CC BY
56
■■■ I I I I I I
10
Новости клеточных технологий
cm
НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
«БЕетЬ^» - новая технология репрограммирования ядра взрослой клетки без использования эмбрионов
Технология переноса ядра соматической клетки ^С^) является основным способом получения линий аутогенных стволовых клеток, специфичных только для конкретного пациента [1, 2]. Кроме того, SCNT служит прекрасной моделью изучения феномена репрограммирования ядра взрослой клетки. До недавнего времени считалось, что у человека лишь овоплазма яйцеклетки обладает уникальной способностью репрограммировать ядро взрослой клетки [1 ]. Однако в недавних работах было показано, что и эмбриональная стволовая клетка [ЭСК] как мыши [3], так и человека [4, 5] также способна репрограммировать ядро взрослой клетки при их слиянии. Тем не менее, получаемые при этом тетраплоидные гибриды, содержащие ядра обеих клеток, вряд ли смогут применяться с медицинской целью, поскольку неизвестна их безопасность [4].
Тг*
Рис. 1. «Stembrid» колония - окраска на TRA-2-39 (L-alkaline phosphatase) (зелёный), Oct-4 (красный), DAPI (синий) Фото предоставлено Н. Стрельченко
История создания клеточных гибридов насчитывает более 30 лет. В 1974 году Veomett впервые выполнил «реконструкцию» [технология «recon») клеток млекопитающих путём слияния цито- и кариопластов [6]. Позднее была предложена технология цитоплазматических гибридов - «cybrid», когда родительскую клетку перед слиянием энуклеировали
[7]. Способность цитопласта репрограммировать донорское ядро была показана в работах Howell и Abken [8, 9]. Так в экспериментах Howell, при слиянии ядра злокачественной и нормальной клеток, «цибрид» терял свойства онкогенности
[8]. При слиянии нулипотентной эмбриональной карциномы F9 с клетками тимуса и роговицы Atsumi получал плюрипо-тентные гибридные линии, имеющие характеристики зрелых нервной, мышечной и хрящевой тканей [10].
Исследователи из Reproductive Genetic Institute [Chicago, IL, USA) под руководством Юрия Верлинского впервые использовали технологию «cybrid» для получения аутогенных
стволовых клеток путём слияния взрослой клетки с энукле-ированной ЭСК. На данную технологию были оформлены заявки на патент [20040259249 и 20030032180). Для слияния использовали цитопласты нормальных ЭСК и фиб-робласты, лимфоциты периферической крови и мононукле-арные клетки пуповинной крови человека. На полученных колониях изучали экспрессию маркёров плюрипотентности ЭСК - TRA-2-39 и Oct-4.
Частота слияния зависела от вида клеток и режима процедуры. Оптимизация концентрации таких агентов слияния как ДМСО и полиэтиленгликоль приводила к частоте формирования гетерокарионов в 12.8% с фибробластами и в 18.4% с лимфоцитами. Поскольку в эксперименте использовали «женские» (46XX) ЭСК и «мужские» (46XY) соматические клетки, то формирование стабильных гетерокарионов подтверждали FISH-анализом на Y-хромосому. Клетки суЬ^-ко-лоний митотически делились, имели типичную морфологию ЭСК, характеризовались стабильным кариотипом 46XY и высоким уровнем экспрессии TRA-2-39 и Oct-4. Кроме того, клетки колоний экспрессировали и другие маркёры плюрипо-тентности ЭСК - SSEA3, SSEA4, TRA-1 -60 и TRA-1-80.
Таким образом исследователи представили первые очевидные доказательства полной замены ядра ЭСК ядром соматической зрелой клетки при их слиянии. Получены первичные данные, что цитоплазма ЭСК способна реп-рограммировать ядро взрослой клетки человека при его замене. Интересно, что в аналогичном эксперименте с клетками мыши, была получена только одна колония с экспрессией Oct-4 [11]. Более того, в недавней работе японских авторов показано, что слияние кардиомиоцитов мыши с ЭСК приводит к формированию гибридов с характеристиками обеих клеток [12]. Авторы работы не описывают выделение отдельных чистых «stembrid» линий, что наряду с in vivo экспериментами было бы чётким доказательством жизнеспособности и перспективности разработанной технологии. Будущие исследования по-видимому будут направлены на увеличение частоты слияния, выделение чистых stembrid-линий с демонстрацией их плюрипотентности и доказательства репрограммирования ядра взрослой клетки большим набором методов.
Участники работы: Н. Стрельченко, В. Кухаренко, А. Шку-матов, О. Верлинский, А. Кулиев, Ю. Верлинский.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Jeanisch R., Eggan K., Humpherys D. et al. Nuclear cloning, stem cells, and genomic reprogramming. Cloning Stem Cells 2002; 4: 389-96.
