CC BY
21Апомиксис и проблема получения гаплоидов и гомозиготных диплоидов у груши (Pyrus communis L.)
Е.А. Долматов, доктор УДК 634.135.581.163
сельскохозяйственных наук
LKJIOLKUAUSnULI ПВКППО/Л ItUyK ^
BLfo^ZeZdtym Апомиксис и проблема получения
Государственное научное ^ Л О t
учреждение Всероссийский Г^^П^Оид^ОВ и Гомозиготных
научно-исследовательский - /)
И^тиутрутгсе0лреекл;иРиоспГовых диплоидов у груши
(Pyrus communis L)
Наведен1 результаты досл1джень по стимулятивному апомксису в груш'1, а також викорис-тання його для отримання гапло'[д1в i гомозиготних дипло'[д1в.
Встановлено, що 50% сoртiв груш'1 через те, що не вiдбулися вiддаленi г'бридизацй, здатнi утворювати насння апомктичного походження, яке дае початок дипло'[дним рослинам. Видiленi генотипи з максимальною схильнстю до апомксису.
Апомктичним йянцям груш'1, отриманиму результат'1 чужoрiднoгo запилення, в межах oднiеï й т'ё ж комбшацй властиве бльш мoрфoлoгiчне рiзнoманiття. У плодоносному стан апо-мкти, що походять в'д одн'ёматеринсьш рослини, рiзняться мЫ собою в тш же м'щ що й гiбриднi с'янц oднiеïродини.
За використання генетичних маркерiв установлено, що початок апомктичному наснню дають зарoдкoвi мшки, у яких в'дбувся мейоз.
Показано використання методу in vitro з метою збльшення виходу апомктичних рослин. Найбльше ндукування апомктичних пагoнiв in vitro досягалося чергуванням концентрацй цитокнна БАП дозою 1 мг/л та 2 мг/л на фoнi 1,5 мг/л ГК. Використання щеплення пагонами in vitro на нестерильнi тдво1 груш'1 звичайно\збльшило вих'д рослин до 80%. Подана цитоло-г'чна ощнка 9 апомктичним зразкам. Цитoлoгiчний аналiз зразкiв апомктичних форм п'д-твердив наявнсть у груш'1 стимулятивного гапло\дного партеногенеза.
Ключовi слова:
стимулятивний партеногенез, гаплоТд.
Введение. Подбор исходного материала для скрещиваний, базирующийся на глубоких селекционно-генетических и биологических исследованиях, является одним из самых значимых, так как, в конечном итоге, определяет эффективность той или иной селекционной программы. Важная роль при этом отводится созданию и вовлечению в селекционный процесс новых комплексных источников и доноров хозяйственно-ценных признаков, представляющих собой высокогомозиготные формы. Их использование в селекционной практике дает возможность значительно сократить объемы гибридных семей, осуществить переход к скрещиваниям, контролируемым на уровне гамет, и заранее прогнозировать результаты скрещиваний [1].
У плодовых растений получение таких форм в результате длительного инцухта практически неосуществимо, поскольку к самостерильности, инбредной депрессии и необходимости принудительного самоопыления в течение 9-10 поколений добавляется еще и продолжительный ювенильный период. Поэтому почти единственной возможностью создания гомозиготных форм у многолетних древесных растений является использование гаплоидов [2].
Получение гаплоидов посредством культуры пыльников или через гаплоидный апомиксис -обычное явление в селекции многих сельскохозяйственных культур, в плодовых же оба эти направления находятся в стадии разработки.
Исследования по культуре пыльников вишни и яблони проводятся во Франции, Китае, Японии, и Германии [3, 4, 5]. В России по этому пути идут ученые из ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина [6]. Работы по гаплоидному партеногенезу яблони осуществляются во Франции и Китае [7, 8].
На практике для стимуляции партеногенеза используют пыльцу, которая не способна произвести нормальное двойное оплодотворение. Выход гаплоидов при этом может достигать 20-50% от числа опыленных цветков [9-12].
В целом ряде работ обосновывается возможность получения высокогомозиготных диплоидов через псевдодиплоидный апомиксис, связанный со спонтанным удвоением
Апомиксис и проблема получения гаплоидов и гомозиготных диплоидов у груши (Pyrus communis L.)
числа хромосом при первом делении ядра партеногенетически развивающейся гаплоидной яйцеклетки, не сопровождающимся цитокинезом [13].
Успешное использование апо-миксиса в создании чистых линий у однолетних культур и ведущиеся в этом направлении эксперименты по плодовым за рубежом послужили причиной для развертывания соответствующих исследований в ГНУ ВНИИСПК.
