CC BY
107
УДК 634.135.581.163
СТИМУЛЯТИВНАЯ ГАПЛОИДИЯ У ГРУШИ
Е.А. ДОЛМАТОВ, доктор сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией
В.Е. ДЖАФАРОВА, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией
Г.А. СЕДЫШЕВА, доктор сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией
ВНИИ селекции плодовых культур Россельхозака-демии
E-mail:info@vniispk.ru
Резюме. В статье приведены результаты исследований по стимулятивному апомиксису у груши и использованию его для получения гаплоидов.
Более 50 % сортов груши из изученных в опыте при несо-стоявшейся отдаленной гибридизации с представителями других родов подсемейства Pomoideae образуют семена апомиктического происхождения, дающие в большинстве случаев начало диплоидным растениям. Их количество зависит от генотипических особенностей материнского растения, и в отдельных комбинациях может достигать 25 % от числа опыленных цветков.
Максимальной склонностью к апомиксису характеризуются генотипы 29-4, 40-4, Бретфелпс, 24-50-98, 24-59-255, Белорусская поздняя, Майкопская красавица, Дружба.
Начало апомиктическим семенам дают зародышевые мешки, в которых состоялся мейоз. Практически все растения имели диплоидный набор хромосом, и только одно было гаплоидом. Появление гаплоидов и диплоидов в потомствах сортов груши обусловлено одним процессом, оканчивающимся на разных этапах. В первом случае гаплоидная яйцеклетка приступает к делению и дает начало гаплоидному растению, во втором - восстановление диплоидности происходит в результате первого деления партеногенетически развивающейся гаплоидной яйцеклетки.
Для увеличения выхода гаплоидов недозрелые апомикти-ческие семена извлекали из 55...60 дневных завязей и выращивали в культуре in vitro. Цитологически было изучено 9 образцов из комбинации Белорусская поздняя х Хеномелес японский. Наличие метафазных пластинок с гаплоидным числом хромосом (n=17) установлено только в отдельных точках роста образцов - №1 и №8. Причем у образца №1 гаплоидный набор хромосом установлен в эпидермальных клетках, №8 - в двух случаях в меристематических клетках отмечены только метафазы с 17 хромосомами, а в двух - как гпаплоидные метафазы, так и диплоидные, то есть по всей вероятности два последних образца - это химеры.
Ключевые слова: стимулятивный партеногенез, гаплоид.
В селекции плодовых растений в силу многих причин существует ряд невостребованных резервов и возможностей, реализация которых может значительно повысить эффективность процесса. К их числу относится создание высокогомозиготных чистых линий, использование которых дает возможность резко сократить объемы гибридных семей, перейти к скрещиваниям контролируемым на уровне гамет и заранее прогнозировать их результаты [1].
У плодовых растений получение таких линий в результате длительного инцухта практически неосуществимо, так как к самостерильности, инбредной депрессии и необходимости принудительного самоопыления в течение 9.. .10 поколений добавляется еще и продолжительный ювенильный период. Поэтому почти единственная возможность создания гомозиготных форм у многолетних древесных растений - использование гаплоидов [2].
Получение гаплоидов посредством культуры пыльников или путем апомиксиса стало довольно обычным методом в селекции многих сельскохозяйственных культур, однако у плодовых оба эти направления нахо-
дятся в стадии разработки. Исследования по культуре пыльников вишни и яблони проводятся во Франции Китае, Японии и Германии [3...5]. В нашей стране по такому пути идут ученые из ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина [6]. Наиболее значимые работы по гаплоидному партеногенезу яблони осуществляются во Франции и Китае [7.10].
На практике для стимуляции партеногенеза в большинстве случаев используют пыльцу, которая не способна произвести нормальное двойное оплодотворение (пыльца, обработанная у-лучами, различными химическими веществами или пыльца другого, но родственного вида или рода). Выход гаплоидов при этом может составлять 20.50 % от числа опыленных цветков [11.18].
В ряде работ обоснована возможность получения высокогомозиготных диплоидов через псевдодиплоидный апомиксис, связанный со спонтанным удвоением числа хромосом при первом делении ядра партеногенетически развивающейся гаплоидной яйцеклетки [19].
