CC BY
81
Медицинская Иммунология 2005, Т. 7, Ms 5-6, стр 579-582 © 2005, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ИНДУКЦИИ СИНТЕЗА ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ДЕФЕНЗИНОВ IN VITRO
Чалый Ю.В., Котлинский К.В., Шолух А.М., Войтенок Н.Н.*
РНПЦ гематологии и трансфузиологии МЗ РБ, Минск, Беларусь;
Фонд развития молекулярной гематологии и иммунологии, Москва, Россия
Резюме. Изучены закономерности индукции синтеза интерлейкина-8 (IL-8) под действием а-дефензи-нов в культуре различных клеток человека: линии бронхоэпителиальной карциномы A-549, моноцитов и макрофагов, дифференцированных из моноцитов в присутствии М-CSF, эндотелиальных клеток пупочного канатика (HUVEC), эмбриональных клеток почки человека лини НЕК293, миеломоноцитарной линии ТНР-1. Дефензины в концентрации 10-5-10-4М оказывали цитотоксическое действие на клетки линии А-549 в бессывороточной культуре и индуцировали синтез IL-8. Добавление сыворотки полностью подавляло цитотоксический эффект и индукцию синтеза IL-8. Сходные данные получены для клеток линии HEK293 и эндотелиальных клеток.
В отличие от клеток A-549, HEK293 и эндотелия, добавление сыворотки в культуры моноцитов и макрофагов не подавляло синтеза IL-8 под действием дефензинов в концентрации 10-5-10-4М, несмотря на полное подавление цитотоксичности. Данные указывают на то, что индукция синтеза IL-8 в культуре моноцитов и макрофагов под действием дефензинов может быть обусловлена существованием специфических клеточных рецепторов для дефензинов и, возможно, может наблюдаться и in vivo.
Ключевые слова: моноциты, макрофаги, IL-8, человеческие а-дефензины.
Chaly Y.V., Kotlinsky K.V., Sholukh А.М., Voitenok N.N.
THE STUDY OF REGULARITIES OF INDUCTION OF IL-8 SYNTHESIS
BY NEUTROPHIL DEFENSINS IN VITRO
Abstract. We explored the effects of defensins on IL-8 synthesis in various human cells, including bronchoep-ithelial cell line A-549, monocytes, monocyte-derived macrophages differentiated in the presence of M-CSF, HUVEC cells, HEK293 and THP-1 cell lines. HNP at 10-5-10-4М induced IL-8 production and cytotoxicity in serumless A-549 culture. The addition of serum abrogated the cytotoxicity along with the induction of IL-8 synthesis. Similar effects were observed in HEK293 cell line and HUVEC.
The induction of cytotoxicity along with IL-8 production by HNP at 10-5-10-4М was also observed in the serum-less cultures of human monocytes and macrophages. However, monocytes and macrophages retained HNP-induced production of IL-8 after the addition of serum, while cytotoxic effect of HNP was completely inhibited. The data imply a specific interaction of alpha-defensins with some membrane receptors of monocytes and macrophages that leads to the induction of IL-8 and might also occur in vivo. (Med. Immunol., 2005, vol.7, №5-6, pp 579-582)
Дефензины играют центральную роль в антибактериальной защите многоклеточных и имеют схожую структуру у насекомых, растений и различных классов позвоночных [1-3]. Около 5% общего белка
Адрес для переписки:
Котлинский Константин Вячеславович,
Беларусь, 220141, г. Минск, ул. Шугаева, д. 19/2, кв.14. Тел.: (017) 289-86-19.
E-mail: [email protected]
нейтрофильных лейкоцитов человека составляют а-дефензины (human neutrophil peptides, HNP) - катионные тридисульфидные пептиды с молекулярной массой 3 - 4 кДа [1-3]. Они микробицидны для различных бактерий, грибков и оболочечных вирусов. Дефензины HNP 1-3 выделяются путем дегрануляции нейтрофилов в процессе их локальной и системной активации и в высокой концентрации обнаруживаются в плазме крови при сепсисе и септическом шоке [4].
