CC BY
145
сч
4
CS
CV 4
Стандартизация определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей с В - линейным острым лимфобластным лейкозом. Опыт работы российско-белорусской кооперативной группы
А.М. Попов1, М.В. Белевцев2, Е.В. Боякова1' 3, Т.Ю. Вержбицкая4' 5, Л.В. Мовчан2, М.С. Фадеева1, А.Б. Пащенко1, В.П. Савицкий2, А.А. Левадный3, Г.А. Цаур4, 5, С.А. Кашпор1, С.А. Плясунова1, Л. Г. Фечина4, О. В. Алейникова2, А. И. Карачунский1, 6
ФГБУ«Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Саморы Машела, 1; 2ГУ«Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»; Республика Беларусь,
223053 Минский район, дер. Боровляны, ул. Фрунзенская, 43; 3ГБУЗ «Станция переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы»; Россия, 115516 Москва, ул. Бакинская, 31; 4ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1»; Россия, 620149 Екатеринбург, ул. Серафимы Дерябиной, 32; 5ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий»; Россия, 620026 Екатеринбург, ул. Карла Маркса, 22а; 6ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России;
Россия, 117997Москва, ул. Островитянова, 1
Контакты: Александр Михайлович Попов uralcytometry@gmail.com
Наличие в Российской Федерации и Республике Беларусь оригинальных протоколов терапии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей диктует необходимость разработки собственных алгоритмов мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ). Целью работы является разработка оптимального стандартного подхода для многоцентровой иммунофенотипической диагностики МОБ у детей с ОЛЛ из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) во временных точках исследования костного мозга, предусмотренных протоколами группы «Москва—Берлин». Был разработан и успешно внедрен стандартизованный протокол определения МОБ методом проточной цитометрии при ВП-ОЛЛ на разных этапах терапии. Применение таких подходов позволило достичь очень высокой сопоставимости данных, получаемых в разных лабораториях. Эффективная интеграция в систему референсных лабораторий еще одной лаборатории показала высокую воспроизводимость разработанных алгоритмов определения МОБ. Это позволит в дальнейшем применять данную диагностическую технологию для определения МОБ при лечении ОЛЛ по протоколам группы «Москва—Берлин».
Ключевые слова: минимальная остаточная болезнь, проточная цитометрия, стандартизация
DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-4-64-73
Standardization of flow cytometric minimal residual disease monitoring in children with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Russia—Belarus multicenter group experience
A.M. Popov1, M. V. Belevtsev2, E. V. Boyakova13, T. Yu. Verzhbitskaya45, L. V. Movchan2, M.S. Fadeeva1, A.B. Pashchenko1, V.P. Savitskiy2, A.A. Levadnyy3, G.A. Tsaur4 5, S.A. Kashpor1, S.A. Plyasunova1, L.G. Fechina4, O.V. Aleynikova2, A.I. Karachunskiy'6
Federal Research Centre of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology named after Dmitriy Rogachev;
1 Samory Mashela St., Moscow 117997, Russia; Republican Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology; 43 Frunzenskaya St., Borovlyany village,
Minsk region 223053, Republic of Belarus; 3The Blood Transfusion Station of the Moscow Healthcare Department; 31 Bakinskaya St., Moscow 115516, Russia; 4Regional Children Clinical Hospital No 1; 32 Serafimy Deryabinoy St., Ekaterinburg 620149, Russia; 5Research Institute of Medical Cell Technologies; 22a Karla Marksa St., Ekaterinburg 620026, Russia; 6N.I. PirogovRussian National Research Medical University; 1 Ostrovitianova St., Moscow 117997, Russia
We developed and implemented in multicenter setting the standardized approach for flow cytometric minimal residual disease (MRD) monitoring in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL). Participation of multicenter group reference laboratories in several ring trial studies demonstrated high concordance rate between participants. Successful integration of one additional laboratory in the multicenter group has shown good level of our approach reproducibility. These results will allow implementing MRD detection in stratification system of pediatric ALL treatment protocols of Russia-Belarus multicenter group.
Key words: minimal residual disease, flow cytometry, standardization
Введение
Снижение в результате терапии количества опухолевых клеток в костном мозге (КМ) традиционно считается важным прогностическим фактором при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей [1, 2]. Но даже в случае, если количество опухолевых клеток ниже чувствительности обычных цитологических методов (менее 1 %), они могут вносить существенный вклад в неблагоприятный исход заболевания [3—7]. Совокупность этих клеток, не выявляемых цитологически, но обнаруживаемых другими, более чувствительными методами диагностики, получила название минимальной остаточной болезни (МОБ).
Одним из основных методов оценки МОБ является проточная цитометрия [7, 8]. Прогностическая значимость уровня МОБ, определяемого данным методом, показана в рамках различных протоколов терапии [9—13]. Наиболее важные для прогнозирования исхода заболевания точки исследования — середина и окончание индукции ремиссии [9—13]. Существенными недостатками мониторинга МОБ методом проточной цитометрии по сравнению с количественной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) являются субъективность и сложность стандартизации в рамках многоцентровых исследований [8, 14]. В то время как технология молекулярно-генетического исследования МОБ хорошо отработана и стандартизована [8, 14, 15], опубликовано лишь несколько работ по начальным этапам стандартизации цитометрического мониторинга ОЛЛ в рамках отдельных исследовательских групп [16-18].
Наличие в Российской Федерации и Республике Беларусь оригинальных протоколов терапии ОЛЛ у детей [19-22] диктует необходимость разработки собственных алгоритмов мониторинга МОБ.
