CC BY
42
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
Все эти факторы описаны и известны как определяющие и поддерживающие самообновление и «стволовость» ЭСК [5 7]. IPS MEF4 клетки, полученные из эмбриональных фиб робластов, обладали типичными свойствами ЭСК - имели подобную морфологию и рост в культуре с формированием эмбриоидных телец, образовывали тератомы в классическом in vivo тесте, были способны к мульти дифференцировке. Другим важным доказательством эффективности метода репрограммирования стал эксперимент по получению ЭСК подобных колоний из взрослых фибробластов индукцией 4 вышеуказанных генов (iPSTTF4) и демонстрация их плюри потентности формированием тератом in vivo, а также химери зация эмбриона при их инъекции в бластоцисту.
Интересно, что эффективность формирования ЭСК подобных колоний не зависела от введения гена Nanog -первого и значительного (по мнению группы Austin Smith) фактора кандидата, обусловливающего феномен репрог раммирования [4]. В комментарии к статье Kevin Eggan и Kit Rodolfa из Harvard Stem Cell Institute указывают, что полу ченные клетки нельзя назвать абсолютно идентичными ЭСК, а репрограммирование полным. На это указывают факты отсутствия постнатальной химеризации животных после инъекции в бластоцисту, увеличение разницы в карте ген ной экспрессии на микрочипах при пассировании клонов по сравнению с контрольными ЭСК (например, отсутствие
экспрессии Еса11), различный уровень метилирования 0с13/4 промотера, говорящий о неполном эпигенетичес ком репрограммировании. Поэтому, по сравнению с други ми методами, уровень репрограммирования фибробластов в работе остаётся неполным, и, возможно, !РЭ клетки более похожи на клетки эмбриональной карциномы (ЕСС), но не идентичны ЭСК [8].
Тем не менее, эксперименты Уатапака чётко указыва ют на перспективность такого методического подхода для тестирования возможных факторов репрограммирования в эксперименте. Авторы впервые показали, что метод приме ним для индукции репрограммирования взрослой дифферен цированной соматической клетки (на примере взрослого фибробласта мыши) и выявили 4 новых фактора, обуслов ливающих этот феномен. Остаётся неизвестным значение в репрограммировании каждого фактора в отдельности, их ансамбль и взаимодействие. Приведёт ли к полному реп рограммированию взрослой терминально дифференциро ванной клетки добавление ещё одного двух каких либо факторов и каких? Будет ли этот метод работать на других типах соматических клеток и у человека? Ответы на эти воп росы позволят понять биологические механизмы феномена репрограммирования и значительно продвинуть клинические перспективы метода создания пациент специфичных плю рипотентных клеток в регенеративной медицине.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Wilmut I., Schnieke А.Е., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385(6619): 810 3.
2. Tada М., Takahama Y., Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr. Biol. 2001; 11: 1553 8.
3. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A, Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005; 309: 1369 73.
4. Silva J., Chambers I., Pollard S., Smith A. Nanog promotes transfer of pluripotency after cell fusion. Nature 2006; 441 (7096): 997 1000.
5. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005; 122(6): 947 56.
6. Cartwright P., McLean C., Sheppard A. et al. LIF/STAT3 controls ES cell self renewal and pluripotency by a Myc dependent mechanism. Dev. 2005; 132(5): 885 96.
7. Li Y., McClintick J., Zhong L. et al. Murine embryonic stem cell differentiation is promoted by SOCS 3 and inhibited by the zinc finger transcription factor Klf4. Blood 2005; 105(2): 635 7.
8. Rodolfa K.T., Eggan K. A transcriptional logic for nuclear reprogramming. Cell 2006; 126(4): 652 5.
Подготовил A.B. Берсенев По материалам Cell 2006; 126: 663-76
КЛОНИРОВАНИЕ
Зависимость эффективности клонирования от степени дифференцировки клетки - донора ядра
За последние 10 лет экспериментов по переносу ядра соматической клетки в энуклеированный овоцит с целью кло нирования организмов или создания линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) было установлено, что успех процеду ры зависит от степени дифференцировки клетки - донора ядра. Так было постулировано, что при использовании ядра ЭСК ве роятность рождения жизнеспособных клонов повышается в 5 10 раз [1]. Это привело к рождению гипотезы использова ния ядра «взрослой» стволовой клетки для улучшения резуль тативности процедуры клонирования (2). Логично предполо жить, что «полностью репрограммировать» ядро стволовой или прогениторной клетки теоретически легче, чем терминально
дифференцированной. Справедливость такого подхода совсем недавно была показана в эксперименте, использующем в ка честве донора ядра нейральную стволовую клетку (2). Кроме того, попытки клонирования мыши из постмитотического обо нятельного нейрона (3) и зрелых Т, В лимфоцитов (4) ока зывались удачными только при применении двух шагового протокола путём химеризации бластоцисты или тетраплоид ного эмбриона клонированными ЭСК (3, 4].
