CC BY
47
СТИМУЛИРОВАННОЕ ВИДИМЫМ СВЕТОМ ИНФРАКРАСНОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ В ИССЛЕДОВАНИИ БИОМОЛЕКУЛ И МЕМБРАННЫХ КОМПЛЕКСОВ
Терпугов Е.Л., Дегтярева О.В.
Институт биофизики клетки РАН, 142290 Московская обл., ул. Институтская 3, факс: +(4967) 330509; E-mail: EL_TERPUGOV@rambler.ru
В данном сообщении представлено использование эффекта вторичного ИК-излучения, стимулированного многочастотным видимым светом умеренной мощности для получения информации о колебательных и электронных состояниях биомолекул. Это вторичное ИК-излучение имеет два основных признака вынужденного излучения, такие как направленность и модовая структура. Хотя еще отсутствует детальное теоретическое описание, данный метод уже сейчас является полезным в практическом использовании для наблюдения слабых КР и ИК- активных колебаний, которые не могут выявлены с помощью методов линейной колебательной спектроскопии. Преимущество данного подхода лежит в том, что он позволяет наблюдать одновременно фундаментальные переходы, обертона или составные частоты, а также взаимодействие между модами и выявлять каналы распространения колебательной энергии.
Мы демонстрируем применимость нового подхода для измерения колебательных спектров ИК-эмиссии молекул ретиналя in vitro и непосредственно внутри сложного белкового комплекса бактериородопсина. Записывая спектры ИК-эмиссии all-trans изомера ретиналя при разных условиях возбуждения, мы смогли «законсервировать» их в различных колебательных состояниях. Это наблюдение имеет большое значение для различных практических приложений, поскольку оно дает возможность осуществлять контроль за поведением молекул в колебательно-возбужденном состоянии.
В последние десятилетия большой интерес к исследованию молекулярных механизмов фотопревращений ретинальсодержащих белков, в особенности зрительного родопсина (Р) и бактериородопсина (БР) обусловлен не только тем, что эти белковые молекулы обладают уникальными физическими и химическими свойствами, но и тем что они являются молекулярными структурами, необходимыми участниками запасания, передачи энергии рецепции большинства жизненно важных процессов в живых системах. Они обладают упорядоченной 3 х мерной структурой, состоящей из плотноупакованной белковой молекулы и кофактора (ретиналя), который является световоспринимающей молекулой, хромофором с сопряженными двойными связями. Под действием света в молекулах Р или БР запускается фотоцикл, циклический процесс фотохимических превращений, на первых стадиях которого в механизм включены фотоиндуцированные изменения, приводящие к переходам во множественные конформационные состояния.
Главной особенностью фотоцикла всех этих молекул является то, что первичные, светом индуцированные переходы происходят наиболее эффективно и особенно быстро, на временной шкале от нескольких сотен фемтосекунд до нескольких пикосекунд. Понимания причин высокой эффективности и сверхбыстрой динамики все еще нет, поэтому наиболее важной задачей представляется исследование колебательно-возбужденных состояний и их динамики.
В данной проблеме существует и второй аспект, которым является разработка наиболее адекватных методов для выяснения деталей, необходимых для восстановления полной картины первичных событий в ретинальсодержащих белках. В настоящее время, наибольшее распространение получили различные виды флеш-фотолизных экспериментов с использованием линейной, так и нелинейной спектроскопии [1]. Последняя, успешно развивается благодаря достижениям в лазерной технике и возможности получать генерацию стабильных импульсов, длительностью до нескольких фемтосекунд. Все эти методы основаны на том, что сначала производится лазерное возбуждение определенной моды и тем
самым нарушается равновесное состояние, а затем, используя стратегию дифференциальной спектроскопии исследуется процесс теплового равновесия как функция времени. Единственным способом, который позволяет напрямую исследовать колебательные релаксационные процессы является прямая регистрация колебательных спектров ИК-эмиссии, но в настоящее время это сопряжено с рядом определенных трудностей. Наиболее важной трудностью является малая энергетичность испускаемых ИК-квантов в средней ИК-области, где локализованы основные колебания молекул. Современный технический уровень не позволяет создать специальную инструментальную технику, подобную той, что существует для регистрации высокоэнергетичной электронной флуоресценции в видимой или ближней ИК-области. Между тем, для этих целей широко используется техника адсорбционной ИК-фурье спектроскопии применяемая, преимущественно к сильно нагретым образцам (разряженные газы или жидкости) [2], что делает их практически не пригодными для исследования биомолекул.