Целью работы является разработка оптимального стандартного подхода для многоцентровой иммуно-фенотипической диагностики МОБ у детей с ОЛЛ из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) во временных точках исследования КМ, предусмотренных протоколами группы «Москва—Берлин».
Материалы и методы
В разработке и стандартизации подходов к цито-метрическому определению МОБ приняли участие 3 референсные лаборатории иммунофенотипирова-ния группы «Москва—Берлин»: ОДКБ № 1 (Екатеринбург), РНПЦ ДОГИ (Минск) и ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева (Москва). В 2 лабораториях определение МОБ производилось на цитометре FACS-CantoII (Becton Dickinson, США) (2 лазера, 6 цветов, затем 3 лазера, 8 цветов в обоих случаях), в 1 — на FC 500 и Navios (оба — Beckman Coulter, США) (2 лазера, 5 цветов).
Данная работа включала следующие этапы: ♦ обсуждение принятых в каждой лаборатории подходов к иммунофенотипированию ОЛЛ;
♦ выработка общих рекомендаций по пробоподго-товке, подбору антител и флуорохромов, настройке проточных цитометров;
♦ разработка алгоритма анализа цитометрических данных и выявления остаточных опухолевых клеток на разных этапах терапии по протоколу ALL-MB 2008;
♦ участие в различных системах внешнего контроля качества;
♦ разработка стандартного операционного протокола (СОП) для цитометрического мониторинга МОБ в рамках протокола ALL-MB 2008;
♦ проведение кругового исследования с рассылкой цитометрических данных с последующим анализом отдельно в каждой лаборатории. Обсуждение технологических аспектов, разработка общих подходов и оценка результатов работы проводились на встречах специально для этого созданной кооперативной группы в рамках группы «Москва—Берлин» (руководитель — проф. А. И. Карачунский). Всего с февраля 2007 г. (начало работы) по ноябрь 2014 г. (окончание включения пациентов в протокол ALL-MB 2008) было проведено 7 таких встреч. Обсуждались последовательность этапов при окрашивании моно-клональными антителами, выбор реагентов для лизиса эритроцитов и отмывки клеток, подбор клонов антител и приемлемых для каждого маркера сочетаний антитело—флуорохром, алгоритмы настройки проточных цитометров.
Данные проточной цитометрии анализировали в программном обеспечении FACSDiva 6.1 (Becton Dickinson), а также CXP и Kaluza 1.5 (обе — Beckman Coulter). Вырабатывали рекомендации для последовательного выделения на точечных графиках опухолевых клеток при определении МОБ в зависимости от их им-мунофенотипа [23, 24] и с учетом изменений антигенного профиля под действием терапии по протоколу ALL-MB 2008 [25, 26].
Все 3 лаборатории принимали участие во внешнем контрольном исследовании по определению МОБ, которое проводилось в декабре 2007 г. группой AIEOP-BFM и представляло собой рассылку fcs-файлов 23 пациентов, лечившихся по протоколу ALL-BFM 2000. Оценивали результаты определения МОБ на 15-й день терапии. Показатели каждой лаборатории сравнивали с референсным значением, представляющим собой медиану данных 4 наиболее опытных лабораторий группы AIEOP-BFM [16].
Ретроспективно оценивали распределение по величине полученных в каждой лаборатории результатов определения МОБ у пациентов, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008. Данный протокол является дальнейшим развитием отечественных протоколов по лечению ОЛЛ у детей ALL-MB 91 и ALL-MB 2002 и использовался в рамках многоцентровой кооперативной группы «Москва—Берлин» [19-21, 27].
cv
4
CS
CV 4
сч
CS
CV 4
Круговое исследование для оценки сопоставимости результатов, получаемых в 3 лабораториях, проводили посредством рассылки цитометрических данных в виде fcs-файлов с проточных цитометров. Так как основной задачей этой части работы была оценка возможности проспективного многоцентрового мониторинга МОБ в следующей версии протокола, данные были получены при определении МОБ у 10 пациентов на 15-й и 36-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2015. Каждое значение, полученное в отдельной лаборатории, сравнивали с медианой результатов всех 3 лабораторий (референсная величина), по аналогии с исследованием, ранее проводившимся группой AIEOP-BFM [16]. Кроме того, к исследованию была подключена еще 1 лаборатория, в которой также планируется проведение мониторинга МОБ в рамках протокола ALL-MB 2015. Ее данные также сравнивали с рефе-ренсными.
Результаты
Были разработаны следующие рекомендации по проведению иммунофенотипирования КМ в целях определения МОБ на 15-й и 36-й дни терапии по протоколам группы «Москва—Берлин».
комбинации антител, включающие кроме СБ19 такие маркеры, как СБ10, СБ20, СБ34, СБ45, СБ58 и СБ38. Попытки упростить подходы к определению МОБ путем сокращения панелей моноклональных антител могут снизить число пациентов, у которых возможно определение МОБ методом проточной цито-метрии.
Подбор флуорохрома для каждого конкретного антитела также является критически важным. Ключевые антитела, по которым происходит первичное выделение клеток, среди которых далее производится поиск МОБ (СБ19, СБ10), должны быть мечены яркими флуорохромами с хорошим разделением позитивного и негативного сигналов (АРС, РЕ). В то же время антитела к антигенам, экспрессируемым с разной интенсивностью различными клетками КМ (СБ45, СБ38), должны быть мечены флуорохромами с промежуточной интенсивностью свечения (РегСР, АРС-Су7, АРС-А1еха750, ВУ510 и др.), чтобы было возможно получить хорошее разделение популяций среди всех позитивных клеток. Появление на рынке антител, меченных новыми яркими флуорохромами (РБ-СБ594, ВВ515 и др.), существенно расширяет возможности формирования панелей для определения МОБ.
