CC BY
63
of Specific Antibodies Against an Oligomeric Form ofNucleophos-min in Tumor Cells. Patent RF N 2401275, 2009. (in Russian)
24. Bulycheva T.I., Deinkeo N.L., Volpina O.M., Vladimirova N.M. Im-munocytochemic visualization of monomelic and oligomeric forms of the nucleolar protein B23/nucleophosmin in human lymphocytes during proliferation. Immunologiya. 2011; 5: 231-6. (in Russian)
25. Bulycheva T.I., Deinkeo N.L. A Method of Immunocytochemic Evaluation of the Proliferative State of Lymphocytes Based on the Patterns of Expression of the C Terminus Fragment of the Protein B23/Nucleophosmin in the Reaction of Indirect Immunofluorescence. Patent RF № 2438135, 2011. (in Russian)
26. Deineko N.L., Bulycheva T.I., Grigor'ev A.A., Kovrigina A.M., Vol'pina O.M., Vladimirova N.M. Immunocytochemical identification of monomomeric and oligomeric forms of the protein B23/ nucleofosmin in human lymphocytes from patients with various lymphoproliferative diseases. Immunologiya. 2014; 2: 68-73. (in Russian)
27. Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M. Ki-67 in breast cancer prognostic and predictive potential. Lancet Oncol. 2011; 11 (2): 174-83.
Received 01.10.14
© БОГДАНОВА И.М., ПОНОМАРЕНКО Е.А., 2015 УДК 615.277.3.015.44.076.9
Богданова И.М., Пономаренко Е.А.
стимуляция опухолеспецифического иммунного ответа цитостатическими химиопрепаратами в популяции клеток селезенки мышей in vitro
ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, г Москва
Исследовали влияние противоопухолевых химиопрепаратов доксорубицина, цисплатина и топотекана на клетки опухолевых линий различного генеза in vitro. Культивирование опухолевых клеток с клетками селезенки интактных мышей приводит к опухолеспецифической активации иммунитета, регистрируемой по выработке провоспалитель-ных цитокинов фактора некроза опухоли а и интерферона-Y. При оценке прямого цитотоксического действия химиопрепаратов на клетки опухолевых линий выявлены чувствительные и резистентные линии. Предварительная обработка опухолевых клеток цитостатиками с последующей отмывкой приводит к повышению уровня цитокинов в надосадочной жидкости 24-часовых культур опухолевых клеток и клеток селезенки. Это, очевидно, связано с усилением экспрессии иммуногенных детерминант в опухолевых клетках, претерпевающих начальную стадию апоптоза. Взаимосвязь между повышением иммуногенного потенциала опухолевых клеток, обработанных цитостатиками, и их чувствительностью к действию химиопрепаратов выявлена только при использовании опухолевых линий одного тканевого происхождения, глиобластом 101.8 и С6. В случае с клетками L929 (фибробластоподобная опухолевая клеточная линия), резистентными к цитотоксическому действию цитостатиков, выявлена обратная зависимость между резистентностью опухоли к цитостатикам и индукцией иммуногенного потенциала. Возможно, экспрессия иммуно-генных детерминант на опухолевых клетках и их гибель, индуцированная действием препаратов, значительно разобщены во времени. Необходимы дополнительные эксперименты для ответа на поставленные вопросы.
Ключевые слова: опухолевые клеточные линии; клетки селезенки; иммуногенность; противоопухолевые хи-миопрепараты.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(3): 158-161.
Bogdanova I.M., Ponomarenko E.A.
