CC BY
34
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК615.072
Стандартизация пептидного препарата тимоцин
Г. М. Бобизода1, Н. Д. Бунятян2, А. Н. Шахматов3
1 Академия образования Республики Таджикистан, 734024, Душанбе, Таджикистан
2 Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова,
119991, Москва, Россия
3 ООО «Занд», Республика Таджикистан, Душанбе
Статья поступила 13.01.2016 г. Принята к печати 12.02.2016 г.
Резюме: В настоящее время установлено, что некоторые низкомолекулярные пептиды обладают иммуномодулирующей активностью и применяются в качестве пептидных препаратов. Одним из наиболее важных микроэлементов, играющих важную роль в функционировании иммунной системы, является цинк. Проведенные исследования послужили основой для разработки иммуностимулирующего препарата тимоцин, представляющего собой водный раствор координационных соединений цинка с дипептидом изолейцил-триптофан, который был зарегистрирован в Республике Таджикистан в качестве иммуномодулирующего препарата. Проведенные исследования позволили провести стандартизацию и разработать фармакопейную статью на стандартный образец и лекарственную форму иммуномодулирующего препарата тимоцин.
Ключевые слова: тимоцин; фармакопейная статья; стандартный образец.
Библиографическое описание: Бобизода ГМ, Бунятян НД, Шахматов АН. Стандартизация пептидного препарата тимоцин. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения 2016; (1): 45—49.
В настоящее время установлено, что некоторые низкомолекулярные пептиды обладают иммуномодулирующей активностью и применяются в качестве пептидных препаратов [1]. Также известно, что некоторые микроэлементы играют важную роль в функционировании иммунной системы. Одним из наиболее важных микроэлементов в этом плане является цинк [2]. Как ранее [3] было показано на лекарственных препаратах органического происхождения, ком-плексообразование с ионами различных металлов приводит к увеличению специфической активности этих препаратов. Было обнаружено появление специфической активности энкефалинов при их комплек-сообразовании с ионом меди [4]. Было показано, что комплексообразование с ионами железа (II) и цинка приводит к повышению иммуностимулирующей активности у дипептида изолейцил-триптофан [5]. Эти исследования послужили основой для разработки иммуностимулирующего препарата тимоцин, представляющего собой водный раствор координационных соединений цинка с дипептидом изолейцил-триптофан [6], который был зарегистрирован в Республике Таджикистан в качестве иммуномодулирую-щего препарата. Тимоцин оказался эффективным при лечении различных заболеваний, сопровождающихся возникновением вторичных иммунодефицит-ных состояний [7, 8].
Целью данного сообщения является стандартизация и разработка фармакопейной статьи на тимоцин.
При создании лекарственной формы выбрано эк-вимолярное соотношение дипептида и иона металла при концентрации дипептида, как и в случае тимоге-на и тимогара, 100 мкг/мл. Лекарственная форма ти-моцина представляет собой 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолей-цил-триптофан с ионом цинка.
Для стандартизации препарата на первом этапе было необходимо разработать стандартный образец тимоцина.
Поскольку в состав тимоцина входит дипептид изолейцил-триптофан, обладающий собственным поглощением в УФ-области спектра при 278±2 нм, одним из методов, который можно применить для ка-чесивенного и количественного определения тимо-цина, может стать УФ-спектрофотометрия.
В связи с тем, что координационные соединения цинка с дипептидом изолейцил-триптофан образуются в водном растворе (в процессе получения тимо-цина) без выделения в свободном виде, для разработки стандартного образца тимоцина и методов его стандартизации было изучено влияние комплексооб-разования на интенсивность поглощения дипептида и на хроматографическую подвижность координационных соединений по сравнению с дипептидом.
Результаты спектрофотометрических исследований показали, что взаимодействие дипептида с ионом цинка не влияет на интенсивность поглощения дипептида при длине волны 280±2 нм, используемой для его количественного определения.
