вызывал синтеза ИЛ-8. Действие рCXCR2 на моноциты не было связано с загрязнением препарата липополисахаридом и было обусловлено наличием как белковой, так и углеводными частями в составе молекулы рCXCR2.
Ключевые слова: растворимый рецептор интерлейкина-8 CXCR2, моноциты крови человека, бронхоэпителиальные клетки человека A549, интерлейкин-8
STIMULATION OF INTERLEUKIN-8 SYNTHESIS IN MONOCYTE CULTURE UNDER SOLUBLE INTERLEUKIN-8 CXCR2 RECEPTOR
К. V. Kotlinskiy1, Yu. V. Kotlinskaya1, N. N. Voitenok2
Republican Research Centre for Hematology and Transfusiology, Minsk 2Fund for Molecular Hematology and Immunology, Moscow
Interleukin-8 (IL-8) is the main chemotactical factor for polymorphonuclear neutrophils (PMN) in inflammation. We have already shown that PMN stimulation in vitro causes a sharp decrease of IL-8 receptor expression of second type CXCR2 on the PMN membrane and an emergence of soluble glykopeptid CXCR2 (pCXCR2) in the supernatant. In this work we have studied the effect of рCXCR2 on IL-8 synthesis in the monocyte culture of the blood and bronchoepitheial human cells A549. It was shown that рCXCR2 reliably stimulated IL-8 synthesis in the monocyte culture with the evident doze-dependent effect. рCXCR2 did not cause IL-8 synthesis in the culture of the bronchoepitheial human cells A549. The influence of рCXCR2 on the monocytes was not related to the lypopolysaccharide contamination of the preparation and was caused by the protein and carbohydrade parts, included in рCxCR2 molecule.
Key words: soluble receptor of interleukin-8 CXCR2, human blood monocytes, bronchoepitheial human cells A549, interleukin-8.
Актуальные вопросы гематологии
49
Введение
Интерлейкин-8 (ИЛ-8/СХСЬ8), белок с молекулярной массой 8,3 кДа, является основным хемотактическим фактором, вызывающим миграцию ПМН крови в ткани при воспалении [7]. Нейтрализация ИЛ-8 антителами in vivo приводит к подавлению миграции ПМН в очаг воспаления [9]. Свое действие ИЛ-8 оказывает через два мембранных рецептора, CXCR1 и CXCR2, которые активируют каскад внутриклеточных реакций, приводящих к хемотаксису и активации ПМН [7].
В наших предыдущих исследованиях было впервые показано, что снижение уровня экспрессии CXCR2 на поверхности нейтрофилов in vitro при фагоцитозе микроорганизмов, под действием фактора некроза опухолей а (ФНО) или липополисахарида (ЛПС) происходит путем протеолитического отщепления N-концевого внеклеточного фрагмента CXCR2 и сопровождается появлением растворимого CXCR2 ^CxCR2) [1, 3, 4]. По данным гель-проникающей хроматографии рCXCR2 имеет молекулярную массу 35-40 кДа [4]. Анализ растворимого рецептора с помощью электрофореза в денатурирующих условиях показал, что молекулярная масса растворимого рецептора составляет 14-17 кДа [4]. Показано, что рCXCR2 N-гликозилирован, имеет самую низкую изоэлектрическую точку среди всех известных цитокинов и растворимых цитокино-вых рецепторов (pI 3,2), может накапливаться в местах воспаления in vivo и всегда выявляется в моче здоровых лиц и больных с различной патологией [4, 1]. Физико-химические свойства растворимого CXCR2, экскретируемого с мочой, идентичны свойствам рCXCR2 из супернатанта активированных нейтрофилов [1].