Международная группа исследователей из нескольких уни верситетов США и Японии недавно завершила интересное исследование, показывающее зависимость эффективности клонирования мыши от степени дифференцировки клетки -
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
донора ядра. Исследователи предположили, что вероятность развития и рождения клонов будет выше при переносе ядра зрелой постмитотической клетки по сравнению со взрослой стволовой. Гипотеза базировалась на результатах недав ней работы японской группы Kimiko Inoue из университета RIKEN, продемонстрировавшей, что эффективность репрог раммирования ядра и клонирования мыши из гемопоэтичес кой стволовой клетки неожиданно оказалась очень низкой [5]. В настоящем эксперименте авторы также использова ли гемопоэтические клетки одной линии дифференциров ки, поскольку ГСК у мыши, на сегодняшний день, являются самыми хорошо описанными примерами «взрослых» ство ловых клеток. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Genetics.
Для сравнения эффективности клонирования были ис пользованы ядра высокоочищенных клеток крови одной ли нии дифференцировки гемопоэтической стволовой (ГСК), гемопоэтической прогениторной клетки (ГП) и постмитоти ческого гранулоцита (Г) мыши. Эффективность клонирования ранних эмбрионов (на стадии морулы бластоцисты) оказалась значительно ниже при использовании ГСК (8%) по сравне нию с ГП (11%) и Г (35%). Большинство эмбрионов, полу ченных от ГСК, останавливались в развитии на 2 4кле точной стадии. Авторам удалось получить 2 мышат при переносе ядра постмитотического гранулоцита. Частота клонирования при этом составила 1,1%. В контрольных эк спериментах использование ядер кумулюсных и эмбриональ ных стволовых клеток приводило к развитию бластоцисты с частотой 53,3% и 49% соответственно, а также к рожде нию клонированного потомства в 3% и 9% случаев соответ ственно, что совпадает с данными, полученными другими группами исследователей (1, 6].
Авторы указывают, что это первое документированное исследование, показывающее возможность клонирования мыши непосредственно путём переноса ядра постмитоти ческой терминально дифференцированной клетки. Все клетки - доноры ядер в эксперименте были тщательно оха растеризованы фенотипически (получены методом клеточ ного сортинга) и функционально (реконституция костного
мозга после пересадки ГСК и ГП, исследование колониеоб разования). Было показано, что гранулоциты, используемые в работе, не были способны совершать клеточные деления. В отличие от этой работы, все клетки, используемые други ми группами исследователей (кумулюсные [6], NKT (7), фиб робласты) были способны митотически делиться. Попытка использования постмитотичекой клетки приводила к успеху только при использовании двухступенчатого протокола (хи меризации зародыша клонированными ЭСК) (3, 4].
Безусловным достоинством работы является использо вание системы одного «гемопоэтического дифферона» (ГСК - ПГ - Г) для сравнения эффективности клонирова ния в зависимости от степени дифференцировки клетки - до нора. Пока авторы не могут объяснить, почему ГСК (взрослая стволовая клетка) обладает меньшим потенциалом к реп рограммированию и клонированию, чем зрелые клетки. Ана логичные неожиданные результаты при использовании ГСК были получены до этого и японской группой (5). Сравнитель ные исследования глобальной генной экспрессии позволят идентифицировать гены или эпигенетические признаки, от ветственные за большую частоту репрограммирования клеточного ядра. Поскольку использование ЭСК по пре жнему приводит к самой высокой частоте клонирования, ав торы предполагают, что общие гены «стволовости» ЭСК и ГСК, по видимому, не отвечают за репрограммирование ядра клетки при его переносе в овоцит. Robert Blelloch в недав ней работе указывает, что частота репрограммирования в цитоплазме овоцита зависит от степени метилирования до норского ядра (2).
Таким образом, полученные данные опровергают попу лярную гипотезу о возможном улучшении эффективности репрограммирования ядра и клонирования организмов при использовании менее дифференцированной клетки доно ра (взрослой стволовой или прогениторной). Интересно было бы проверить эти данные на клетках человека. Кроме того, поскольку в эксперименте с использованием нейральных стволовых клеток были получены противоположные резуль таты (2), в будущем предстоит сравнить несколько типов взрослых стволовых клеток в рамках одного исследования.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Rideout W.M. 3rd, Eggan К., Jaenisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 2001; 293: 1093 8.
2. Blelloch R., Wang Z., Meissner A. et al. Reprogramming efficiency following somatic cell nuclear transfer is influenced by the differentiation and methylation state of the donor nucleus. Stem Cells 2006; 24(9): 2007 13.
3. Eggan K., Baldwin K., Tackett M. et al. Mice cloned from olfactory sensory neurons. Nature 2004; 428(6978): 44 9.
4. Hochedlinger K., Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear
transfer from mature B and T donor cells. Nature 2002; 415(6875): 1035 8.
5. Inoue K., Ogonuki N., Miki H. et al. Inefficient reprogramming of the hematopoietic stem cell genome following nuclear transfer. J. Cell Sci. 2006; 119:1985 91.
6. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385(6619): 810 3.
7. Inoue K., Wakao H., Ogonuki N. et al. Generation of cloned mice by direct nuclear transfer from natural killer T cells. Curr. Biol. 2005; 15(12): 1114 8.
8. Ogura A, Inoue K., Ogonuki N. et al. Phenotypic effects of somatic cell cloning in the mouse. Cloning Stem Cells 2002; 4(4): 397 40.
Подготовил A.B. Берсенев По материалам Nature Genet. 2006; AOP October 1; doi:10,1038/ng1895
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006
А