Сложность выбора оптимальных условий хрома-тографирования пептидов обусловлена существованием в растворе катионной, цвиттер-ионной и анионной форм, отличных по времени удерживания — в результате хроматографический пик соединения расширяется, что неприемлемо при анализе препарата. Тимоцин представляет собой раствор координационных соединений дипептида Н-Ие-Тгр-ОН с /п2+, существующих одновременно в нескольких комплексных формах, обусловленных ступенчатой диссоциацией дипептида [5].
Данных о влиянии соле- и комплексообразова-ния на хроматографические свойства пептидов практически не имеется. Только В. С. Смирнов (2003) сообщал, что мононатриевая соль Ь-глутамил-Ь-трип-тофана по данным ТСХ и ВЭЖХ идентична дипептиду в выбранных условиях хроматографиро-
mV 200
150
100
50
detector >iChl:28C inm
лА± 1 J.IAI, J, j,
ф-^ИГТП t
1 1 1 1 1 1 1 | 1 1 1 Ii Ii I I i i 1
0,0
2,5
mV 200
150
100
50
5,0 7,5 10,0 12,5 15,0
min
Jetector А С hl:280nm
■j, J. j,
. i f t i •H-14 t <l> 1 f t
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
Рис. 1. ВЭЖХхроматограммы дипептида изолейцил-трипто-фан (а) и его координационных соединений с цинком (б). Колонка Discovery С18 (25 см х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), подвижная фаза: смесь ацетонитрила и фосфатного буфера (pH 7,4) (40:60), скорость потока составляла 1 мл/мин, детектирование проводили при длинах волн 254 и 280 нм и времени элюирова-ния 30 минут
Первоначально методом ТСХ изучили влияние солеобразования на хроматографические свойства Н-11е-Тгр-ОН. При этом использовали свободный дипептид Н-11е-Тгр-ОН, хлоргидрат, ацетат, триф-торацетат, натриевую соль дипептида и его координационные соединения с цинком. Для смещения ионного равновесия дипептида в сторону образования одной ионной формы применили системы растворителей, содержащие как основные (пиридин), так и кислые реагенты (уксусная кислота): н-бутанол-пиридин-СН3СООН-Н2О (30:20:6:24) (А), СН3СООН-Н2О-СН3ОН-СНС13 (7:3:1:1) (Б). Значения вышеуказанных соединений в данных системах были одинаковы и равны 0,55 (А) и 0,88 (Б), свидетельствуя о существовании либо анионной (систе-маА), либо катионной (система Б) формы дипептида.
При хроматографировании методом ВЭЖХ, для смещения равновесия в сторону одной ионной формы использовали элюент состава: ацетонитрил — фосфатный буфер с рН 7,4 (40:60). Фосфатный буфер должен обеспечить присутствие пептида в одной ионной форме. Результаты хроматографирования свободного дипептида и его солянокислой, ацетатной и натриевой солей, а также координационных соединений с ионом цинка показали, что в выбранных условиях все ионные формы пептида имели одинаковое время удерживания — 5,21+0,15 минуты. Для примера на рис. 1 приведены ВЭЖХ хромато-граммы дипептида Н-11е-Тгр-ОН и его координационных соединений с цинком.
Таким образом, применение кислых и основных систем при хроматографировании пептидов, их солей и координационных соединений методом ТСХ, а также применение фосфатного буфера (рН 7,4) при ис-
D
1,2т 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7
0,6 J-■-■-■-■-■-■-■-■-■—
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
С, мкг/мл
Рис. 2. График линейности метода количественного определения тимоцина
пользовании ВЭЖХ позволяют получать хромато-граммы исследуемых соединений в одной ионной форме. Проведенные исследования позволили разработать фармакопейные статьи на стандартный образец тимоцина и его лекарственную форму. Параметры стандартизации стандартного образца и препарата приведены в таблице 1.