579
Чалый Ю.В., Котлинский К.В. и др.
Медицинская Иммунология
Отправным моментом наших исследований было предположение о том, что дефензины могут принимать участие в регуляции воспаления и влиять на течение болезней [5]. Нами было показано, что ней-трофильные а-дефензины способны стимулировать экспрессию фактора некроза опухолей (TNF) и интерлейкина-^ (IL-1P) в моноцитах человека, но подавлять экспрессию IL-10 [6].
В работах лаборатории J. Oppenheim было показано, что дефензины могут вызывать хемотаксис Т-клеток и дендритных клеток через рецептор ^R6 [7] и стимулировать синтез мРНК RANTES, MIPa, MIP1P и некоторых других хемокинов и их рецепторов, взаимодействуя с TLR4 [8]. Большое внимание привлекли данные Van Wetering с коллегами [9] о том, что HNP стимулируют синтез интерлейкина-8 (IL-8) в клетках линии А-549 из бронхоальвеолярного эпителия человека. Было высказано предположение, что индукция синтеза IL-8 в клетках бронхоальвеолярного эпителия под действием нейтрофильных дефензинов может быть важным физиологическим механизмом антибактериальной защиты и регуляции воспаления в бронхах и легких [10].
В настоящей работе изучены закономерности индукции синтеза IL-8 под действием нейтро-фильных а-дефензинов HNP in vitro в культурах моноцитов, макрофагов, клеток линии А-549 из бронхоальвеолярного эпителия человека, клеток линии НЕК (human embryonic kidney cells), эн-дотелиоцитов и клеток миеломоноцитарной линии ТНР-1.
Материалы и методы
Альфа-дефензины HNP выделяли из нейтрофилов крови человека кислотной экстракцией катионных пептидов из гранул с последующей хроматографической очисткой [11]. Содержание эндотоксина в препарате HNP было менее 0,3 нг/мг.
Моноциты получали путем адгезии на пластике из фракции мононуклеарных лейкоцитов донорской крови, выделенных на фиколл/верографине, и культивировали в платах 20 часов в среде RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) или без сыворотки. Макрофаги получали путем культивирования моноцитов с рекомбинантным М-CSF в течение 7 дней. Клетки линии А-549 из бронхоальвеолярного эпителия человека и клетки НЕК культивировали в среде DMEM/10% ЭТС, эндотелиальные клетки HUVEC (Clonetics) культивировали в среде EBM (Clonetics). Клетки НЕК, трансфециро-ванные кДНК TLR4 были предоставлены H. Heine, Borstel, Германия. Оценка жизнеспособности клеток проводилась с использованием трипанового синего или Alamar Blue.
Уровень продукции IL-8 в культурах определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) как описано ранее [12, 13].