Методика. Исходным материалом для исследований in vitro служили плодики растений из семейств Белорусская поздняя х Хеноме-лес японский и 9-61-65 (Лимонка х Ильинка) х Хеномелес японский в возрасте 55 и 70 дней с момента опыления. В каждой семье отбирали по 10 плодиков. Их стерилизацию проводили по схеме: 1) 1 час в проточной воде; 2) 15 мин. в 0,01% р-ре мертиолята; 3) 3-х кратное промывание в стерильной дистиллированной воде по 10 минут. Перед извлечением семян с зародышами плодики обжигали в пламени 96° этилового спирта в асептических условиях бокса.
Семена, а затем извлеченные из них зародыши (после 2 месяцев хранения в условиях пониженных температур, +3, +5°С) высевали на среду Смирнова, дополненную тиамином 10 мг/л, дрожжевым экстрактом - 20 мл/л (по РГ. Бутенко, 1964), гидролизатом казеина - 400 мг/л, ГК - 2 мг/л, кинетином - 0,2 мг/л, мезоинозитом - 150 мг/л, сахарозой - 4%. Размножение апомикти-ческих зародышей проводили на среде Мурасиге-Скуга. Пассированные зародыши культивировали при температуре 24-26°С, освещенности 3,0-3,5 тыс. лк. и 16-часовом фотопериоде.
Фиксацию меристематических верхушек для цитологического анализа проводили в уксусном алкоголе (3 части 96% этилового спирта + 1 часть ледяной уксусной кислоты).
Цитологический анализ мери-
стем in vitro проводили сотрудники лаборатории цитоэмбриологии ГНУ ВНИИСПК на временных давленных препаратах.
Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе исследований [14, 15, 16, 17] было установлено, что значительная часть сортов груши (более 50%) из использованных в опыте при несостоявшейся отдаленной гибридизации с представителями других родов подсемейства Pomoideae способна образовывать семена апомикти-ческого происхождения, дающие в большинстве случаев начало диплоидным растениям. Их количество в сильной степени зависит от генотипических особенностей материнского растения и в отдельных комбинациях может достигать 25% от числа опыленных цветков.
В результате изучения проявления стимулятивного апомиксиса у 80 сортов груши различного генетического происхождения выделены генотипы с высокой склонностью к апомиксису: 29-4, 40-4, Бретфелпс, 24-50-98, 24-59-255, Белорусская поздняя, Майкопская красавица, Дружба и другие. Показано, что некоторые апомиктические сеянцы в такой же степени склонны к апо-миксису, как и материнские растения.
При стимуляции апомиксиса у груши с помощью пыльцы ирги, айвы обыкновенной и хеномелеса японского образование семян происходило в 50% случаев, а пыльцой яблони - в 30%. При использовании пыльцы хеномелеса японского идентификация апомиктических и гибридных сеянцев возможна на ранних этапах онтогенеза по маркерным признакам (у гибридных растений уже в фазе первых 2-3 настоящих листьев хорошо просматриваются крупные почковидные прилистники, а у апомиктиче-ских - прилистники шиловидные). В связи с этим применение пыльцы хеномелеса японского более предпочтительно.
Апомиктическим сеянцам груши, полученным в результате чужеродного опыления, в пределах одной и той же комбинации присуще большое морфологическое разнообразие. Эти различия затрагивают признаки листьев, побегов, габитуса растений, признаки плодов, устойчивости к болезням и другие. В плодоносящем состоянии апомикты, происходящие от одного материнского растения, отличаются друг от друга (и соответственно от материнского растения) в той же степени, что и гибридные сеянцы одной семьи.
Для выяснения причин столь высокой морфологической неоднородности у гетерозиготного по гену С (красная окраска листьев, плодов) сеянца груши при стимуляции пыльцой хеномелеса японского было получено апомиктическое потомство, состоящее из 2 типов растений: одни были с зелеными, другие - с пурпурными листьями. Таким образом, с использованием генетических маркеров по расщеплению, в потомстве было установлено, что начало апомиктическим семенам дают зародышевые мешки, в которых состоялся мейоз. Если бы это было не так, то все сеянцы были бы пурпурными. Практически все растения имели диплоидный набор хромосом, и только одно было гаплоидом.
Появление гаплоидов и диплоидов в потомствах сортов груши обусловлено одним и тем же процессом, оканчивающимся на разных этапах. В первом случае гаплоидная яйцеклетка приступает к делению и дает начало гаплоидному растению. Во втором восстановление дипло-идности происходит в результате первого деления партеногенетиче-ски развивающейся гаплоидной яйцеклетки не сопровождающегося цитокинезом. В этом случае сразу же получается удвоенный гаплоид, представляющий собой полностью гомозиготное растение [18-21]. В настоящее время в селекционных
Апомиксис и проблема получения гаплоидов и гомозиготных диплоидов у груши [Pyrus communis L.)
садах института имеются плодоносящие апомиктические растения груши.