2. Hwang W.S., Lee B.C., Lee C.K., Kang S.K. Cloned human embryonic stem cells for tissue repair and transplantation. Stem Cell Reviews 2005; 2: 99-110.
3. Tada M., Takahama Y., Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Current Biology 2001; 11: 1553-8.
4. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of spermatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005;
309: 1369-73.
5. Yu J., Vodyanik M.A., He P. et al. Human embryonic stem cells reprogram myeloid precursors following cell-cell fusion. Stem Cells 2006; 24(1): 168-76
6. Veomett G., Prescott D.M., Shay J.W., Porter K.R. Reconstruction of mammalian cells from nuclear and cytoplasmic components separated by treatment with cytochalasin B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1974; 71: 1999-2002.
7. Wallace D.C., Bunn C.L., Eisenstadt J.M. Cytoplasmic transfer of chloramphenicol resistance in human tissue culture cells. J. Cell Biol. 1975; 67: 174-88.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 2(4), 2006
I I I I I I
Ш
Новости клеточных технологий
8. Howell A.N., Sager R. Tumorigenicity and its suppression in cybrids of mouse and Chinese hamster cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978; 75: 2358-62.
9. Abken H., Jungfer H., Albert W.H., Willecke K. Immortalization of human lymphocytes by fusion with cytoplasts of transformed mouse L cells. J. Cell Biol. 1986; 103: 795-805.
10. Atsumi T., Shirayoshi Y., Takeichi M., Okada T.S. Nullipotent teratocarcinoma cells acquire the pluripotency for differentiation by fusion with
somatic cells. Differentiation 1982; 23: 83-6.
11. Do J.T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells 2004; 22: 941-9.
12. Takei S., Yamamoto M., Cui L. et al. Phenotype-specific cells with proliferative potential are produced by polyethylene glycol-induced fusion of mouse embryonic stem cells with fetal cardiomyocytes. Cell Transplant. 2005; 14(9): 701-8.
Подготовил A.B. Берсенев по материалам Reprod. BioMed Online 2006; 12 (1): 107-11
Лечение серповидно-клеточной анемии комбинацией методов генной терапии и РНК-интерференции
Явление РНК-интерференции [RNA interference) было открыто в ходе экспериментов по подавлению экспрессии генов при помощи антисмысловой РНК у C. elegans. Термин «РНК-интерференция» (iRNA) для феномена специфического подавления экспрессии генов при введении двухцепочечной РНК был предложен Andrew Fire в 1998 году [1, 2]. РНК-интерференция предполагает специфическое нарушение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой степенью гомологии с введенной двухцепочечной РНК) (рис.).
РНК-интерференция уже широко изучается с терапевтической целью, например, для подавления экспрессии вирусных генов, онкогенов или специфических генов, вызывающих заболевания [3]. Достоинства этого метода - высокая специфичность (подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой двухцепочечной РНК); высокая эффективность (экспрессия гена подавляется более чем на 90%, несколько десятков молекул двунитевой РНК могут привести к деградации нескольких тысяч молекул РНК-мишени).
Пока терапевтическое использование РНК-интерферен-ции ограничено, во-первых, жесткими условиями выбора гена, работу которого надо подавить, во-вторых, индукцией ответа иммунной системы на экзогенную РНК, которая может привести к полному подавлению синтеза белка и апоп-тозу [4, 5]. Регуляция синтеза siRNA в определенное время и в определенных клетках позволит минимизировать возможное повреждающее действие РНК-интерференции. Применение РНК-интерференции в клеточной терапии требует точного, высокоспецифичного определения гена, играющего главную роль в развитии заболевания, так как РНК-интерференция заставляет этот ген «замолчать».
Ученые из Sloan-Kettering Institute (New York, NY, USA) впервые показали возможность использования РНК-интер-ференции вместе с трансгенезом при лечении серповидноклеточной анемии (СКА).
Причина СКА заключается в однонуклеотидной замене урацила на аденин, в результате чего синтезируется цепь молекулы глобина с глютамином, вместо валина. Замена одной аминокислоты оказывается достаточной, чтобы изменить функциональные свойства гемоглобина (пониженная растворимость, повышенная полимеризация). При этом гемоглобин уже не может выполнять кислородакцепторную функцию и кристаллизуется при недостатке кислорода, а эритроциты приобретают серповидную форму, склеиваются,
тромбируют капилляры и т. д. Мутантный ген получил название ps, в отличие от нормального р-глобина.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 2(4), 2006