Забор и транспортировка материала
♦ Цельный КМ в объеме не менее 2 мл забирается в пробирку с калиевой солью этилендиаминтетра-уксусной кислоты в качестве антикоагулянта. Предпочтительно направлять на иммунофеноти-пирование материал, полученный в самом начале пункции, так как это позволяет максимально избежать разведения КМ периферической кровью, которое может исказить результаты исследования.
♦ В направлении на определение МОБ, кроме стандартной информации, должны быть указаны тип материала, протокол терапии и этап лечения.
♦ Образец КМ должен быть доставлен для исследования в течение 48 ч при температуре транспортировки 4 °С. При получении материала в лаборатории должна проверяться его сохранность. При наличии видимых сгустков, гемолиза или при факте длительного хранения запрашивается повторный образец.
♦ Фильтрация КМ может проводиться при наличии хлопьев жира и мелких сгустков. Если КМ вязкий, возможно его пропорциональное разведение фос-фатно-солевым буфером.
Подбор моноклональных антител
Несмотря на четкие отличия между опухолевыми и нормальными клетками в экспрессии различных антигенов, в настоящее время не существует единственного маркера, который был бы применим для мониторинга МОБ во всех случаях ВП-ОЛЛ. Поэтому для адекватного определения остаточных опухолевых клеток предпочтительно использовать многоцветные
Методика окрашивания
В промаркированные пробирки для проточной цитометрии вносятся первично-меченые антитела в соответствии с используемыми комбинациями маркеров. Вносимый объем раствора антител определяется титрованием и зависит от количества окрашиваемых клеток.
Добавляется необходимый объем цельного КМ, который рассчитывается исходя из клеточности исследуемого образца, определенной на гемоана-лизаторе. Необходимо окрасить примерно в 3—4 раза больше клеток, чем планируется проанализировать.
Образец тщательно перемешивается и инкубируется не менее 15 мин при комнатной температуре в темноте.
Добавляется соответствующее объему материала количество лизирующего раствора. Предпочтительно использование лизирующего реагента с содержанием фиксирующего компонента для дополнительной стабилизации клеток, подвергающихся химиотерапии.
Образец тщательно перемешивается и инкубируется согласно инструкции фирмы — производителя лизирующего реагента.
Образец отмывается 2 раза в 3 мл фосфатно-соле-вого буфера рН 7,0; удаляется супернатант. Добавляется 0,5—1,0 мл фосфатно-солевого буфера.
Готовый образец должен быть проанализирован на проточном цитометре в течение 2 ч с момента окрашивания.
Если предусмотрено окрашивание ДНК-тропным красителем БУТ016 или БУТ041, необходимо добавить 2—3 мкл раствора (1:200 в 20 мМ Трис - буфере с рН 7,5) красителя после окрашивания и инкубировать 10 мин при комнатной температуре в темноте.
Настройка проточного цитометра
Качество иммунофенотипического исследования во многом зависит от настроек используемого прибора. Основными параметрами, влияющими на результат исследования, являются стабильность работы лазеров и жидкостной системы, чувствительность фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) детекторов флуоресценции и цифровая компенсация данных флуоресценции.
Стабильность работы лазеров на большинстве приборов определяется по попаданию показателей работы лазеров в референсные диапазоны. У большинства производителей проточных цитометров существуют системы калибровочных частиц, позволяющие пользователю достаточно легко контролировать работу лазеров и ФЭУ. Персонал лабораторий обязан ежедневно контролировать стабильность работы лазеров для получения адекватных результатов анализа. Чувствительность ФЭУ жестко привязана к компенсации данных, поэтому ее настройка производится одновременно с настройкой компенсации. Для настройки компенсации необходимо применять калибровочные материалы, производимые поставщиком проточного цитометра, имеющегося в конкретной лаборатории. При использовании реагентов различных производителей необходимо проводить настройку чувствительности ФЭУ и компенсации для совершенно конкретных комбинаций используемых антител.
Анализ и интерпретация данных
Существуют значительные различия в иммунофе-нотипе опухолевых бластов при ВП-ОЛЛ и нормальных В-линейных предшественников (ВП) [28—31]. Именно на этих особенностях ассоциированного с лейкозом иммунофенотипа и строится поиск остаточных лейкемических клеток. Важно знать, что во время
индукционной терапии нормальные ВП в КМ отсутствуют, поэтому все обнаруживаемые ВП чаще всего являются опухолевыми [10, 32]. Однако нужно помнить, что В-линейная регенерация может начинаться в самом конце индукционной терапии (особенно у детей раннего возраста), поэтому нормальные ВП могут в крайне небольших количествах присутствовать в образце при определении МОБ на момент окончания индукционной терапии [33].
Есть существенные различия в экспрессии маркеров между опухолевыми клетками при СБ10+ и СБ10-вариантах ВП-ОЛЛ [23, 34]. Кроме количественных отличий экспрессии существуют также различия в доле пациентов, бласты которых экспрессируют тот или иной антиген. Так, при СБ10- ВП-ОЛЛ число СБ20+ пациентов ниже, чем при СБ10+ варианте. В то же время доля пациентов с гомогенной экспрессией СБ45 достоверно выше при СБ10- варианте. Несмотря на то, что при СБ10+ и СБ10- вариантах ВП-ОЛЛ применяются сходные панели антигенов, отдельные маркеры используются в различных целях (см. таблицу) [34].