На втором этапе, с целью увеличения выхода гаплоидов недозрелые апомиктические семена извлекались из 55-70-дневных плодиков и выращивались в культуре in vitro. В этот период, как известно, зародыши семечковых культур полностью сформированы и дифференцированы.
Количество зародышей, извлеченных из выполненных семян, оказалось в 1,6-2,8 раза меньше, чем общее число семян. В среднем они были от 1 до 5 мм длиной, имели белую, зеленоватую окраску, или были прозрачными. Семена, в которых не обнаружены зародыши, были заполнены прозрачным желеобразным эндоспермом. Зародыши, извлеченные из щуплых семян, размером до 2 мм, прозрачные и при культивировании на питательной среде погибали.
Независимо от возраста зародышей за 45-дневный период культивирования наблюдали отклонения в их развитии. Установлено, что количество проростков одновременно с аномалиями побегов и корней может достигать 50%. Проростки без аномалий достигали в высоту от
5 до 20 мм, количество листочков от 2 до 8 штук, а длина корешков - от
6 до 33 мм. В нестерильных условиях подобные проростки погибали. В связи с чем в дальнейшем их необходимо было размножить.
Апикальное доминирование на этапе микроразмножения снимали введением в питательную среду 6-БАП. Наибольшее индуцирование побегов достигалось чередованием концентраций цитокинина в дозе 1мг/л и 2 мг/л на фоне 1,5 мг/л ГК. Подобное чередование 6-бензи-ламинопурина стимулировало образование и рост дополнительных почек и побегов (рис. 1).
На этапе укоренения апомикти-ческих побегов более эффективным оказалось добавление в среду ИУК
Рис. 1. Апомиктический номер 1 на этапе микроразмножения.
Рис. 2. Апомиктические микропобеги номера 5 на этапе ризогенеза.
в количестве 1 мг/л. Укореняемость микропобегов достигала 80-87% (рис. 2).
Наиболее сложный этап клональ-ного микроразмножения апомик-тических растений груши - переход растений из in vitro в in vivo. Использование общепринятой технологии адаптации укоренённых микропобегов к почвенным условиям дает всего 50,5% прижившихся растений.
Чтобы повысить выход растений использовали прививку побегов in vitro на нестерильные подвои груши обыкновенной. Прививку проводили в период активного роста подвоя на зеленую часть растущего побега в расщеп. Прививка на подвои, выращенные в открытом грунте и пересаженные в условия искусственного освещения, результативна до 54%, а прививка на под-
вои, выращенные в условиях искусственного освещения, достигает 80%.
Цитологически было изучено 6 образцов из комбинации Белорусская поздняя х Хеномелес японский - №№ 8,10,12,16,17 и 22 и три образца из комбинации 9-61-65 х Хеномелес японский - №№ 1,5,7. У каждого образца анализировали от 1 до 38 верхушечных меристем. Большинство образцов в соматических клетках имеют диплоидный набор хромосом (2п=2х=34). И лишь в двух образцах - №№ 1 и 8 -в отдельных точках роста отмечено наличие метафазных пластинок с числом хромосом, равным 17, т. е. гаплоидным. Следует отметить, что у образца № 1 гаплоидный набор хромосом отмечен в эпидермаль-ных клетках.
У образца № 8 в двух случаях в меристематических клетках только метафазы с 17 хромосомами, а в двух как гаплоидные метафазы, так и диплоидные. По всей вероятности, два последних образца являются химерами, что может свидетельствовать о том, что процесс удвоения хромосом у гаплоидного растения может происходить спонтанно. Кроме того, в большинстве микропобегов образца № 8 отмечено много уродливых замыкающих клеток устьиц, что в свою очередь, свидетельствует о нарушении процесса дифференциации тканей вследствие несбалансированного набора хромосом.
Таким образом, цитологический анализ образцов апомиктических форм подтверждает наличие у груши стимулятивного гаплоидного партеногенеза и принципиальную возможность получения гаплоидов.
В настоящее время апомиктиче-ские номера, имеющие гаплоидный набор хромосом (№ 8, № 1), размножены, что открывает возможность для экспериментов по получению полностью гомозиготных растений и использованию их в селекционном процессе.
Апомиксис и проблема получения гаплоидов и гомозиготных диплоидов у груши (Pyrus communis L.)
Выводы. Более 50% сортов груши из использованных в опыте при опылении пыльцой отдаленных родов подсемейства Pomoideae способны образовывать семена апо-миктического происхождения, дающие в большинстве случаев начало диплоидным растениям.
Опыление груши пыльцой ирги, айвы обыкновенной и хеномелеса японского вызывало образование апомиктических семян в 50% случаев, а пыльцой яблони - в 30%. При этом в комбинациях с хеномелесом японским была возможна иденти-
фикация апомиктических и гибридных сеянцев на ранних этапах онтогенеза по маркерным признакам, в связи с чем использование пыльцы хеномелеса японского более предпочтительно.