Для определения количественного содержания цинка в тимоцине (после его экстракции из препарата) был разработан метод, основанный на образовании окрашенного соединения цинка с дитизоном, интенсивность окраски которого зависит от содержания цинка. Фотометрирование проводили при 538 нм. Содержание цинка определяли по калибровочной кривой.
Методики количественного определения тимо-цина и содержания цинка в тимоцине спектрофото-метрическим методом были валидированы по параметрам линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность.
График линейности количественного определения тимоцина показан на рис. 2. В этом случае коэффициент корреляции составил 0,999, параметры линейной зависимости У{ = ЬХ1 + а были равны Ь = 0,00607, а = -0,0172.
При изучении повторяемости величина относительного стандартного отклонения не должна превышать 2% и составила в нашем случае 0,58%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.
Воспроизводимость методики изучали 2 аналитика в 5 повторностях, критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 10%. Среднее его значение составило 1,14%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости.
При изучении правильности методики путем измерения количественного содержания тимоцина в растворах, полученных путем добавления к исследуемому раствору необходимого количества стандарта с концентрациями 20, 40, 50, 60, 80, 100, 110 мкг/мл до получения окончательной концентрации 157 мкг/мл, средний процент восстановления находится в пределах от -101,08 до +101,72, среднее его значение составляет 100,15%, что соответствует необходимым требованиям.
Таким образом установлено, что методика легко воспроизводима, доступна, занимает минимум рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов. Она позволяет объективно оценивать качество тимо-цина.
В методику количественного определения цинка в тимоцине входит стадия экстракции цинка раствором дитизона в четыреххлористом углероде или хлороформе. Поэтому было необходимо провести ва-лидацию стадии экстракции. Изучение влияния времени экстракции и растворителя на результат определения показало, что оптимальным временем экстракции является 2 мин. Растворитель не оказывает влияния на результат определения.
Затем были проверены остальные характеристики методики: линейность, сходимость и правильность.
График линейности методики количественного определения содержания цинка приведен на рис. 3.
Рис. 3. График линейности метода количественного определения тимоцина
Таблица 1
ПАРАМЕТРЫ СТАНДАРТИЗАЦИИ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА И ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ - ТИМОЦИН
Стандартный образец Лекарственная форма
Параметр Метод определения и Параметр Метод определения и характе- характеристика ристика
Описание Белый или слегка желтоватый кристаллический порошок без запаха Описание Прозрачный бесцветный водный раствор без запаха
Растворимость Растворим в воде, очень мало рас- Подлинность Спектр поглощения препарата (ГФ XII, ОФС 42-0049—07) творим в спирте 95%, практически имеет максимум при 278±2 нм нерастворим в хлороформе и плечи при 273—275±2 нм и 287—288±2 нм
Подлинность Тимоцин Ацетат-ион (ГФ XI, вып.1, стр. 159) Цинк (ГФХ!, вып.1, стр. 165) Спектр поглощения имеет максимум при 278±2 нм и плечи при 273—275±2 нм и 287—288±2 нм Раствор дает качественную реакцию на ацетат-ион Раствор препарата дает качественную реакцию на ион цинка с раствором калия ферроцианида Прозрачность (ГФ XI, вып. 1, стр. 198) Препарат должен быть прозрачным
рН(потенциометрически, От5,5до6,8для0,016924%-ного Цветность Препаратдолженбыть ГФ XII, ОФС 42-0048—07) раствора (ГФ XI, вып. 1, стр. 194) бесцветным
Прозрачность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0051-07) Раствор должен быть прозрачным Посторонние примеси (ТСХ) На хроматографических пластинках должны появиться только два темно синих пятна с совпадающими
Цветность раствора Раствор должен быть бесцветным Механические Не должно быть (ГФ XII, ОФС 42-0050—07) включения
Посторонние примеси (ВЭЖХ) Содержание любой единичной примеси не более 0,9%, суммарное содержание примесей не более 2,0% Стерильность (ГФ XI, вып. 2, стр. 187-193) Препарат должен быть стерильным
Потерявмассепривысуши- Неболее6% Пирогенность Препаратдолженбыть вании(ГФХ1,вып.1,с.176) (ГФХ1,вып.2, апирогенным стр. 183-185)
Удельный показатель поглощения 163,1-176,7 Токсичность (ГФ XI, вып. 2, стр. 182-183) Препарат должен быть нетоксичным
Количественное содержание: Тимоцин (спектрофотометрия) Цинк (спектрофотометрия) От 90 до 110% От 90 до 110%
Параметры линейной зависимости ^ = ЬХ1 + а составляли Ь = 0,01, а = 0,021 и коэффициент корреляции составлял 0,999.