Известно, что биологически активные молекулы, обладающие сходными с рCXCR2 физико-химическими свойствами — низким значением изоэлектрической точки, а также имеющие в своем составе углеводные остатки (полирибонуклеиновые кислоты, ЛПС клеточной стенки грам-отрицательных бактерий и др.), способны стимулировать моноциты крови человека [6, 10]. При воспалительных процессах моноциты крови и тканевые макрофаги играют центральную роль в развитии защитной воспалительной реакции, продуцируя различные цитокины, в т. ч. ИЛ-8, ФНО, ИЛ-1 и др. [12]. Взаимодействие между макрофагами и грану-лоцитами является важнейшим компонентом воспалительного ответа [5, 2]. Ряд цитокинов, синтезируемых моноцитами и макрофагами, такие как ИЛ-8, ИЛ-1, ФНО и другие могут активировать гранулоциты, однако практически ничего не известно о гранулоцитарных факторах, модулирующих активность моноцитов/макрофагов человека. Ранее нами было показано, что небольшие ка-
тионные белки а-дефензины способны запускать синтез ИЛ-8 в моноцитах человека [8]. В данной работе мы изучили влияние рCXCR2 на синтез ИЛ-8 в культуре моноцитов крови и бронхоэпителиальных клеток человека A549.
Материалы и методы исследования
Кровь здоровых доноров стабилизировали гепарином и наслаивали на одноступенчатый градиент Histopaque («Sigma»). После центрифугирования при 400 g в течение 30 мин слой клеток, находящийся в интерфазе отбирали и дважды отмывали средой RPMI-1640, содержащей 1 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Фракция моноцитов была получена путем адгезии суспензии клеток на пластике в течение 1 часа при 37 °C.
Адгезивные моноциты и клетки линии А549 культивировали в концентрации 2 я 106 клеток/мл в среде RPMI-1640, содержащей 5 % ЭТС в атмосфере 5 %-ного СО2 при температуре 37 °С в присутствии факторов в течение 20 ч. Жизнеспособность клеток на всех этапах эксперимента составляла более 95 % по отношению к соответствующим контрольным образцам (по данным колориметрического теста с использованием витального красителя AlamarBlue). ИЛ-ф (ООО «Цитокин) в концентрации 5 нг/мл использовали в качестве положительного контроля. ЛПС Escherichia coli («Sigma») добавляли в концентрации 200 пг/мл. Полимиксин Б («Sigma») использовали в концентрации 50 Ед/мл. рCXCR2 и N-гликозидазу F («NEB») смешивали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) из расчета 10 Ед фермента на 1 мкг рCXCR2 и преинкубировали в течение 2-х ч. при 37 °C перед добавлением к моноцитам, или преинкубировали по отдельности в ФСБ и смешивали в момент добавления к моноцитам. рCXCR2 и протеиназу К («Merk») смешивали в ФСБ из расчета 0,5 мкг фермента на 1 мкг рCXCR2 и преинкубировали в течение 2 часов при 37 °C перед добавлением к моноцитам, или преинкубировали по отдельности в ФСБ и смешивали в момент добавления к моноцитам. Содержание ИЛ-8 в культуральных супернатантах определяли ранее разработанным в нашей лаборатории твердофазным иммуноферментным методом [11].
Выделение рCXCR2 из мочи здоровых доноров ^^CXCR^) проводили методом иммуноаффинной сорбции с последующей очисткой методом гель-проникающей хроматографии на колонке Zorbax GF-250 хроматографа высокого давления («Agilent») [1, 3, 4]. Чистота препарата рCXCR2 после иммунсорбции с последующей очисткой по показаниям оптической плотности составляла более 96 %. Содержание эндотоксина в очищенном препарате рCXCR2, определенное с помощью хромогенной тест-системы «Hycult Biotech», не превышало 5 пг на 1 мкг рCXCR2.