Успешное использование апомиксиса в создании чистых линий у однолетних культур и интенсивно ведущиеся в этом направлении эксперименты с плодовыми за рубежом послужили причиной для развертывания с 1983 г. соответствующих исследований во ВНИИ селекции плодовых культур.
Основные усилия в работе были направлены на решение следующих задач:
выявление сортов груши, склонных к стимулятивному апомиксису;
определение характера расщепления признаков сеянцев груши, возникших в результате стимулятив-ного апомиксиса;
поиск среди представителей подсемейства Pom-moideae растений, пыльца которых обладает наибольшим стимулирующим эффектом;
отработка методики выращивания недозрелых апомиктических семян для увеличения выхода гаплоидов.
Условия, материалы и методы. За время исследований было осуществлено 80 комбинаций скрещиваний (в том числе и рекогносцировочных) общим объемом 46000 цветков, из которых 28000 приходится на скрещивания «груша х Хеномелес японский», 7700 - «груша х ирга колосистая», 5500 - «груша х яблоня» и 4800 -«груша х айва обыкновенная» .
Опыление цветков, кастрированных в стадии рыхлого бутона, проводили свежесобранной пыльцой с последующей изоляцией изоляторами из пергаментной бумаги, плотной синтетической ткани или 2-х слоев марли.
Исходным материалом для исследований на этапе культивирования in vitro служили завязи из семей Белорусская поздняя х хеномелес японский и 9-6165 (Лимонка х Ильинка) х хеномелес японский в возрасте 55 и 70 дней с момента опыления. В каждой семье отбирали по 10 завязей.
Стерилизацию завязей проводили по следующей схеме: 1 час в проточной воде; 15 мин. в 0,01 %-ном растворе мертиолата; 3-кратное промывание в стерильной дистиллированной воде по 10 минут. Перед извлечением из них семян с зародышами дополнительно обжигали в 96,6° этиловом спирте в асептических условиях бокса.
Семена, а затем извлеченные из них зародыши (после 2 месяцев хранения в условиях пониженных температур - +3...+5°С) высевали на среду Смирнова, дополненную тиамином 10 мг/л, дрожжевым экстрактом - 20 мл/л (по Р. Г. Бутенко [1964]), гидролизатом казеина - 400 мг/л, ГК - 2 мг/л, кинетином - 0,2 мг/л, мезоинозитом - 150 мг/л, сахорозой - 4 %. Размножение апомиктических зародышей проводили на среде Мурасиге-Скуга.
Пассированные зародыши культивировали при температуре 24.26 °С, освещенности - 3,0.. .3,5 тыс. лк и 16-часовом фотопериоде.
Цитологический анализ меристематических тканей вегетативных побегов, выращенных в культуре in vitro из апомиктических семян, проводили в лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК на временных давленых препаратах.
Фиксацию микропобегов осуществляли в уксусном алкоголе (3 части 96 %-ного этилового спирта + 1 часть ледяной уксусной кислоты), окраску - пропионовым лакмоидом (Каптарь, 1967; Седышева, 1990) препараты просматривали на микроскопе Nicon-50i с фотокамерой DS-Fi1.
Результаты и обсуждение. На первом этапе исследований установлено, что значительная часть использованных в опыте сортов груши (более 50 %) при несостоявшейся отдаленной гибридизации с представителями других родов подсемейства Po-moideae способна образовывать семена апомиктиче-ского происхождения, которые в большинстве случаев дают начало диплоидным растениям. Их количество в значительной степени зависит от генотипических особенностей материнского растения и в отдельных комбинациях может достигать 25 % от числа опыленных цветков.
В результате изучения 80 сортов груши выделены генотипы с максимальной склонностью к стимуля-тивному апомиксису - это 29-4, 40-4, Бретфелпс, 2450-98, 24-59-255, Белорусская поздняя, Майкопская красавица, Дружба. Причем некоторые апомиктические сеянцы склонны к апомиксису в такой же степени, как и материнские растения.