Описанные различия в экспрессии маркеров приводят к тому, что для СБ10+ и СБ10- вариантов ВП-ОЛЛ при мониторинге МОБ необходимо применять различные алгоритмы анализа данных (рис. 1) [34, 35]. В любом случае поиск МОБ начинается с выделения СБ19+ клеток, среди которых проводится дальнейший анализ. Для СБ10+ ВП-ОЛЛ анализ точечных графиков основывается на определении экспрессии СБ10 и маркеров, по которым можно отличить опухолевые клетки от нормальных ВП (например, СБ45 при СБ45-ВП-ОЛЛ или СБ58) (рис. 2). В случае гетерогенной экспрессии СБ10 необходимо оценивать также экспрессию всех остальных используемых маркеров, прежде всего СБ34. Для СБ10- ВП-ОЛЛ при анализе данных наиболее значимым является определение экспрессии СБ10 и СБ20. При этом из анализа исключаются СБ10+ и СБ20+ клетки. Среди оставшихся СБ19+СБ10СБ20-клеток необходимо отличать МОБ от плазмоцитов и продуктов неспецифического связывания антител.
сч
4
ев
сч
Задачи применения различных антигенов для определения минимальной остаточной болезни при СВ10+ и СВ10- ВП-ОЛЛ
Маркер
СШ0+ ВП-ОЛЛ
СШ0- ВП-ОЛЛ
СБ19 Выделение всех клеток В-линии Выделение всех клеток В-линии
СБ10 Выделение опухолевых клеток Исключение из анализа нормальных ВП
СБ20 Выделение опухолевых клеток, исключение из анализа В-лимфоцитов Исключение из анализа нормальных ВП и В-лимфоцитов
СБ34 Выделение опухолевых клеток Выделение опухолевых клеток
СБ58 Выделение опухолевых клеток Выделение опухолевых клеток
СБ38 Дифференцирование опухолевых клеток от нормальных ВП Дифференцирование опухолевых клеток от прогениторных
СБ45 Выделение опухолевых клеток Выделение опухолевых клеток
Примечание. ВП — В-линейные предшественники; ВП-ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз из ВП.
■
см
ев
Острый лимфобластный лейкоз из В-линейных предшественников
СР10+
Гомогенная экспрессия СР10
I
График С019/ББС
С019+Б$С|0Ш-клетки
Гетерогенная экспрессия СР10
График С019/ББС
С019+Б$С|0Ш-клетки
СР10-
I
График С019/ББС
^ С019+Б$С|0Ш-клетки График С019/С020
С010Ш20-клетки
Оценка экспрессии СР10 и других маркеров на графиках СРЮ/другой маркер результат не получен Оценка экспрессии СР34, СР45, СР20, СР58, СР38
,_ результат получен
Е о
— Обратное гейтирование (график РБС/ББС)
се
^ Рис. 1. Алгоритм анализа данных проточной цитометрии для мониторинга минимальной остаточной болезни при СВ10+ и СВ10- вариантах СМ острого лимфобластного лейкоза из В-линейных предшественников
Рис. 2. Пример расположения остаточных опухолевых клеток на точечных графиках на 15-й день терапии СВ10+ острого лимфобластного лейкоза из В-линейных предшественников. Опухолевые клетки показаны красным цветом, зрелые В-лимфоциты — синим, остальные клетки — черным
Для этого необходимо использовать СБ38, СБ34, СБ45. После выделения опухолевых клеток они должны быть отображены на графике РБС/ББС для исключения из анализа мертвых клеток (рис. 3) [34, 35].
Для успешного определения МОБ нужно также учитывать, что фенотип опухолевых клеток может
существенно меняться во время терапии. Наиболее распространенными тенденциями изменений являются снижение экспрессии СБ10, СБ34 и СБ58, а также повышение экспрессии СБ20, СБ45 и СБ19 [25, 26]. При наличии перестроек гена М1Х изменения иммуно-фенотипа могут быть очень существенными [36, 37].
CV 4
CS
CV 4
-.....
" С1Ш
Рис. 3. Пример последовательного выделения опухолевых клеток при определении минимальной остаточной болезни. Опухолевые клетки показаны красным цветом, зрелые В-лимфоциты — синим
Величина МОБ при определении методом проточной цитометрии рассчитывается как процентное содержание опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток КМ. При этом для идентификации опухолевых клеток используются различные варианты комбинаций антител, а итоговым уровнем МОБ считается максимальное количество, полученное в одной из пробирок. Ядросодержащие клетки в образце могут быть определены 2 разными способами. Возможно выделение региона лейкоцитов на графике РБС/ББС, однако при анализе большого числа клеток обычно достаточно сложно на скатерограмме четко отделить клетки от де-бриса. Рекомендуется применение ДНК-тропного красителя, окрашивание которым позволяет четко отделить ядросодержащие клетки от всех случайно зафиксированных цитометром событий. Чаще всего для этих целей используются красители БУТ016 (канал Б1ТС проточного цитометра) или БУТ041 (канал Рас1АсВ1ие). Предпочтительным является добавление ДНК-тропного красителя прямо в пробирку, в которой проводится определение МОБ. В этом случае выделение СБ19+ клеток производится только среди БУТ0+ (см. рис. 3). Если же такой возможности нет, рекомендуется провести дополнительное окрашивание БУТ0/СВ19/СВ45.