STIMULATION OF TUMOR-SPECIFIC IMMUNE RESPONSE BY CYTOSTATIC CHEMOTHERAPEUTIC DRUGS IN POPULATION MICE SPLEEN CELLS IN VITRO
The influence of anticancer chemotherapeutic drugs (doxorubicin, cisplatin, topotekan) on the different tumor cell lines was investigated in vitro. The cultivation of tumor cells with splenic ones from intact mice resulted in the activation of tumor-specific immune response, detected by the proinflammatory cytokines production - TNF-а and IFN-y. When estimating a direct cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs, sensitive and resistant cell lines were detected. Pretreatment of tumor cells by cytostatics and subsequent washing leaded to increase of cytokines production in the supernatant of 24 hours tumor and splenic cells culture. Obviously, that connected with the enhancement of immunogenic determinants in tumor cells, undergoing the initial stage of apoptosis. The enhancement of immunogenic determinants in tumor cells, treated by cytostatics, correlated with their susceptibility to chemotherapeutic drugs action in cases of 101.8 and C6 glioblastomas only. L929 cells (fibroblast-like tumor cell line) were resistant to cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs and had inverse relationship between tumor resistance to cytostatics and the induction of immune potential. Probably, the expression of immunogenic determinants on tumor cells and their death, induced by drugs, are significantly disconnected in a time. Additional experiments are clearly needed to clarify this point.
Keyword: tumor cell lines; spleen cells;immunogenicity; chemotherapeutic drugs.
citation: Immunologiya. 2015; 36(3): 158-161. (in Russian)
Иммунная система может идентифицировать и разрушать вновь образуемые опухолевые клетки, т.е. осуществлять противоопухолевый иммунный надзор. В процессе онкогенеза
Для корреспонденции: Богданова Ирина Михайловна, mor-folhum@mail.ru
For correspondence: Bogdanova Irina Mikhaylovna, morfolhum@mail.ru
в результате многочисленных мутаций опухолевые клетки начинают экспрессировать измененные антигенные пептиды, которые могут быть распознаны иммунной системой как измененное «свое» [1]. К настоящему времени в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях получены неоспоримые доказательства участия клеток врожденного и адаптивного иммунитета в противоопухолевом иммунном надзоре [2, 3]. Взаимосвязь между врожденным и
приобретенным противоопухолевым иммунитетом при развитии протективного Т-клеточного ответа осуществляется при участии цитокинов, хемокинов и ассоциированных с гибелью клеток молекулярных паттернов (damage-associated molecular pattern - DAMP) [4, 5]. Ответ на опухоль может быть зарегистрирован при in vitro сокультивировании опухолевых клеток и спленоцитов иммунокомпетентных мышей по выработке провоспалительных цитокинов. Эффект опухолеспецифичен и проявляется уже через 4 ч, достигая максимального значения через 24 ч. Цитокины, вырабатываемые в популяции клеток селезенки в ответ на опухоль, включают фактор некроза опухоли (ФНОа), интерлейкин-6 (ИЛ-6), интерферон- у (ИФН-у) [6]. В популяции сплено-цитов клетки-эффекторы, отвечающие на опухоль в столь ранние сроки, представлены дендритными клетками (ДК), плазмацитоидными клетками, естественными киллерными клетками и ИФН-продуцирующими киллерными ДК [7-9], а также макрофагами и не рестриктированными по главному комплексу гистосовместимости у5 Т-клетками [1]. Иммуно-генный потенциал опухолевых клеток, т. е. способность к индукции противоопухолевого иммунного ответа, определяется набором белков с иммуномодулирующими свойствами, называемыми сигналами опасности, которые регистрируются клетками иммунной системы через соответствующие рецепторы. Повышение уровня таких сигналов - один из способов индукции эффективного противоопухолевого иммунного ответа. В многочисленных работах последних лет, посвященных этой проблеме, показана зависимость между типом гибели опухолевых клеток и экспрессией молекулярных детерминант, ассоциированных с иммуногенным потенциалом опухоли [10, 11]. Апоптоз, или физиологическая гибель клеток, - непрерывный, неиммуногенный процесс обновления клеточного пула организма, который протекает в отсутствие сигналов опасности, исходящих от погибающих клеток [12]. Апоптотическая гибель опухолевых клеток, индуцированная стрессом (радио- или химиотерапия), может приводить к повышению их иммуногенности [5, 13, 14]. Показано, что цитостатики антрациклиновой группы наряду с прямым действием индуцируют развитие противоопухолевого иммунного ответа в системе врожденного и адаптивного иммунитета [15- 8], необходимого для оптимального терапевтического результата. Приобретение опухолевыми клетками иммуногенного фенотипа зависит от ряда факторов. Наряду с внутренними факторами, которые определяют тип ответа, а также потенциальную иммуногенность опухолевых клеток, важное прогностическое значение имеет функциональное состояние иммунной системы хозяина [19].
