CC BY
86
Значение определения химерного транскрипта Е1У6-ниыХ1 методом полимеразной цепной реакции у детей с острым лимфобластным лейкозом из B-линейных предшественников с наличием транслокации t(12;21)(p13;q22)
CV 4
CS
4
Г.А. Цаур1-4, Т.О. Ригер1, 2, А.М. Попов5, Т.Ю. Вержбицкая1, 2, Л.В. Вахонина1, 2, А.А. Власова1, Ю.В. Ольшанская5, А.Н. Казакова5, О.В. Стренева1, 2, О.В. Макарова1, С.В. Цвиренко1, 4,
Л.И. Савельев1, 2, 4, О.Р. Аракаев1, 2, Л.Г. Фечина1, 2 ®
1ГБУЗ Свердловской области «Областная детская клиническая больница № 1»; Россия, 620149 Екатеринбург, ул. Серафимы Дерябиной, 32; 2ГАУЗ Свердловской области «Центр специализированных видов медицинской помощи «Институт медицинских клеточных
технологий»»; Россия, 620026 Екатеринбург, ул. Карла Маркса, 22, корп. А; -
ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН»;
Россия, 620049 Екатеринбург, ул. Первомайская, 106; s
ФГБОУВО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, °
Россия, 620030 Екатеринбург, ул. Репина, 3; 5ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии ^
им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Саморы Машела, 1
Контакты: Григорий Анатольевич Цаур tsaur@mail.ru
Введение. Транслокация t(12;21)(p13;q22) является одной из самых частых структурных генетических аномалий, выявляемых у детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). Ее невозможно обнаружить при стандартном цитогенетическом исследовании, поэтому для ее диагностики используют обратно-транскриптазную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или флуоресцентную гибридизацию in situ.
Целью исследования являлась оценка прогностического значения качественного и количественного определения химерного транскрипта ETV6-RUNX1 на разных этапах терапии у детей с ОЛЛ из B-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ). Материалы и методы. У 34 из 166 (20,5 %) обследованных пациентов химерный транскрипт ETV6-RUNX1 был выявлен методами обратно-транскриптазной и количественной ПЦР в режиме реального времени. Качественное выявление ETV6-RUNX1 на 36-й и 85-й дни терапии приводило к статистически достоверно более низким показателям выживаемости, в то время как результаты качественного определения ETV6-RUNX1 на 15-й день лечения не позволили разделить пациентов на прогностически различные группы. Методом анализа характеристических кривых (ROC-анализа, receiver operator characteristic) были получены пороговые уровни (ПУ) отношения ETV6-RUNX1/ABL1, которые с наибольшей эффективностью позволяют разделять пациентов с разными исходами терапии.
Результаты. Практически применимые ПУ (приближенные к 10-кратной шкале) составили 500,0; 1,0; 0,1 и 0,01 % для 0,15, 36 и 85-го дней соответственно. Бессобытийная выживаемость и кумулятивная частота развития рецидива для пациентов со значениями, равными или превышающими ПУ, были достоверно хуже. Кроме того, отношение ETV6-RUNX1/ABL1 >500,0 % на момент диагностики сопровождалось замедленным клиренсом бластных клеток. Также была показана хорошая качественная (84,8 %) и количественная (R2 = 0,953) сопоставимость результатов выявления минимальной остаточной болезни при исследовании методами проточной цитометрии и ПЦР в режиме реального времени с определением величины ETV6-RUNX1/ABL1. Прогностически значимые уровни минимальной остаточной болезни для 2 методов на 15, 36 и 85-й дни оказались идентичными. Заключение. Нами показано, что качественное и количественное определение химерного транскрипта ETV6-RUNX1 методом ПЦР на разных этапах терапии ВП-ОЛЛ имеет важное прогностическое значение. На основании этого нами предложены подходы к стандартизации количественного определения ETV6-RUNX1/ABL1 в рамках многоцентровой кооперативной клинической группы «Москва — Берлин».
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, дети, минимальная остаточная болезнь, транслокация t(12;21)(p13;q22), химерный транскрипт ETV6-RUNX1
DOI: 10.17650/1818-8346-2017-12-4-57-70
Significance of ETV6-RUNX1 fusion gene transcript detection in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia with translocation t(12;21)(p13;q22)
G.A. Tsaur1-4, T.O. Riger1,2, A.M. Popov5, T. Yu. Verzhbitskaya1,2, L. V. Vakhonina1,2, A.A. Vlasova1, Yu. V. Olshanskaya5, A.N. Kazakova5, O. V. Streneva1,2, O. V. Makarova1, S. V. Tsvirenko1,4, L.I. Saveliev1,24, O.R. Arakaev1,2, L.G. Fechina1,2
1Sverdlovsk Regional Children's Hospital No 1; 32 Serafimy Deryabinoy St., Ekaterinburg 620149, Russia;
сч
4
CS
CV 4
2Center for Specialized Types of Medical Care "Institute of Medical Cell Technologies "; 22A Karla Marksa St., Ekaterinburg 620026, Russia; 3Institute of Immunology and Physiology of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; 106 Pervomayskaya St.,
Ekaterinburg 620049, Russia; 4Ural State Medical University, Ministry of Health of Russia; 3 Repina St., Ekaterinburg 620030, Russia; 5Dmitriy Rogachev National Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; 1 Samory Mashela Sr., Moscow 117997, Russia
Introduction. Translocation t(12;21)(p13;q22) is one of the most common structural genetic abnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). It cannot be detected by conventional G-banding, so a reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or fluorescent in situ hybridization are used for this purpose.