При определении МОБ методом проточной цито-метрии позитивными считаются образцы, в которых на точечных графиках определяется группа из 10 и более клеток, имеющих лейкозассоциированный иммуно-фенотип и значения параметров светорассеяния, соответствующие лимфоцитам/лимфобластам. Макси-
мальная чувствительность метода (анализ 1 000 000 клеток) составляет 0,001 %, т. е. возможно выявить 1 опухолевую клетку среди 100 000 нормальных. В то же время далеко не во всех случаях клеток в образце достаточно для достижения такой чувствительности. Поэтому минимально достаточной рутинной чувствительностью обычно принято считать 0,01 %, для достижения которой необходим анализ 100 000 клеток. Если по тем или иным причинам не удается собрать достаточное количество клеток, а опухолевые клетки не выявляются, исследование считается невозможным.
В заключении, выдаваемом лабораторией по результатам определения МОБ, кроме базовой информации о пациенте должны также указываться название протокола терапии и этап лечения.
Апробация применения выработанных подходов для определения минимальной остаточной болезни в рамках многоцентрового исследования
Результаты участия лабораторий группы «Москва-Берлин» во внешнем контрольном исследовании по определению МОБ, которое проводилось в декабре 2007 г. группой AIEOP-BFM, представлены на рис. 4. Результаты, полученные в каждой из лабораторий, показали очень высокую сопоставимость с референсными значениями.
Рассылка цитометрических данных внутри группы также показала хорошую сходимость результатов, получаемых в разных лабораториях, как на 15-й, так и на 36-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2015 (рис. 5а-в). При этом результаты определения МОБ
сч
CS
0, 001 0, 01 0, 1 1 10 Референсное значение, %
0, 001 0, 01 0, 1 1 10 Референсное значение, %
0, 001 0, 01 0, 1 Референсное
1 10 значение, %
Рис. 4. Результаты участия лабораторий рабочей группы в круговом исследовании, проводившемся группой МЕОР-Б¥Ш (данные предоставлены И.Ы. О^ог7.ак). Результаты определения минимальной остаточной болезни на 15-й день терапии, полученные в каждой лаборатории, сравнивались с референсными значениями, представляющими собой медиану результатов 4 наиболее опытных лабораторий группы А1ЕОР-Б¥М
CV 4
0, 01 0, 1 1 10 Медиана, %
0, 001 0, 01 0, 1 1 10 Медиана, %
0, 001 0, 01 0, 1 1 10 Медиана, %
0, 001 0, 01 0, 1 1 10 Медиана, %
f
0 1 / / 0
% / / % CN 1
оратория 0, 01 0, 1 / / я и р о т а р о 0, 01 0, 1 ■ 9-
\о а1 f \о а 1 01
0 ^ о У 0
0, У 0,
«Г -,-,- -,-
0, 001 0, 01 0, 1 1 Медиана, %
0, 001 0, 01 0, 1 1 Медиана, %
0, 001 0, 01 0, 1 1 Медиана, %
0, 001 0, 01 0, 1 1 10 Медиана, %
б
а
в
г
0, 001
Рис. 5. Результаты участия лабораторий рабочей группы (а—в) в круговом исследовании в рамках протокола ALL—MB 2015. Результаты определения минимальной остаточной болезни (МОБ) на 15-й (верхний ряд) и 36-й (нижний ряд) дни терапии, полученные в каждой лаборатории, сравнивались с референсными значениями, представляющими собой медиану результатов всех 3 лабораторий. В исследовании приняла участие еще 1 лаборатория, в которой также планируется проведение мониторинга МОБ в рамках ALL—MB 2015 (г)
на момент окончания индукционной терапии оказались несколько менее сопоставимыми, поскольку на данном этапе лечения величины МОБ обычно ближе к предельным значениям аналитической чувствительности проточной цитометрии, чем на 15-й день. Данные еще одной лаборатории, в которой также планируется проведение мониторинга МОБ в рамках протокола ALL-MB 2015, не отличались существенно от результатов, полученных в референсных лабораториях протокола ALL-MB 2008 (рис. 5г).
Распределение пациентов, у которых МОБ определялась в референсных лабораториях, по количеству
остаточных опухолевых клеток представлено на рис. 6. Существенных различий также не обнаружено, хотя, как и ожидалось, одинаковых результатов получено не было.
Обсуждение
Несмотря на то, что проточная цитометрия относительно давно признается одним из основных методов мониторинга МОБ при ОЛЛ у детей, попытки стандартизации ее применения немногочисленны. Отсутствие должного уровня стандартизации является одним из основных недостатков данной технологии
День 15-й
День 36-й
100
90
80
70
% 60
Z 1- н 50
е
^ 40
го
С
30
20
10
0
го С
100 90 -80 70 60 50 40 30 20 10 0
ч
v
ч
□ □
v
МОБ < 0,01 %
0,01 % < МОБ < 0,1 %
ч
v
Ч
ч
□
□
0,1 % < МОБ < 1 %
1 % < МОБ < 10 %
□
МОБ > 10 %
ч
Рис. 6. Распределение по величинам минимальной остаточной болезни (МОБ) результатов, полученных в лабораториях рабочей группы при мониторинге МОБ в исследовании ЛЬЬ-ИБ 2008
по сравнению с ее основным «соперником» — определением пациент-специфических перестроек генов тяжелых цепей иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Однако сложности применения данного варианта ПЦР определяют необходимость разработки стандартизованных протоколов определения МОБ проточной цитометрией в рамках различных терапевтических протоколов. На данный момент такие попытки проводятся группами А1Е0Р-ВРМ [16], иКАЬЬ [17], К0РЫ0 [18]. Кроме того, высокий уровень стандартизации определения МОБ при ОЛЛ предлагает не связанная с определенными терапевтическими протоколами группа ЕигоР1ош [14]. В российских группах по исследованию ОЛЛ применение ПЦР в реальном времени практически невозможно ввиду высокой стоимости и крайней технологической сложности данного метода [7, 8]. Поэтому стандартизация определения МОБ методом проточной цитометрии является крайне необходимой для последующего его применения в рамках многоцентровых исследований, тем более что для результатов, полученных как на 15-й,
так и на 36-й дни терапии по протоколам ALL-MB 2002 и ALL-MB 2008, показано существенное прогностическое значение [38-41]. Нами был разработан и успешно внедрен стандартизованный протокол определения МОБ методом проточной цитометрии при ВП-ОЛЛ на разных этапах терапии. Применение таких подходов позволило достичь очень высокой сопоставимости данных, получаемых в разных лабораториях. Эффективная интеграция в систему рефе-ренсных лабораторий еще одной лаборатории показала высокую воспроизводимость разработанных алгоритмов определения МОБ.