Иммуногенная клеточная гибель вовлекает изменения состава клеточной поверхности и освобождение растворимых иммуногенных сигналов. Иммуногенная клеточная гибель характеризуется ранней экспрессией шаперонов на клеточной поверхности, включая кальретикулин и/или белки теплового шока. Преапоптотическая транслокация внутриклеточного кальретикулина на поверхности плазматической мембраны имеет ключевое значение для распознавания и захвата погибающих опухолевых клеток ДК, а также влияет на созревание ДК [20-23]. Блокада или нокдаун кальретикулина подавляют фагоцитоз обработанных доксорубицином опухолевых клеток и отменяют их иммуногенность у мышей. Другие ДНК-повреждающие агенты, такие как митомицин С и этопозид, не индуцируют иммуногенную гибель клеток [24]. В экпери-ментальной системе на мышах, несущих стабилизированные канцерогениндуцированные опухоли, удачный исход лечения доксорубицином в большой степени зависит от участия как врожденного, так и адаптивного иммунитета [25]. Нами разработана модельная система для регистарции ранней (до 24 ч) провоспалительной реакции клеток селезенки мышей на клетки опухолевых линий in vitro, основанная на определении уровня референс-цитокинов, ФНОа и ИФН-у в надосадочной жидкости спленоцитов и опухолевых клеток [6].
Цель настоящей работы - исследование способности используемых в клинике химиопрепаратов индуцировать
иммуногенную клеточную гибель в опухолевых клеточных линиях крысы и мыши in vitro.
Материал и методы
В работе использовали мышей-самцов линии C57BL/6 массой 20-22 г (питомник "Столбовая"). Экспериментальные процедуры на животных проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.77.
В экспериментах использовали культивируемые линии опухолевых клеток - L929 (фибросаркома мыши), YAC-1 (Т-лимфома мыши), 101.8 и С6 (глиобластомы крысы из коллекции линий глиом ФБГУ «НИИ морфологии человека», предоставленные Халанским А.С. и Кондаковой Л.И.). Клетки поддерживались субкультивированием в среде RPMI 1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки, 20 мкг/мл гентамици-на и 2 мМ глутамина.
В работе использовали цитостатические химиопрепара-ты - доксорубицин (Dox) (антрациклиновый антибиотик), цисплатин - cis (препарат на основе платины) и топотекан - Topo (ингибитор топоизомеразы I), любезно предоставленные А.С. Халанским.
101.8
120-, 100 -80604020-
120-, 100 -806040200-
120 100 80 60 40 20
0,01 ' 0,02 ' 0Й ' 1 г YAC-1
10
0,01 ' 0,02 ' 0Й ' 1 ' 10 '
120-, 100 -806040200-
0,01 ' 0,02 ' 0Й ' 1 ' 10 '
L929
* -г ; j
0,01 ' 0,02 ' ой ' 1 1 10 '
Доксорубицин
Цисплатин А Топотекан
Влияние химиотерапевтических препаратов на жизнеспособность клеток опухолевых линий.
По оси абсцисс - дозы препарата, мкг/мл, по оси ординат - жизнеспо-
собность, %.
Для получения культуральных надосадков клетки селезенки мышей C57BL/6 (5-106/мл) инкубировали с клетками опухолевых линий (5-105/мл) в течение 24 ч при 370С в СО2-инкубаторе. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием, надосадки отбирали и хранили до тестирования при -200С.
Цитокины в культуральных надосадках определяли им-муноферментным методом c помощью коммерческих наборов ELISA для детекции ИФН-у мыши и ELISA (mouse Th1/ Th2 10plex Kit) от Bender MedSystem GmbH. В последнем случае определение цитокинов проводили на проточном ци-тофлуориметре "Cytomics FC500" Beckman Coulter.