При стимуляции апомиксиса у груши пыльца ирги, айвы обыкновенной и хеномелеса японского вызывала образование семян в 50 % случаев, а пыльца яблони - в 30 %. При этом в комбинациях с хеномелесом японским возможна идентификация апомиктических и гибридных сеянцев на ранних этапах онтогенеза по маркерным признакам. В связи с этим использование его пыльцы более предпочтительно.
Апомиктическим сеянцам груши, полученным в результате чужеродного опыления, в пределах одной комбинции присуще большое морфологическое разнообразие, обусловленное механизмом образования семян. С использованием генетических маркеров было установлено, что начало апомиктическим семенам дают зародышевые мешки, в которых состоялся мейоз. Практически все растения имели диплоидный набор хромосом и только одно оказалось гаплоидом. Его обнаружили в 1998 г. в гибридной школке среди апомиктических сеянцев. При этом следует отметить, что появление гаплоидов и диплоидов в потомстве сортов груши обусловлено, по сути, одним и тем же процессом, оканчивающимся на разных этапах. В первом случае гаплоидная яйцеклетка приступает к делению и дает начало гаплоидному растению. Во втором - восстановление диплоидности происходит в результате
первого деления партеногенетически развивающейся гаплоидной яйцеклетки, не сопровождающегося цитокинезом [20.23].
Для увеличения выхода гаплоидов недозрелые апомиктические семена извлекали из 55.60 дневных завязей и выращивали в культуре in vitro. В этот период, как известно, зародыши семечковых культур полностью формируются и дифференцируются.
Количество зародышей, извлеченных из выполненных семян, оказалось в 1,6-2,8 раза меньше, чем семян. В среднем их размер варьировал от 1 до 5 мм, они имели белую или зеленоватую окраску или были прозрачными. Семена без зародышей оказались за-полнеными прозрачным желеобразным эндоспермом. Размер зародышей, извлеченных из щуплых семян, не превышал 2 мм, они были прозрачными и при культивировании на питательной среде погибали.
Независимо от возраста зародышей за 45-дневный период культивирования отмечены отклонения в их развитии. При этом количество проростков одновременно с аномалиями побегов и корней может достигать 50 %. Высота проростков без аномалий варьировала от 5 до 20 мм, число листочков - от 2 до 8 шт., а длина корешков - от 6 до 33 мм. В нестерильных условиях они погибали.
Апикальное доминирование на этапе микроразмножения снимали введением в питательную среду 6-БАП. Получения наибольшего количества побегов от каждого зародыша достигали чередованием концентраций цитокинина в дозе 1 и 2 мг/л на фоне 1,5 мг/л ГК. Это стимулировало образование и рост дополнительных почек и побегов. На этапе размножения формировались конгломераты, состоящие из 10.14 идентичных побегов, причём большая часть из них была пригодна к укоренению.
При укоренении апомиктических побегов наиболее эффективным оказалось добавление в среду ИУК в количестве 1 мг/л. Их укореняемость в этом случае достигала 80.87 %.
Наиболее сложный этап клонального микроразмножения апомиктических растений груши - перевод из in vitro в in vivo. Использование общепринятой техники адаптации укоренённых микропобегов к почвенным условиям обеспечило получение всего 50,5 % прижившихся растений. Для повышения выживаемости растений использовали прививку побегов in vitro на нестерильные подвои груши обыкновенной. Проводили ее в период активного роста подвоя на зеленую часть растущего побега в расщеп. Результативность прививки на подвои, выращенные в открытом грунте и пересаженные в условия искусственного освещения, достигает 54 %, а на подвои, выращенные в условиях искусственного освещения, - 80 %.
Цитологическое изучение от 1 до 38 верхушечных меристем 9 образцов из комбинации Белорусская поздняя х хеномелес японский (№№ 1, 5, 7, 8, 10, 12, 16, 17 и 22) показало, что соматические клетки большинства из них обладают диплоидным набором хромосом (2n=2x=34). И лишь в отдельных точках роста двух образцов (№ 1 и № 8) отмечено наличие метафазных пластинок с гаплоидным набором. Причем у образца № 1 он отмечен в эпидермальных клетках, а у образца № 8 - в двух случаях в меристематических клетках только метафазы с 17 хромосомами, а в двух как гапаплоидные метафазы, так и диплоидные. По всей вероятности два последних образца - это химеры.