Заключение
Таким образом, разработанные и представленные в данной работе стандартизованные подходы к мониторингу МОБ методом проточной цитометрии во время и по окончании индукционной терапии по протоколам группы «Москва—Берлин» позволят в дальнейшем применять данную диагностическую технологию в системе референсных лабораторий в российско-белорусских многоцентровых исследованиях по терапии ОЛЛ у детей.
CV 4
CS
CV 4
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
CV 4
CS
cv
4
1. Mörike A., Zimmermann M., Reiter A. et al. Long-term results of five consecutive trials in childhood acute lymphoblastic leukemia performed by the ALL-BFM study group from 1981 to 2000. Leukemia 2010;24(2):265-84.
DOI: 10.1038/leu.2009.257. PMID: 20010625.
2. Pui C.H., Pei D., Sandlund D.T. et al. Long-term results of St. Jude Total Therapy Studies 11, 12, 13A, 13B, and 14 for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2010;24(2):371-82.
DOI: 10.1038/leu.2009.252. PMID: 20010620.
3. Pui C.H., Carroll W.L., Meshinchi S., Arceci R.J. Biology, risk stratification, and therapy of pediatric acute leukemias: an update. J Clin Oncol 2011;29(5):551-65. DOI: 10.1200/JC0.2010.30.7405. PMID: 21220611.
4. Pui C.H., Mullighan C.G., Evans W.E., Relling M.V. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood 2012;120(6):1165-74. DOI: 10.1182/blood-2012-05-378943. PMID: 22730540.
5. Moppett J., Burke G.A.A., Steward C.G. et al. The clinical relevance of detection
of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukaemia. J Clin Pathol 2003;56(4):249-53. PMID: 12663634.
6. Campana D. Minimal residual disease
in acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010;2010: 7-12. DOI: 10.1182/asheducation-2010.1.7. PMID: 21239764.
7. Schrappe M. Minimal residual disease: optimal methods, timing, and clinical relevance for an individual patient. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2012;2012:137-42. DOI: 10.1182/asheducation-2012.1.137. PMID: 23233572.
8. Brüggemann M., Schrauder A., Raff T. et al. Standardized MRD quantification in European ALL trials: proceedings
of the Second International Symposium on MRD assessment in Kiel, Germany, 18-20 September 2008. Leukemia 2010;24(3):521-35. DOI: 10.1038/leu.2009.268. PMID: 20033054.
9. Coustan-Smith E., Sancho J., Hancock M.L. et al. Clinical importance
of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000;96(8):2691-6. PMID: 11023499.
10. Dworzak M.N., Froschl G., Printz D. et al. Prognostic significance and modalities of flow cytometric minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002;99(6):1952-8. PMID: 11877265.
11. Coustan-Smith E., Sancho J., Behm F.G. et al. Prognostic importance of measuring
early clearance of leukemic cells by flow cytometry in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Blood 2002;100(1):52-8. DOI: 10.1182/blood-2002-01-0006. PMID: 12070008.
12. Borowitz M.J., Devidas M., Hunger S.P. et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia and its relationship to other prognostic factors: a Children's Oncology Group study. Blood 2008;111(12):5477-85.
DOI: 10.1182/blood-2008-01-132837. PMID: 18388178.
13. Basso G., Veltroni M., Valsecchi M.G. et al. Risk of relapse of childhood acute lymphoblastic leukemia is predicted by flow cytometric measurement of residual disease on day 15 bone marrow. J Clin Oncol 2009;27(31):5168-74.
DOI: 10.1200/JC0.2008.20.8934. PMID: 19805690.
14. van Dongen J.J.M.,
van der Velden V.J.H., Brüggemann M., Orfao A. Minimal residual disease diagnostics in acute lymphoblastic leukemia: need for sensitive, fast, and standardized technologies. Blood 2015;125(26):3996-4009. DOI: 10.1182/blood-2015-03-580027. PMID: 25999452.
15. van der Velden V.J.H., Panzer-Grümayer E.R., Cazzaniga G. et al. Optimization of PCR-based minimal residual disease diagnostics for childhood acute lymphoblastic leukemia in a multi-center setting. Leukemia 2007;21(4):706-13.
DOI: 10.1038/sj.leu.2404535. PMID: 17287857.
16. Dworzak M.N., Gaipa G., Ratei R. et al. Standardization of flow cytometric minimal residual disease evaluation in acute lymphoblastic leukemia: multicentric assessment is feasible. Cytometry
B Clin Cytom 2008;74(6):331-40. DOI: 10.1002/cyto.b.20430. PMID: 18548617.