50
Актуальные вопросы гематологии
Результаты исследования и их обсуждение Чтобы определить, стимулирует ли pCXCR2 синтез ИЛ-8 в культуре моноцитов крови и бронхоэпителиальных клеток человека A549, мы инкубировали клетки в присутствие рCXCR2. Анализ культуральных супернатантов показал, что рCXCR2 в концентрации 0,2 мкг/мл и 1 мкг/мл повышал продукцию ИЛ-8 в 2,1 и 6 раз, соот-
ветственно, в культуре моноцитов (рисунок 1А). В культуре бронхоэпителиальных клеток человека A549 рCXCR2 не вызывал синтез ИЛ-8 (рисунок 1б), что может свидетельствовать о специфическом действии рCXCR2 на моноциты и обеспечиваться специфическими рецепторами на клетках, связывание которых ведут к активации синтеза ИЛ-8 в моноцитах.
а
б
Рисунок 1 — Стимуляция синтеза ИЛ-8 в культуре моноцитов крови (а) и клеток линии А549 (б) под действием рСХСК2:
а — результаты пяти независимых экспериментов с моноцитами 5 различных доноров (среднее ± SEM); * P > 0,05, ** — P > 0,01, достоверность межгрупповых различий оценивали с использование критерия t-Стьюдента. б — результаты репрезентативного эксперимента (среднее значение ± SD)
При очистке белков из биологических жидкостей человека необходимо контролировать их загрязнение ЛПС грамм-отрицательных бактерий, который способен стимулировать лейкоциты крови. Для того, чтобы проверить, могут ли следовые количества ЛПС вызывать сходную индукцию ИЛ-8 в моноцитах, мы инкубировали моноциты с рCXCR2 (1 мкг/мл) в присутствии антибиотика полимиксина Б, который нейтрализует действие ЛПС. Из рисунка 2 видно, что активность рCXCR2 наблюдается и в присутствии полимиксина Б, который в том же эксперименте нейтрализовал ЛПС в концентрации, 20-кратной по отношению к его примеси в использованном препарате рCXCR2.
рCXCR2 представляет собой кислый гликопротеин, причем углеводная часть составляет более 2/3 молекулярной массы молекулы [4]. Чтобы установить какой компонент молекулы
рCXCR2 обеспечивает активность рCXCR2 в культуре моноцитов, мы использовали протеолитический фермент протеиназу К и дегликози-лирующий фермент N-гликозидазу F.
При обработке препарата рCXCR2 протеи-назой К и последующей нейтрализации фермента добавлением сыворотки индукция синтеза ИЛ-8 в культуре моноцитов полностью подавлялась. При контрольном добавлении сыворотки до инкубации препарата рCXCR2 с про-теиназой К активность рCXCR2 (1 мкг/мл) не подавлялась (рисунок 3 а). При исследовании действия N-гликозидазы F на активность рCXCR2 (рисунок 3б) было показано снижение активности рCXCR2, что свидетельствует о важности как белкового, так и углеводного компонента для проявления биологической активности рCXCR2 в культуре моноцитов крови человека.
Рисунок 2 — Влияние липополисахарида на стимуляцию синтеза ИЛ-8 в культуре моноцитов крови человека. Представлены результаты репрезентативного эксперимента (среднее значение ± SD)
Актуальные вопросы гематологии
51
а б
□ ФСБ
■ M-pCXCR2
■ M-pCXCRZ пред инкубированный с ферментом
□ M-pCXCR2, не инкубированный с ферментом
N-гпикозидаза F
Прсттеиназа К + + +
Рисунок 3 — Стимуляция синтеза ИЛ-8 в культуре моноцитов крови человека под действием рСХСК2 в присутствии либо отсутствии протеиназы К (а) и гликозидазы F (б). Представлены результаты репрезентативного эксперимента (среднее значение ± SD)
Таким образом, нами впервые показана способность pCXCR2 стимулировать синтез ИЛ-8 в культуре моноцитов крови и установлено, что как белковая, так и углеводная части рCXCR2 необходимы для проявления этой активности. Это может указывать на наличие биологической активности у рCXCR2 in vivo в очаге воспаления и на его роль в реакциях естественного иммунитета, направленную на привлечение нейтрофилов в очаг инфекции и поддержания их активированного состояния.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Выявление и иммунохимическая характеристика растворимой формы рецептора CXCR2 интерлейкина-8 человека / С. Т. Ака-лович [и др.] // Доклады НАН Беларуси. — 2008. — № 6. — С. 87-92.