При определении сходимости методики величина относительного стандартного отклонения находилась в пределах 0,584-0,869%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости.
При изучении правильности методики было показано что средний процент восстановления находится в пределах от -101,08 до +101,72, среднее его значение составляет 100,15%.
Проведенные исследования показали, что разработанная методика количественного определения содержания цинка в тимоцине по всем параметрам пригодна для практического применения.
Полученные результаты включены в фармакопейные статьи «Тимоцин. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42 Т]-00002—08» (Срок действия установлен с 2013 по 2018 гг.) и «Тимоцин образец стандартный. Фармакопейная статья ФС 42-Т]-0003—08» (Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.).
Таким образом, проведенные исследования позволили провести стандартизацию и разработать фармакопейную статью на стандартный образец и ле-
карственную форму иммуномодулирующего препарата тимоцин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Морозов ВГ, Хавинсон ВХ, Малинин ВВ. Пептидные тимомимети-ки. СПб.: Наука; 2000.
2. Кудрин АВ, Громова OA. Микроэлементы в иммунологии и онкологии. М: ГЭОТАР-Медиа; 2007.
3. Крисс Е, Волченскова ИИ, Бударин ЛИ. Координационные соединения металлов с лекарствами — новые эффективные терапевтические агенты. Координационная химия 1990; 16(1): 11-21.
4. Mrabet B, Jouini M, Huet J, Lapluye G. Potentiometric, colorimetric and spectroscopic study of copper (II) complex of leucine — enkephalin and tripeptides, containing tyrosine. J Clin et Phys-chim Biol. 1992; 89(1 1-12): 2187-2205.
5. Бобиев ГМ, Бунятян НД, СаядянХС, Саповский ММ. Иммуноактив-ные пептиды и их координационные соединения в медицине. М.: Русский врач; 2009.
6. Бобиев ГМ. Способ получения иммуностимулирующего препарата тимоцин. Патент Республики Таджикистан, № TJ 282; 1998.
7. Мансуров ХХ, Мироджов ГК, Мансурова ФХ, Бобиев ГМ, Холназа-ров БМ. Тимоцин в терапии хронических диффузных заболеваний печени. Проблемы гастроэнтерологии 2010; 1-2:40-49.
8. Мирзоева ДС, Бобиев ГМ, Анохина ИВ. Применение тимоцина при лечении рака молочной железы. В кн.: VI съезд онкологов и радиологов стран СНГ. Материалы съезда: Душанбе, 1-4 октября 2010 г. Душанбе; 2010.
ОБ АВТОРАХ
Академия образования Республики Таджикистан. Республика Таджикистан, 734024 Душанбе, ул. Айни, 45. Бобизода Гуломнодир Муннамолович. Президент, д-р фарм. наук, проф.
Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова. Российская Федерация, 1 19991, Москва, Трубецкая улица, 8, стр. 2.
Бунятян Наталья Дмитриевна. Заведующий кафедрой фармакологии с курсом технологии лекарств факультета последипломного профессионального образования провизоров, д-р фарм. наук, проф.