Таким образом, цитологический анализ образцов
апомиктических форм подтверждает наличие у груши стимулятивного гаплоидного партеногенеза и принципиальную возможность получения гаплоидов.
На сегодняшний день выжившие зародыши размножены. Общее число копий (пробирок с конгломератами) составляет 1212 шт., среднее количество
почек и побегов в конгломерате от 7 до 12 шт. Образцы, имеющие гаплоидный набор хромосом - №8 и № 1 представлены, соответственно 352 и 378 копиями, что открывает большие возможности для экспериментов по получению полностью гомозиготных растений и использованию их в селекционном процессе.
Литература.
1. Навашин М.С. Новая возможность в селекции //Селекция и семеноводство. - 1933. - № 2. - С. 11-16.
2. Хохлов С.С., Тырнов B.C., Гришина Е.В. и др. Гаплоидия и селекция. - М., Наука, 1976. - 222 с.
3. Murahami Y. Biotechnology of fruittrees// Farmg. Japan. - 1987. - Vol.21. - N1. - P. 27-36.
4. Dayan Wang, Gao-lin Gui, Jang San Sun. Tissue culture of. fruit crops in China// Hortscience - 1988. - Vol.23. - N6. -P. 962-965.
5. Hanre V. Nutzung biotechnologisches Verfahren fur die Obstzuchtung// Landwirtschaftwissenschaft. - 1990. - N.292. - S. 193-199
6. Жуков О.С, Олейникова О.Я., Савельев Н.И. Методические рекомендации по получению растений регенератов плодовых пород в культуре пыльников. - Мичуринск, 1994. - 36 с.
7. Lespinasse Y., Godicheau M., Duron M. Potential value and method of producing haploids in the apple tree Malus pumila Mill// Acta Horticulturae. - 1983. - Vol.131. - P.223-230.
8. Lespinasse Y., Noiton D. Contribution a l'etuda d'une piante haploide de pommier(Malus pumila Mill.)// Agronomie. -1986. -Vol.6. - N2. - P. 659-664.
9. Lespinasse Y., Chevreau E. Progressi del miglioramento genetico del melo: cloni autocompactibili e piante aploidi// Riv. frut-ticolt.- e. ortofloricolt. -1987. - Vol. 49. - N8. - P. 25-29.
10. Zhang J.X., Lespinasse Y., Chevreau E. Obtention de plantes haploides de pommier (Malus domestica Borkh) issues de parthenogenese induite in situ par du pollen irradie et culture in vitro des pepins immatures// C.r.Acad.sci.-1988. - Vol. 307. -P. 451-457.
11. Laurie D.A., Bennett M.D. The production of haploid wheat plants from wheat x maize cross// Theor.Appl. Genet. - 1988. - Vol. 76. - P. 393-397.
12. Sitch L.A., Snape J.W. Factors affecting haploid production in wheat using the Hordeum bulbosum system. Postfertilization effects on embryo survival//Euphytica. - 1987. - Vol. 36. - N3. - P. 763-773.
13. Inagaki M., Henry Y., Buyser J. Comparison of haploid production efficiency through anther culture and intergenetic crossing in three wheat varieties and their Fl hybrids// Japan J. Breeding. - 1987. - Vol.57. - N4. - P. 47414. Suenaga K., Nakajime K. Efficient production through crosses between Japanense wheat and maize (Lea mays7)// Plant Cell
Reports. - 1989. - Vol.8. - P. 263-266.
15. Дунаева С.Е. Использование различных клонов, в качестве опыли телей для получения гаплоидов культурного ячменя //Научно-техн. бюлл.ВНИИР. - 1990. - № 204. - С. 12-16.