2. Васильева, Г. И. Коопеpативное взаимодействие моно- и полинуклеаpных фагоцитов, опосpедованное моно- и нейтpофилоки-нами доноpов / Г. И. Васильева, И. А. Иванова, С. Ю. Тюкавкина // Иммунология. — 2000. — № 5. — С. 11-17.
3. Роль металлопротеиназ в регуляции экспрессии рецептора интерлейкина-8 CXCR2 на нейтрофилах человека / Ю. В. Кот-линская [и др.] // Доклады НАН Беларуси. — 2011. — № 3. — С. 83-87.
4. Биохимическая характеристика растворимой формы рецептора CXCR2 интерлейкина-8 человека / К. В. Котлинский [и др.] // Весщ НАН Беларуси Сер. бiял. навук. — 2009. — № 2. — С. 85-89.
5. Потапнев, М. П. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении / М. П. Потапнев // Иммунология. — 1995. — № 4. — С. 34-40.
6. Akira, S. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR / S. Akira, H. Hemmi // Immunol.Lett. — 2003. — Vol. 85. — P. 85-95.
7. Baggiolini, M. Chemokines in pathology and medicine / M. Baggiolini // J. Intern. Med. — 2001. — Vol. 250. — P. 91-104.
8. Human neutrophil а-defensin modulates cytokine production in human monocytes and adhesion molecule expression in endothelial cells / Y. V. Chaly [et al.] // Eur. Cytokine Netw. — 2000. — Vol. 11. — P. 257-266.
9. Systemic neutralization of interleukin-8 markedly reduces neutrophilic pleocytosis during experimental lipopolysaccharide-induced meningitis in rabbits / R. A. Dumont [et al.] // Infect. Immun. — 2000. — Vol. 68. — P. 5756-5763.
10. Characterization of conserved viral leader RNA sequences that stimulate innate immunity through TLRs / A. Forsbach [et al.] // Oligonucleotides. — 2007. — Vol. 17. — P. 405-417.
11. A monoclonal antibody and an enzyme immunoassay for human Ala-IL-8(77) / N. N. Nashkevich [et al.] // J. Immunol. Methods. — 2002. — Vol. 270. — P. 37-51.
12. Neutrophil chemotactic factor produced by lipopolysaccharide (LPS)-stimulated human blood mononuclear leukocytes: partial characterization and separation from interleukin 1 (IL 1) / T. Yoshimura [et al.] // J. Immunol. — 1987. — Vol. 139. — P. 788-793.
УДК 611.013.395+615.324
ОПЫТ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
С. И. Кривенко, А. Л. Усс, Н. И. Дедюля 9-я городская клиническая больница, г. Минск
Перспективным и уже применяемым в клинической практике в Республике Беларусь направлением клеточной терапии является тандемная трансплантация гемопоэтических и мезенхиальных стволовых клеток (ГСК и МСК) при онкогематологических заболеваниях и рассеянном склерозе. МСК также эффективно используются в качестве сопутствующей иммуносупрессивной терапии при возникновении острой и хронической РТПХ. Протоколы применения МСК для терапии онкогематологических больных и больных рассеянным склерозом утверждены Министерством здравоохранения Республики Беларусь. Эффективность клеточной терапии с использованием МСК изучается в клинических исследованиях при лечении различных заболеваний: генетически обусловленных дегенеративных заболеваний скелета, ишемической болезни, цирроза печени, нейродегенеративных заболеваний (паркинсонизм, болезнь Альцгеймера). Экспериментальные работы и клинические испытания показали положительный эффект трансплантации МСК при инфаркте миокарда и заместительной терапии при печеночной недостаточности.
Ключевые слова: стволовые клетки, трансплантация мезенхимальных стволовых клеток, реакция «трансплантат против хозяина», рассеянный склероз, кардиомиопластика, заболевания печени.