ООО «Занд». Республика Таджикистан, 734005, Душанбе, ул. А. Каххарова, 111. Шахматов Александр Николаевич. Заведующий лабораторией, канд. хим. наук.
АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ
Бунятян Наталья Дмитриевна; [email protected]
STANDARDIZATION OF THE PEPTIDE PREPARATION TIMOCIN G. M. Bobizoda1, N. D. Bunyatyan2, A. N. Shakhmatov3
1 Education Academy ofthe Tajikistan Republic, 734024, Dushanbe, Tajikistan 2 I. M. Sechenov First Moscow State Medical University, 119991, Moscow, Russia 3 «Zand Ltd», 734005, Dushanbe, Tajikistan
Abstract: It is currently established that some low molecular weight peptides possess immunomodulating activity and are used as peptide preparations. One ofthe most important trace elements playing an important role in the functioning ofthe immune system is zinc. The performed research became the basis for the development ofthe immunomodulatory preparation timocin, in a form of aqueous solution of zinc coordination compounds with dipeptide isoleucyl-tryptophan, which has been registered in the Republic of Tajikistan as an immunomodulating preparation. The research allowed to perform standardization and develop pharmacopoeia monograph for the reference standard and the finished dosage form of the immunomodulatory preparation timocin.
Key words: pharmacopoeia monograph; reference standard.
For citation: Bobizoda GM, Bunyatyan ND, Shakhmatov AN. Standardization ofthe peptide preparation timocin. Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products Bulletin 2016; (1): 45—49.
REFERENCES
Morozov VG, Havinson VH, Malinin VV. Peptide Thymomimetics. St. Petersburg, Nauka, 2000 (in Russian).
Kudrin AV, Gromova OA. Dietary elements in immunology and oncology. M: GEOTAR Media; 2007 (in Russian).
3. Kriss E, Volchenskova II, Budarin LI. Metal coordination compounds with drugs — new effective therapeutic agents. Koordinatsionnaya himiya 1990; 16(1): 11-21 (in Russian).
4. Mrabet B, Jouini M, Huet J, Lapluye G. Potentiometric, colorimetric and spectroscopic study of copper (II) complex of leucine — enkepha-
lin and tripeptides, containing tyrosine. J Clin et Phys-chim Biol. 1992; 89(1 1-12): 2187-2205.
BobievGM, Bunyatyan ND, Sayadyan HS, Sapovskiy MM. Immunoac-tive peptides and their coordination compounds in medicine. Moscow: Russkiy vrach; 2009 (in Russian).
Bobiev GM. A method for producing an immunostimulatory drug Ti-mocin. Patent of the Republic of Tajikistan, № TJ 282; 1998 (in Russian).
Mansurov HH, Mirodzhov GK, Mansurova FH, Bobiev GM, Holnazarov BM. Timocin in the treatment of chronic diffuse liver diseases. Proble-my gastroenterologii 2010; 1-2:40-49 (in Russian).
Mirzoeva DS, Bobiev GM, Anohina IV. Use of Timocin in the treatment of breast cancer. In: VI congress of oncologists and radiologists of CIS. Proceedings of the Congress: Dushanbe, 1-4 October 2010. Dushanbe; 2010 (in Russian).
AUTHORS
Academy of Education of the Republic of Tajikistan, Ayni street, 45, Dushanbe, 734024, the Republic of Tajikistan. Bobizoda GM. President. Doctor of Pharmaceutical Sciences, professor.
I. M. Sechenov First Moscow State Medical University, Trubetskaya Street, 8/2, Moscow, 1 19991, Russian Federation.
Bunyatyan ND. Head of the Department of Pharmacology with a course of technology of medicines
of the Faculty of post-graduate professional education of pharmacists. Doctor of Pharmaceutical Sciences, professor.
«Zand Ltd», A. Kahharov street, 111, Dushanbe, 734005, the Republic of Tajikistan. ShahmatovAN. Head of laboratory. Candidate of Chemical Sciences.