В представленной работе используется новый подход, основанной на использовании ИК-Фурье техники и возбуждении видимым светом ИК-эмиссии в приложении к биологическим молекулам. В его основе лежит ИК-эмиссионный отклик системы в ответ на полихроматическое возбуждение видимым светом от низкоинтенсивного источника. По сути, экспериментальные условия как по возбуждению, так и температуре (используется температура окружающей среды) в большей степени приближены к естественным условиям. При этом вода не является серьезным препятствием в дискриминации полос как в спектре ИК-поглощения. В основе метода лежит нетривиальный эффект колебательного возбуждения системы без использования привычных схем многоступенчатого электронного или колебательного возбуждения как это происходит с использованием лазерного излучения. Этот эффект мало изучен. В литературе имеются немногочисленные случайные сведения и до сих пор не проведено систематических исследований данного феномена. Между тем, результаты первых исследований, выполненных в нашей лаборатории в Институте биофизики клетки РАН показали, что данный феномен связан с нелинейными эффектами, обусловленными смешением волн в данных условиях возбуждения [3,4]. В этом случае наблюдаемый ИК-отклик системы обусловлен не столько спонтанными переходами, сколько вынужденным процессом испускания колебательных квантов под действием бигармонической накачки в результате смешения многочастотных оптических волн в образце и образовании новых частот, совпадающих с собственными колебательными модами образца. В стационарных условиях освещения это приводит к «консервации» колебательного возбуждения в образце, что позволяет регистрировать колебательное возбуждение в образце в длительно-протекающем эксперименте. Хотя еще отсутствует детальное теоретическое описание, данный метод уже сейчас является полезным в практическом использовании для наблюдения слабых КР и ИК- активных колебаний, которые не могут выявлены с помощью методов линейной колебательной спектроскопии.
Представленные спектры ИК-эмиссии свободного ретиаля и БР обеспечивают не только информацией о частотах колебательных осцилляторов. Они также иллюстрируют дополнительные важные свойства динамики, так как колебательные частоты относятся к переходным или промежуточным состояниям, которые важны для теоретических расчетов, необходимых для определения реакционных координат.
9= "
^ OL
S3
WHejUVHRfcm1 )
Рис.1 Спектр модельного соединения all-trans изомера ретиналя представлен области от 500 до 4000 см-1. Спектр записан с помощью отечественного ИК-Фурье спектрометра ФС-02 со спектральным разрешением 4 см-1 и усреднением 600 сканов при возбуждении светом от 100Вт ксеноновой лампы с использованием фильтра (Х>520 нм) и при мощности 320 мВт/см2. Как видно, в высокочастотной области вместе с колебаниями С-Н групп ретиналя между 2850-2950 см-1, также присутствует целый набор полос. Как показали наши тривиальные расчеты, эти полосы могут представлять обертона основных частот или их комбинаций.
Выполненные на основе литературных данных отнесения показали, что большинство полос присутствующих в спектре, в том числе и наиболее интенсивных имеют характер всякого рода деформационных колебаний метильных и концевых групп, а также колебаний, связанных с деформациями различных участков углеродного скелета. Это является отражением того, что молекула ретиналя в свободном состоянии не обладает жестко связанным скелетом, и она демонстрирует большую подвижность, допуская при возбуждении большую свободу движений самых разнообразных групп, включая свободное кручение концевых групп. Варьируя условия, при которых возбуждающий свет попадал в максимум или край полосы поглощения было выявлено, что в молекуле ретиналя существуют по крайней мере два процесса, связанные с внутримолекулярным распространением колебательного возбуждения.
В данных экспериментальных условиях в БР было выявлено три колебательно-возбужденных состояния. Одно из них идентифицировано как К-подобное состояние, другое принадлежит основной светоадаптированной форме БР568 и третье- это состояние, общее для вышеназванных двух.
При исследовании БР также были выявлены молекулярные группы и связи, по которым идет распространение и релаксация колебательного возбуждения и показано, что в возбужденном состоянии ретиналь тесно взаимодействует с белком.
В заключение хотели бы отметить еще одно важное обстоятельство. При данных измерениях не требуется особой подготовки образцов. В сообщении приводятся иллюстрации спектров, снятых на свежих листьях табака. Эти спектри
также демонстрируют возможность различить сорт дикого вида от его генно-модифицированного аналога.
1. В.С. Летохов, Лазерная пикосекундная спектроскопия и фотохимия биомолекул, Наука, М., 1987.
2. H.A.Willis, Laboratory methods in vibrational spectroscopy, J.Wiley and Sons, NY, 1987
3. Е.Л. Терпугов, О.В. Дегтярева, Письма в ЖЭТФ, 2001, т.73, вып.6, с.320-323.
4. Е.Л.Терпугов, О.В.Дегтярева, А.Г. Гагаринов, В.В. Савранский, Краткие сообщения по физике ФИАН, 2004, т.12, с. 13-22.
APPLICATION OF LIGHT- STIMULATED IR-EMISSION SPECTROSCOPY TO BIOMOLECULES AND MEMBRANE COMPLEXES.
Terpugov E.L., Degtyareva O.V.
Here, we repot the using of the effect of the secondary IR-emission, stimulated by a low intense broadband visible light for studying of the vibration transitions in biomolecules in the vibrationally excited states. This secondary emission has two main features of stimulated radiation such as directional radiation and mode structure. The recorded IR signal has a complicated spectral profile and the IR emission spectra are selective to the sample or a definite group in it and their conformation. Though the method has not been described in detail yet, even now it is helpful for observing low-intensity or R and IR active vibrations that cannot be detected by traditional methods of vibrational spectroscopy. The advantage of the method is that it permits (1) observing simultaneously basic transitions, overtones or combinational frequencies, as well as interaction of eigenmodes, and (2) revealing the channels of vibration energy dispersion. We demonstrate the applicability of novel approach of FT-IR emission spectroscopy for measuring of the vibrational emission spectra of retinal molecule in vitro and in situ in the bacteriorhodopsin. By recording of the IR-emission spectra of all-trans isomer retinal under different illumination conditions we could trap the retinal molecules in various vibrationally -excited states. This observation is of importance for various practical applications because it gives a real control over the behavior of molecules in the vibrationally-excited state.