Апомиктическим сеянцам груши, полученным в результате чужеродного опыления, в пределах одной и той же комбинция присуще большое морфологическое разнообразие, обусловленное механизмом образования семян.
С использованием генетических маркеров было установлено, что
начало апомиктическим семенам дают зародышевые мешки, в которых состоялся мейоз, а апомикти-ческие растения могут представлять собой удвоенные гаплоиды.
Использование культуры in vitro позволило получить два образца апомиктических миксоплоидных растений, содержащих как гаплоидные, так и диплоидные клетки и тиражировать их, что в перспективе даст возможность получить полностью гомозиготные растения для использования их в селекционном процессе.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ
11.
1. Навашин, М.С. Новая возможность в селекции / М.С. Навашин // Селекция и семеноводство. -1933. - № 2. - С. 11-16.
2. Хохлов, С.С. Гаплоидия и селекция / С.С. Хохлов,
В.С. Тырнов, Е.В. Гришина [и др.]. - М.: Наука, 1976. 12.
- 222 с.
3. Murahami, Y. Biotechnology of fruittrees / Y. Murahami // Farmg. Japan. - 1987. - Vol. 21, № 1. - P. 27-36.
4. Dayan Wang, Gao-lin Gui, Jang San Sun. Tissue culture of . fruit crops in China// Hortscience. - 1988.
- Vol. 23, № 6. - P. 962-965. 13.
5. Hanre V. Nutzung biotechnologisches Verfahren fur die Obstzuchtung// Landwirtschaftwissenschaft. -1990. - № 292. - S. 193-199.
6. Жуков, О.С. Методические рекомендации по получению растений регенератов плодовых пород в культуре пыльников / О.С. Жуков, О.Я. Олейникова, Н.И. Савельев. - Мичуринск, 1994. - 36 с.
7. Lespinasse Y., Godicheau M., Duron M. Potential value 14. and method of producing haploids in the apple tree Malus pumila Mill// Acta Horticulturae. - 1983. - Vol.
131. - P. 223-230.
8. Zhang J.X., Lespinasse Y., Chevreau E. Obtention de plantes haploides de pommier (Malus domestica 15. Borkh) issues de parthenogenese induite in situ
par du pollen irradie et culture in vitro des pepins immatures// C.r.Acad.sci. - 1988. - Vol. 307. - P. 451457.
9. Laurie, D.A. The production of haploid wheat plants 16. from wheat x maize cross / D.A. Laurie, M.D. Bennett
// Theor.Appl. Genet .- 1988.- Vol. 76. - P. 393-397.
10. Inagaki M., Henry Y., Buyser J. Comparison of haploid production efficiency through anther culture and 17. intergenetic crossing in three wheat varieties and
their Fl hybrids / Japan J. Breeding. - 1987. - Vol. 57. -№ 4. - 474 p.
ЛИТЕРАТУРА
Suenaga K., Nakajime K. Efficient production through crosses between Japanense wheat and maize (Zea mays7) / Plant Cell Reports. - 1989. -Vol. 8. - P. 263266.
Чистякова, В.Н. Экспериментальная гаплоидия как средство интенсификации генетико-селекционных работ / В.Н. Чистякова, Э.Д. Неттевич, Т.В. Гуляев // Совершенствование селекционно-генетических процессов при выведении сортов зерновых и зернобобовых культур в Нечерноземной зоне. - Москва, 1990. - С. 3-12.
Чистякова, В.Н. Метод ускоренного получения гомозиготных линий мягкой пшеницы и неполных 56 хромосомных пшенично-пырейных амфиди-плоидов при внутривидовой гибридизации / В.Н. Чистякова. // Совершенствование селекционно-генетических методов при выведении сортов зерновых и зернобобовых культур в Нечерноземной зоне. - М.: 1990. - С. 3-12. Долматов, Е.А. Стимулятивный апомиксис и проблема получения гомозиготных растений у груши / Е.А. Долматов // Селекция и сорторазведение садовых культур. - Орел: ВНИИСПК, 1996. - С. 11-123.
Долматов, Е.А. Апомиксис у груши и перспективы его использования / Е.А. Долматов. // На благо отечественного садоводства (150 лет Всероссийскому НИИ селекции плодовых культур). - Орел: «Тургеневский бережок», 1996. - С. 165-167. Долматов, Е.А. Апомиксис и экспериментальная гаплоидия у груши / Е.А. Долматов, Н.И. Панова // Селекция и сорторазведение садовых культур. -Орел: ВНИИСПК, 1998. - С. 276-280. Долматов, Е.А. Изучение морфологической неоднородности апомиктического потомства груши / Е.А. Долматов, Е.Н. Седов, Н.И. Панова, Г.А. Седы-шева // Доклады РАСХН, - 1998. - № 4. - С. 15-16.