17. Irwing J., Jesson J., Virgo P. et al. Establishment and validation of a standard protocol for the detection of minimal residual disease in B lineage childhood acute lymphoblastic leukemia by flow cytometry
in a multi-center setting. Haematologica 2009;94(6):870-4.
DOI: 10.3324/haematol.2008.000414. PMID: 19377076.
18. Bjorklund E., Matinlauri I., Tierens A. et al. Quality control of flow cytometry data analysis for evaluation of minimal residual disease in bone marrow from acute leukemia patients during treatment. J Pediatr Hematol Oncol 2009;31(6):406-15.
DOI: 10.1097/MPH.0b013e3181a1c0e8. PMID: 19648789.
19. Румянцева Ю.В., Карачунский А.И., Румянцев А. Г. Оптимизация терапии острого лимфобластного лейкоза у детей
в России. Педиатрия 2009;(4):19-27. [Rumyantseva Yu.V., Karachunskiy A.I., Rumyantsev A.G. Optimizing of childhood acute lymphoblastic leukemia treatment in Russia. Pediatriya = Pediatrics 2009;(4):19-27. (In Russ.)].
20. Румянцева Ю.В., Карачунский А. И., Алейникова О.В. и др. Эффективность протокола ALL-MB-2002 у детей с острым лимфобластным лейкозом. Терапевтический архив 2010;(7):11—20. [Rumyantseva Yu.V., Karachunskiy A.I., Aleynikova O.V. et al. The efficacy
of ALL-MB-2002 treatment protocol in children with acute lymphoblastic leukemia. Tera-pevticheskiy arkhiv = Therapeutic Archives 2010;(7):11-20. (In Russ.)].
21. Литвинов Д.В., Карелин А.Ф., Романова К.И. и др. Лечение острого лимфобластного лейкоза у детей: современные возможности и нерешенные проблемы. Доктор. Ру 2015;(10):30-7.
[Litvinov D.V., Karelin A.F., Romanova K.I. et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia treatment: current options and unresolved problems. Doctor.Ru 2015;(10):30-7. (In Russ.)].
22. Fechina L., Shorikov E., Tsaur G. et al. Contribution of all-trans retinoic acid to improved early relapse-free outcome in infant acute lymphoblastic leukemia comparing
to the chemotherapy alone. Blood 2007;110(11):832А. Abstr 2828.
23. Попов А.М., Вержбицкая Т. Ю.,
Цаур Г. А. и др. Аберрации иммунофеноти-па, применимые для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при CDW-пози-тивном остром лимфобластном лейкозе из В-линейных предшественников. Иммунология 2010;(6):299-304. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Immu-nophenotype aberrations useful for minimal residual disease monitoring by flow cytometry in CD10-positive B-predecessors acute lymphoblastic leukemia. Immunologiya = Immunology 2010;(6):299-304. (In Russ.)].
24. Мовчан Л. В. Лейкоз-ассоциирован-ный иммунофенотип опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом из предшественников В-лимфоцитов. Онкогематология 2012;(1):22-8. [Movchan L.V. Leukemia-associated immu-nophenotype in children with B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Onkogema-tologiya = Oncohematology 2012;(1):22-8. (In Russ.)].
25. Попов А.М., Вержбицкая Т. Ю., Цаур Г. А. и др. Изменения иммунофено-типа опухолевых бластов при CD10-пози-тивном остром лимфобластном лейкозе
у детей к 15-му дню индукционной терапии по протоколу ALL-MB-2008. Иммунология 2010;(2):60-4. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Changes
in tumor immunophenotype by day 15 of induction therapy according ALL-MB-2008 protocol in children with CD10-positive acute lymphoblastic leukemia. Immunologiya = Immunology 2010;(2):60-4. (In Russ.)].
26. Мовчан Л.В., Шман Т. В., Белевцев М.В. и др. Изменение иммунофенотипа лейке-мических клеток на этапах индукционной терапии острого лимфобластного лейкоза из предшественников В-лимфоцитов
у детей. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2011;(1):21—6. [Movchan L.V., Shman T.V., Belevtsev M.V. et al. Changing of leukemic cells immunophenotype during induction therapy in children with B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Voprosy gematolo-gii/onkologii i immunopatologii v pediatrii = Hematology/Oncology and Immunopathol-ogy in Pediatrics 2011;(1):21-6. (In Russ.)].
27. Karachunskiy A., Herold R., von Stackelberg A. et al. Results of the first randomized multicentre trial on childhood acute lymphoblastic leukaemia in Russia. Leukemia 2008;22(6):1144-53.
DOI: 10.1038/leu.2008.63. PMID: 18368070.
28. McKenna R. W., Washington L.T., Aquino D.B. et al. Immunophenotypic analysis of hematogones(B-lymphocyte precursors) in 662 consecutive bone marrow specimens by 4-color flow cytometry. Blood 2001;98(8):2498-507. PMID: 11588048.
29. van Lochem E.G., van der Velden V.H., Wind H.K. et al. Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: reference patterns for age-related changes and disease-induced shifts. Cytometry B Clin Cytom 2004;60(1): 1-13. DOI: 10.1002/cyto.b.20008. PMID: 15221864.
30. S^dek L., Bulsa J., Sonsala A. et al. The immunophenotypes of blast cells in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia: how different are they from their normal counterparts? Cytometry B Clin Cytom 2014;86(5):329-39.
DOI: 10.1002/cyto.b.21176. PMID: 24845957.