Для определения цитотоксического действия химиопре-паратов использовали колориметрический метод определения жизнеспособности клеток [26]. Опухолевые клетки инкубировали в 96-луночных плоскодонных панелях (5-104 клеток/лунку) в течение 24 ч для получения монослоев. Затем в лунки добавляли серийные разведение цитостатиков от 10 до 0,01 мкг/мл в объеме 50 мкл (в случае с суспензионной культурой YAC-1 1-й этап 24-часовой инкубации клеток исключали) и инкубировали 1 сут. В контрольных лунках цитостатики отсутствовали. По окончании инкубации в лунки добавляли по 20 мкл МТТ(3-(4,5-диметилтиразол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид), (Sigma) в концентрации 5 мг/мл и инкубировали 4 ч при 370С. Панели центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, надосадки удаляли и в каждую лунку добавляли по 100 мкл HCl-изопропанола. После тщательного пипетирования проводили фотометрию на многоканальном планшетном фотометре ANTHOS 2010 (Австрия) при длине волны 495 нм. Процент цитолиза определяли по формуле D1-D2/D1 • 100(%), где D^ оптическая плотность контрольных, а D2 - опытных образцов.
Для обработки опухолевых линий цитостатиками клетки L929, 101.8 и C6 в концентрации 5-105/мл в объеме 1 мл помещали в лунки 24-луночных панелей и инкубировали при 370С с 5% СО2 в течение 24 ч. К полученным монослойным культурам клеток добавляли цитостатики Dox, Cis и Topo (10 мкг/ мл) и инкубировали 2-4 ч. Затем культуры отмывали 3 раза бессывороточной средой, доводили объем до 1 мл полной культуральной средой и добавляли спленоциты (5-106/мл). Инкубировали 24 ч, надосадки отбирали, центрифугировали и хранили при -200С [20].
Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± m). О достоверности различий средних величин судили по критерию t Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Для оценки прямого действия химиопрепаратов на клетки опухолевых линий различного генеза использовали цитостатики Dox, Cis и Topo. Нами обнаружены различия по чувствительности к цитостатикам тестируемых опухолевых линий. На рисунке видно, что клетки линий L929 и С6 в значительной степени резистентны, а YAC-1 и 101.8 - чувствительны к цитолитическому действию химиопрепаратов. Несмотря на различную химическую природу используемых препаратов, их воздействие на опухолевые клетки практически идентично. В связи с этим нам представлялось интересным определить зависимость между таким свойством опухолевых клеток, как чувствительность к цитотоксическому действию химиопрепаратов, и способностью к индукции цитокинов в популяции клеток селезенки интактных мышей. Мы полагали, что уровень экспрессии иммуногенных детерминант, ассоциированных с начальной стадией гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза, должен быть выше в чувствительных клетках, чем резистентных линий и соответственно вызывать более интенсивную продукцию провоспалительных цитокинов. Данные таблицы полностью подтверждают это предположение. Значительно более высокий уровень выработки ФНОа и ИФН-у и небольшое, но достоверное повышение продукции ИЛ-6 и ИЛ-10 зарегистрированы в надосадках сокультур чувствительных опухолевых клеток 101.8 и спленоцитов C57BL/6, чем при использовании в качестве индукторов этих цитокинов резистентной линии С6. Таким образом, чувствительность к химиопрепарам ассоциирована с повышением иммуногенности опухолевых клеток. Выработка других цитокинов, ИЛ-1а, ИЛ-2, ИЛ-5, ГМ-КСФ, ИЛ-4, ИЛ-10 не зарегистрирована, что может быть связано с их недетектируемым уровнем в столь ранние сроки активации врожденного иммунитета.