Результаты и обсуждение
Изучение закономерностей индукции синтеза IL-8 под действием нейтрофильных дефензинов в культурах различных клеток мы начали с воспроизведения данных Van Wetering и соавторов [9, 10], ко-
Табл. ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-ДЕФЕНЗИНОВ HNP НА СИНТЕЗ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ МОНОЦИТОВ КРОВИ И В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЛИНИИ А-549 ИЗ БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНОГО ЭПИТЕЛИЯ ЧЕЛОВЕКА
A-549 Моноциты
RPMI 1640 без ЭТС RPMI 1640 + 5% ЭТС RPMI 1640 без ЭТС RPMI 1640 + 5% ЭТС
Индук- торы IL-8, нг/мл Жизне- способ- ность, % IL-8, нг/мл Жизне- способ- ность, % IL-8, нг/мл Жизне- способ- ность, % IL-8, нг/мл Жизне- способ- ность, %
Среда 0,47±0,17 100 2,03±0,09 100 0,2±0,07 100 1,71±0,26 100
HNP 10-7M 0,51±0,12 95±1,6 1,97±0,13 108±5,4 0,11±0,04 100±3,5 1,02±0,15 103±3,8
HNP 10-6M 0,37±0,05 93±2,9 2,06±0,11 92±2,5 0,04±0,01 98±6,5 1,01±0,08 104±2,6
HNP 10-5M 1,69±0,23 84±2 2,12±0,06 83±3,5 11,18±0,38 93±4,7 1,75±0,06 106±2,9
HNP 3x10-5M 7,47±1,11 39±3,4 2,77±0,14 101±5,6 4,4±0,29 60±11,7 3,59±0,21 103±3,6
HNP 10-4M 10,13±0,41 24±3,1 2,65±0,14 90±1 1, 18±0,15 4±5,6 7,36±0,31 97±3,6
TNFa 5нг/мл 5,06±0,29 94±1,7 14,97±0,01 89±2,2 0,49±0,05 93±1,2 4,83±0,14 100±1,7
IL-1 p 5нг/мл 12,14±0,23 97±1,4 15,28±0,3 102±2,2 1,83±0,39 100±3,7 10,42±1,74 106±2,9
ЛПС 10нг/мл 0,24±0,07 98±2,4 2,6±0,13 107±2,8 2,64±0,42 102±2,3 16,58±0,22 104±2,6
580
2005, Т. 7, № 5-6
Синтез IL-8 под действием дефензинов
торые показали, что HNP стимулируют синтез IL-8 в клетках линии А-549 из бронхоальвеолярного эпителия. Van Wetering и соавторы описали индукцию синтеза IL-8 в бессывороточной культуре клеток А-549. В наших опытах HNP в концентрации 10-510-4 М также индуцировал высокий уровень синтеза IL-8 в бессывороточной культуре клеток А-549 (таблица), количественно сопоставимый с действием IL-1 и TNF.
Далее нами было установлено, что, как и в случае клеток А-549, в бессывороточных культурах клеточных линий НЕК, ТНР-1 и эндотелия, а также моноцитов и макрофагов дефензины в концентрации 10-5 -- 3х10-5 М индуцировали высокий уровень синтеза IL-8. Как видно в таблице, стимуляция синтеза IL-8 в бессывороточной культуре А-549 и моноцитов сопровождалась полной (10-4 М) или частичной (10-5- 3х10-5 М) цитотоксичностью HNP. Наибольший синтез IL-8 наблюдался при частичной цитотоксичности HNP (табл.), но снижался при высокой цитотоксичности HNP и не наблюдался при ее отсутствии. Аналогичная закономерность отчетливо проявлялась и в бессывороточных культурах всех исследованных клеток. Мы полагаем, что это явление связано с известным феноменом стимуляции синтеза IL-8 в культуре «прикрепляющихся» клеток под действием различных факторов, вызывающих отслаивание клеток и субтоксический эффект [14].
При изучении индукции синтеза IL-8 под действием HNP в культурах, содержавших сыворотку, были выявлены резкие различия между разными клетками. Таблица показывает, что в присутствии сыворотки полностью отменялась цитотоксичность HNP. При этом клетки А-549 не реагировали на HNP в присутствии сыворотки, тогда как моноциты отвечали на HNP достаточно высоким синтезом IL-8.
Нами показано, что присутствие 10% сыворотки в культуре полностью отменяло цитотоксичность и индукцию синтеза IL-8 в культуре НЕК, в том числе трансфецированных TLR4. В культурах моноцитов (табл.), макрофагов и ТНР-1, содержавших сыворотку, цитотоксичность HNP полностью отменялась, но индукция синтеза IL-8 сохранялась. Индукция синтеза IL-8 в этих клетках не была связана с загрязнением препаратов HNP эндотоксином, так как не отменялась в присутствии полимиксина В и не наблюдалась в клетках НЕК-TLR4, хорошо реагирующих на ЛПС.