31. Попов А.М., Вержбицкая Т. Ю., Фечина Л. Г. и др. Острые лейкозы: различия иммунофенотипа бластных клеток
и их неопухолевых аналогов в костном мозге. Клиническая онкогематология 2016;(3):302-13. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Fechina L.G. et al. Acute leukemia: differences in immunophenotype of blast cells and their non-neoplastic counterparts in the bone marrow. Klinicheskaya onkogematologiya = Clinical Oncohemato-logy 2016;(3):302-13. (In Russ.)].
32. Coustan-Smith E., Ribeiro R.C., Stow P. et al. A simplified flow cytometric assay identifies children with acute lymphoblastic leukemia who have a superior clinical out-
come. Blood 2006;108(1):97-102. DOI: 10.1182/blood-2006-01-0066. PMID: 16537802.
33. Попов А.М., Вержбицкая Т. Ю., Цаур Г. А. и др. Ограниченная возможность применения упрощенного подхода для определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитоме-трии у детей с острым лимфобластным лейкозом из B-линейных предшественников. Клиническая лабораторная диагностика 2011;(3):25-9. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Limited possibility of simplified approach to minimal residual disease detection by flow cytometry in children with B-predecessors acute lym-phoblastic leukemia. Klinicheskaya laborator-naya diagnostika = Clinical Laboratory Diagnostics 2011;(3):25-9. (In Russ.)].
34. Попов А.М., Вержбицкая Т. Ю.,
Цаур Г. А. и др. Алгоритм применения проточной цитометрии для мониторинга минимальной остаточной болезни при CD10-негативном остром лимфо-бластном лейкозе из B-линейных предшественников. Вопросы диагностики в педиатрии 2012;(5):31-5. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Algorithm of minimal residual disease monitoring by flow cytometry in CD10-negative B-pre-cursors acute lymphoblastic leukemia. Vo-prosy diagnostiki v pediatrii = Diagnostics in Pediatrics 2012;(5):31-5. (In Russ.)].
35. Цаур Г. А., Попов А.М., Фечина Л.Г., Румянцев С. А. Методические основы диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни при острых лейкозах у детей первого года жизни. Онкогематология 2016;(1):62-74. [Tsaur G.A.,
Popov A.M., Fechina L.G., Rumyantsev S.A. Methodological aspects of diagnostics and minimal residual disease monitoring in infant acute leukemias. Onkogematologiya = Oncohematology 2016;(1):62-74. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-1-62-74.
36. Попов А.М., Цаур Г. А., Вержбицкая Т. Ю. и др. Особенности мониторинга минимальной остаточной болезни при В-линейных острых лимфоб-ластных лейкозах методом проточной цитометрии у детей первого года жизни. Детская онкология 2008;(2):32-5. [Popov A.M., Tsaur G.A., Verzhbitskaya T.Yu. et al. Monitoring of minimal residual disease by flow cytometry in infants with B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Detskaya onkologiya = Pediatric Oncology 2008;(2):32-5. (In Russ.)].
37. Попов А.М., Вержбицкая Т. Ю., Цаур Г. А. и др. Возможности применения NG2 для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цито-метрии у детей 1-го года жизни, больных острым лимфобластным лейкозом, ассо-
циированным с реаранжировками гена MLL. Гематология и трансфузиология 2009;(6):19-22. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Use of NG2 for minimum residual disease monitoring by flow cytometry in infants with MLL rearranged acute lymphoblastic leukemia. Gematologiya i transfuziologiya = Hematology and Transfusiology 2009;(6):19-22. (In Russ.)].
38. Савва Н.Н., Красько О.В., Белевцев М.В. и др. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни для безрецидивной выживаемости детей с острым лимфобластным лейкозом на протоколе ОЛЛ-МБ-2002 (однофакторный и многофакторный анализ). Онкогематология 2009;(2):17-21. [Savva N.N., Kras'ko O. V., Belevtsev M.V. et al. The prognostic value
of minimal residual disease for relapse-free survival in children with acute lymphoblastic leukemia treating according to ALL-MB-2002 protocol (univariate and multivariate analysis). Onkogematologiya = Oncohematology 2009;(2):17-21. (In Russ.)].
39. Meleshko A.N., Savva N.N., Fedasenka U.U. et al. Prognostic value of MRD-dynamics in childhood acute lymphoblastic leukemia treated according to the MB-2002/2008 protocols.
Leuk Res 2011;35(10):1312-20. DOI: 10.1016/j.leukres.2011.04.013. PMID: 21596436.
40. Мигаль Н.В., Белевцев М.В., Мовчан Л.В. и др. Прогностическое значение минимальной резидуальной болезни у детей с В-линейным острым лимфоб-ластным лейкозом. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2015;(1):50-7.
[Migal' N.V., Belevtsev M.V., Movchan L.V. et al. The prognostic value of minimal residual disease in children with B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Voprosy gematolo-gii/onkologii i immunopatologii v pediatrii = Hematology/Oncology and Immunopathology in Pediatrics 2015;(1):50-7. (In Russ.)].
41. Попов А.М., Цаур Г. А., Вержбицкая Т. Ю. и др. Применение проточной цитометрии для определения минимальной остаточной болезни у детей
с острым лимфобластным лейкозом, получающих терапию по протоколам со сниженной интенсивностью. Онкогематоло-гия 2015;10(4):44-55. [Popov A.M., Tsaur G.A., Verzhbitskaya T.Yu. et al. Flow cytometric minimal residual disease monitoring in children with acute lympho-blastic leukemia treated by regimens with reduced intensity. Onkogematologiya = Oncohematology 2015;10(4):44-55. (In Russ.)].
DOI: 10.17650/1818-8346-2015-10-4-44-55.
cv
4
ев
cv