При анализе результатов, полученных с использованием в качестве индуктора цитокинов другой резистентной линии L929, выявлено повышение иммуногенности, индуцируемое химиопрепаратами (см. табл. 1). Поскольку в данной экспериментальной системе использованы опухолевые линии различного тканевого происхождения, а также в связи с высоким уровнем гетерогенности опухолей мы полагаем, что исход химиотерапии наряду с чувствительностью к препаратам связан с многочисленными другими факторами [19]. Очевидно в случае с опухолевыми клетками L929 обработка их химиопрепаратами, индуцирующая экспрессию иммуноген-ных детерминант на клеточной поверхности, и гибель клеток могут быть разобщены во времени. Действительно удлине-
Выработка цитокинов клетками селезенки интактных мышей C57BL/6 при их сокультивировании с клетками опухолевых линий, чувствительных и резистентных к цитотоксическому действию противоопухолевых химиопрепаратов
Опухолевая клеточная линия Препарат ИЛ-1а ИЛ-2 ИЛ-5 ИЛ-6 ИЛ-10 ИФН-у ФНОа ГМ-КСФ ИЛ-4 ИЛ-17
L929:
эксперимент 1 - 0 0 0 2230 ± 61 137 ± 24 979 ± 39 107 ± 21 0 0 0
Cis 0 0 0 2151± 48 280 ± 26* 1451± 45* 145±28* 0 0 0
Dox 0 0 0 3930± 53** 208 ± 24* 1360±48* 156±27* 76 ± 21 0 0
Topo 0 0 0 5066± 192** 334 ± 33* 1644 ± 56* 163 ± 33* 79 ± 20 0 0
эксперимент 2 - 0 0 0 2909 ± 101 308 ± 30 2188± 68* 454 ± 48 294 ± 32 0 0
Cis 0 0 0 5009 ± 203** 368 ± 35 16173± 901*** 842 ± 46** 514 ± 39 0 0
эксперимент 3 - н/д н/д н/д н/д н/д 312 ± 31 н/д н/д н/д н/д
Dox - - - - - 2322 ± 58** - - - -
101.8 - 0 0 0 358 ± 34 82 ± 11 145 ± 21 76 ± 18 0 0 0
Cis 0 0 0 1215 ± 69** 338 ± 35** 3632 ± 57** 187±23** 0 0 0
C6 - 0 0 0 500 ± 28 196 ± 27 1506± 39 375 ± 44 0 0 0
Cis 0 0 0 296 ± 21 124 ± 18 1478 ± 40 188 ± 21 0 0 0
Dox 0 0 0 260 ± 23 220 ± 20 1107±34 234 ± 24 0 0 0
Topo 0 0 0 522 ± 37 183 ± 19 1445 ± 38 346 ± 28 0 0 0
Примечание. * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 - статистически значимые различия по сравнению с соответствующим контролем; н/д - недостоверно.
ние срока экспозиции L929 с химиопрепаратами с 24 до 48 ч значительно повышает процент гибели этих клеток (данные не представлены). Для продолжения работы представляется важным расширение панели опухолевых линий и возможно потенциальных индукторов иммуногенности опухолевых мишеней. Также необходимо проведение анализа причин резистентности опухолевых клеток к цитостатическому действию химиопрепаратов. Здесь следует иметь в виду феномен множественной лекарственной резистентности (multidrug resistance - MDR). Р-гликопротеин, Pgp, кодируемый геном MDR1, - АТФ-зависимый трансмембранный транспортер, который осуществляет активный выброс различных токсинов, включая противоопухолевые препараты, из клетки. Высокий уровень экспрессии этого белка в опухолевых клетках сообщает им резистентность к Pgp-транспортируемым лекарственным препаратам. Важными представляются анализ экспрессии Pgp на мембране опухолевых клеток, а также подавление его функции сурфактантами или неспецифическими ингибиторами протеинкиназы С [27].
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что тестируемые нами химиопрепараты доксору-бицин, цисплатин и топотекан наряду с прямым цитотокси-ческим действием повышают иммуногенность опухолевых клеток и индуцируют более высокий уровень иммунного ответа в популяции клеток селезенки мышей, регистрируемый по выработке основных противоопухолевых цитокинов.
Кроме того, показано наличие взаимосвязи между чувствительностью опухолевых клеток к цитостатикам и индукцией противоопухолевого ответа в системе врожденного иммунитета при использовании опухолевых клеточных линий одного генеза (глиобластомы крысы 101.8 и С6).
литература
6. Малайцев В.В., Богданова И.М. Активация клеток иммунной системы при первичной экспозиции с клетками опухолевых линий in vitro. В кн.: Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии: Сборник научных трудов. М.; 2010: 135-7.