16. Чистякова В.Н., Неттевич Э.Д, Гуляев Т.В. Экспериментальная гаплоидия как средство интенсификации генетикоселекционных работ //Совершенствование селекционно-генетических процессов при выведении сортов зерновых и зернобобовых культур в Нечерноземной зоне. - Москва, 1990. - С. 3-12
17. Духарев Н.А. Возможности использования отдаленной гибридизации для получения гаплоидов пшеницы //Биологические основы селекции. - Саратов, 1991. - С. 44-54.
18. Вилкова Н.А., Рябченко Н.А. Роль гаплоидии в стабилизации устойчивых к вредителям генотипов ячменя //Всесоюзн. симпозиум «Новые методы биотехнологии растений», Тез. Докладов. - Пущино, 1991. - С. 90.
19. Чистякова В.Н. Метод ускоренного получения гомозиготных линий мягкой пшеницы и неполных 56 хромосомных пшенично-пырейных амфидиплоидов при внутривидовой гибридизации//Совершенствование селекционно-генетических методов при выведении сортов зерновых и зернобобовых культур в Нечерноземной зоне. - М., 1990. - С.3-12.
20. Долматов Е.А. Стимулятивный апомиксис и проблема получения гомозиготных растений у груши//Селекция и сорторазведение садовых культур. - Орел: ВНИИСПК, 1996. - С. 11-123.
21. Долматов Е.А. Апомиксис у груши и перспективы его использования// На благо отечественного садоводства (150 лет Всероссийскому НИИ селекции плодовых культур). - Орел: «Тургеневский бережок», 1996. - С. 165-167.
22. Долматов Е.А., Панова Н.И. Апомиксис и экспериментальная гаплоидия у груши // Селекция и сорторазведение садовых культур. - Орел: ВНИИСПК, 1998. - С. 276-280.
23. Долматов Е.А., Седов Е.Н., Панова Н.И., Седышева Г.А. Изучение морфологической неоднородности апомиктического потомства груши // Доклады РАСХН. - 1998. - № 4. - С. 15-16.
STIMULATIVE HAPLOIDY IN PEAR E.A. Dolmatov, V.E. Dzhafarova, G.A. Sedysheva
Summary. Stimulative apomixis in pear and its use for obtaining haploids was investigated. The results of this investigation are given in this paper.
It was stated that a substantial part of pear varieties (over 50%) from the used ones in that experiment under the non-performed remote hybridization with representatives of other lines of Pommoideae subfamily was capable to form seeds of apomictic origin. In most cases they resulted in diploid plants. Their number rather depended on the genotypic peculiarities of the maternal plant and in certain combinations it might reach 25% from a number of pollinated flowers.
Genotypes having the highest possible inclination to the apomixis were singled out: 29-4, 40-4, ‘Bretfelps’, 24-50-98, 24-59-255, ‘Belorusskaya pozdnia’, ‘Maikopskaya krasavitsa’, ‘Druzhba’ and others.
Having used genetic markers we discovered that embryo sacks, in which meiosis occurred, initiated apomictic seeds. Actually, all plants had a diploid set of chromosomes but only one was a haploid. It should be noted that haploid and diploid occurring in the progenies of pear varieties was stipulated by one and the same process terminating on different stages. In the first case, a haploid ovule started dividing and initiated a haploid plant. In the second case, the restoration of diploidy occurred as a result of the first division of a parthe-nogenetically developing haploid ovule.
On the second stage with the aim of haploid output increasing, the immature apomictic seeds were extracted from ovaries of 55-60 days old and were cultivated in vitro. 9 samples from the combination ‘Belorusskaya pozdnia’ x Chaenomeles Japanese were studied cytologically. The majority of samples in the somatic cells had a diploid set of chromosomes (2n=2x=34); and only in two samples -№ 1 and №8 - in certain points of growth there was noted a presence of metaphase plates with a chromosome number of 17, i.e. haploid. It should be noted that in sample № 1 the haploid set of chromosomes was noticed in epidermal cells. In sample № 8 in two cases in meristematic cells were noticed only metaphases with 17 chromosomes; and in other two cases were noticed both haploid metaphases and diploid ones. Probably, the two latter samples were chimaeras.
Key words: stimulative parthenogenesis, haploid.