Результаты работы позволяют заключить, что индукция синтеза IL-8 в культурах клеток А-549 и НЕК была связана с цитотоксичностью HNP в бессывороточной среде и отменялась в присутствии сыворотки, т.е., по-видимому, является чисто «культуральным» феноменом и не имеет отношения к физиологическим событиям in vivo. Напротив, моноциты и макрофаги реагируют на HNP индукцией синтеза IL-8 и в присутствии сыворотки, что может
иметь важное физиологическое значение в регуляции воспаления и предполагает наличие специфических рецепторов для HNP. Результаты работы также доказывают, что индукция синтеза IL-8 под действием HNP в моноцитах и макрофагах не опосредована через рецепторы TLR4.
Список литературы
1. Lehrer I.R., Ganz T. Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence //Curr. Opin. Immunol.- 1999.- v.11.- p.23-27.
2. Lehrer R.I., Ganz T. Antimicrobial peptides of vertebrates // Cur. Opin. Immunol. - 1998. - V. 10. - P. 4144.
3. Lehrer R.I., Lictenstein A.K., Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells // Annu. Rev. Immunol. - 1993. - V. 11. - P. 105128.
4. Lehrer R.I., Ganz T. Defensins of vertebrate animals // Curr. Opin. Immunol. -2002. -V.14. -P. 96-102.
5. Мисуно Н.И., Колесникова Т.С., Лерер Р., Ганц Т., Войтенок Н.Н.. Влияние дефензина HNP-1 на продукцию фактора некроза опухолей альфа моноцитами крови человека in vitro // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. - 1992 - Т. 113(5). - С. 524-527.
6. Chaly Y.V., Paleolog E.M., Kolesnikova T.S. Human neutrophil a-defensin modulates cytokine production in human monocytes and adhesion molecule expression in endothelial cells //Eur. Cytokine Netw.
- 2000. - V. 11. - P. 257-266
7. Yang D., Chertov O., Bykovskaia S. N. Beta-de-fensins: linking innate and adaptive i mmunity through dendritic and T cell CCR6 // Science.- 1999.- V. 286. -P. 525-528.
8. Biragyn A., Ruffini P. A., Leifer C. A., Klyushnen-kova E., Shakhov A., Chertov O., Shirakawa A. K., Far-ber J. M., Segal D. M., Oppenheim J. J. , Kwak, L. W. Toll-Like Receptor 4-Dependent Activation of Dendritic Cells by p-Defensin 2 // Science.- 2002.- V. 298. - P. 1025-1029.
9. Van Wetering S., Mannesse-Lazeroms S. P. G., Van Sterkenburg M. A. J. A. Effect of defensins on IL-8 synthesis in airway epithelial cells // Am. J. Physiol. -1997. - V. 272. - P. L888-L896.
10. Aarbiou, J., Ertmann M., van Wetering S., Van Noort P., Rook D., Rabe K. F., Litvinov S. V., Van Kriek-en J. H., de Boer W. I., Hiemstra P. S Human neutrophil defensins induce lung epithelial cell proliferation in vitro// J. Leukoc. Biol. 2002.- V. 72. - P. 167-174.
11. Ganz T., Selsted M. E., Szklarek D. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils // J. Clin. Invest. - 1985. - V. 76. - P. 1427-1435.
12. Ko Y., Mukaida N., Panyutich A., Voitenok N. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for human interleukin-8 //J. Immunol. Meth. - 1992. - V. 149.
- P. 227-235.
581
Чалый Ю.В., Котлинский К.В. и др.
Медицинская Иммунология
13. Nashkevich N.N., Akalovich S., Louneva N., Heavner G.A., Voitenok N.N. A monoclonal antibody and an enzyme immunoassay for human Ala-IL-8(77) // J. Immunol. Meth. - 2002. - V. 270(1). - P. 37-51.
14. Shibata Y., Nakamura H., Kato S., Tomoike H. Cellular detachment and deformation induce IL-8 gene expression in human epithelial cells // J. Immunol. -1996. - V. 156. - P. 772-777.
поступила в редакцию 25.02.2005 принята к печати 17.04.2005
582