Поступила 05.03.14
references
1. Whiteside L. Immune response to malignancies. Allerge Clin Immunol. 2010; 125: 272-83.
2. Ghiringhelli F. et al. Links between innate and cognate tumor immunity. Curr.Opin.Immunol. 2007; 19(2): 224-31.
3. Vesely M.D. et al. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Ann.Rev.Immunol. 2011; 23(29): 235-71.
4. Belardelli F., Ferrantini M. Cytokines as link between innate and adaptive antitumor immunity. Trends. Immunol.2002; 23(4): 201-8.
5. Ullrich E. et al. Tumor stress, cell death and the ensuing response. Cell Death Differentiation. 2008; 15: 21-8.
6. Malaytsev V. V., Bogdanova I. M. Activation of immune cells in primary exposure of tumor cells lines in vitro. Aktual'nyye voprosy morfogeneza v norme i patologii: sbornik nauchnykh trudov. M.; 2010: 135-7.
7. Terme M. et al. The dendritic cell-like functions of IFN-producing killer dendritic cells reside in the CD11b+ subset and are licensed by tumor cells. Cancer Res. 2009; 69(16): 6590-7.
8. Ullrich E. et al. Dendritic cells and innate defense against tumor cells. Cytokines Growth Factor Rev. 2008; 19(1): 79-92.
9. Vremec D. et al. Production interferons by dendritic cells, natural killer cells and interferon-producing killer dendritic cells. Blood. 2007; 109(3): 1165-73.
10. Bruserud O. et al. Anticancer immunotherapy in combination with proapoptotic therapy. Curr. Cancer Drug Targets. 2008; 8(8): 666-75.
11. Zitvogel L. et al. Immune response against dying tumor cells. Adv. Immunol. 2004; 84: 131-79.
12. Casares N. et al. Caspase-dependent immunogenicity doxorubi-cin-induced tumor cell death. J.Exp.Med. 2005; 202(12): 1691701.
13. Kepp O. et al. The immunogenicity of tumor cell death. Curr. Opin. Oncol. 2009; 21(1): 71-6.
14. Tensiere A. et al. Immunogenic cancer cell death: a key-lock paradigm. Curr. Opin. Immunol. 2008; 20(5): 504-11.
15. Fucikova J. et al. Human tumor cells killed by antracyclines induce a tumor-specific immune response. Cancer Res. 2011; 71(14): 4821-33.
16. Galluzzi L. et al. The secret ally:immunostimulation by anticancer drugs. Nature Rev. DrugDiscov. 2012; 11(3): 215-33.
17. Martins I. et al. Surface-exposed calreticulin in interaction between dying cells and phagocytes. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010; 1209: 77-82.
18. Menard C. et al. Cancer chemotherapy: noy only a direct cytotoxic effect, but also an adjuvant for antitumor immunity. Immunol. and Immunother. 2008; 57(11): 1579-87.
19. Zirvogel L., Kepp O., Kroemer G. Immune parameters affecting the efficacy of chemotherapeutic regimens. Nature. Rev. Clin. Oncol. 2011; 18(3): 151-60.
20. Chauhan P. et al. Cisplatin primes murine peritoneal macrophages for enhanced expression of nitric oxide, proinflammatory cytokines, TLRs, transcription factors and activation of MAP kinases upon co-incubation with L929 cells. Immunobiology. 2009; 214: 197-209.
21. Clarke C., Smyth M.J. Calreticulin exposure increases cancer immunogenicity. Nature. Biotechnol. 2007; 25(2): 192-3.
22. Kepp O. et al. Molecular determinants of immunogenic cell death elicited by anticancer chemotherapy. Cancer Metastas. Rev. 2011; 30(1): 61-9.
23. Obeid M. et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenic-ity of cancer cell death. Nature Med. 2007; 13(1): 54-61.
24. Obeid M. et al. Ecto-calreticulin in immunogenic chemotherapy. Immunol. Rev. 2007; 220: 22-34.
25. Mattarollo S.R. et al. Pivotal role of innate and adaptive immunity in antracycline chemotherapy of established tumors. Cancer Res. 2011; 71(14): 4809-20.
26. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods. 1983; 65: 22-34.
27. Chaudhary P.M., Roninson I.B. Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeu-tic drugs. J. Natl. Cancer Inst. 1993; 85(8): 632-9.
Received 05.03.14