The aim of the study was to evaluate the prognostic significance of qualitative and quantitative detection of ETV6-RUNX1 fusion gene transcript at various time points in childhood B-cellprecursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL) patients.
Materials and methods. ETV6-RUNX1 fusion gene transcript was revealed by both reverse-transcriptase PCR and quantitative real-time PCR (RQ-PCR) in 34 out of 166 (20.5%) children with BCP-ALL. Qualitative ETV6-RUNX1-positivity at days 36 and 85 led to unfavorable outcome (lower event-free survival —EFS and higher cumulative incidence of relapse — CIR). While ETV6-RUNX1 status at day 15 did not allow to divide patients with different outcomes. By ROC curve analysis we determined threshold levels (TL) for ETV6-RUNX1/ABL1 ratio at days 0, 15, 36 and 85. Afterwards we adjusted obtained results to 10-fold scale.
Results. So practically applicable TL were as follows 500.0 %, 1 %, 0.1 % u 0.01 % for days 0, 15, 36 and 85, respectively. EFS and CIR were both worse in patients with ETV6-RUNX1/ABL1 ratio equal or above defined TL. Moreover, initial ratio >500,0 % corresponded to delayed blast clearance at days 15 and 36. We showed good qualitative (84.8 %) and quantitative (R2 = 0.953) concordance between ETV6-RUNX1/ABL1 ratio and MRD data obtained by flow cytometry at days 15, 36, 85. Of note, defined TL for ETV6-RUNX1/ABL1 at days 15, 36, 85 were equal to prognostically important levels for flow cytometry MRD.
Conclusion. Thus, qualitative detection and quantitative value of ETV6-RUNX1 fusion gene transcript showed prognostic significance in the course of treatment in children with BCP-ALL. Based on these results we propose standardization approaches for Moscow — Berlin ALL study group.
Key words: acute lymphoblastic leukemia, children, minimal residual disease, translocation t(12;21)(p13;q22), ETV6-RUNX1 fusion gene transcript
Введение
Транслокация t(12;21)(p13;q22), ведущая к образованию химерного гена ETV6-RUNX1 (ранее известного как TEL-AML1) [1—3], является одной из самых частых структурных генетических аномалий, выявляемых у детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) [4—6]. Данная транслокация не может быть обнаружена при стандартном цитогенетическом исследовании, поэтому для этих целей используется обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) [3, 7, 8] или флуоресцентная гибридизация in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH) [9]. Считается, что при проведении современной интенсивной полихимиотерапии прогноз пациентов с t(12;21)(p13;q22) благоприятный [5, 6, 10-13]. По мнению ряда авторов, улучшение результатов терапии стало возможным также благодаря стратификации пациентов на основании результатов определения минимальной остаточной болезни (МОБ) [12, 14]. Чаще всего для этих целей используют данные, полученные в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с выявлением индивидуальных перестроек генов Ig и/или TCR [15] или при проведении многоцветной проточной цито-метрии [12, 16]. При этом имеются только единичные работы, в которых оценивалось прогностическое значение определения химерного транскрипта ETV6-RUNX1, выявляемого методом ПЦР-РВ на разных этапах лечения, включая инициальную диагностику [17]
и контроль МОБ [13, 18—23], что и послужило целью публикации данного исследования. В то же время представленные в нашей работе данные являются лишь частью проспективного многоцентрового исследования А^-МВ-2008 [24], поэтому относиться к полученным результатам надо с определенной долей осторожности.
Цель исследования — оценить значение качественного и количественного определения химерного транскрипта ETV6-RUNX1 на разных этапах терапии у детей с ОЛЛ из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ), получающих лечение по протоколу А^-МВ-2008.
Материалы и методы
В данное моноцентровое исследование были включены 166 пациентов с ВП-ОЛЛ, получавших терапию по протоколу ALL-MB-2008 в отделении детской онкологии и гематологии Областной детской клинической больницы № 1 (Екатеринбург) с апреля 2008 г. по октябрь 2014 г. В группе исследования было 78 (46,2 %) девочек и 91 (53,8 %) мальчик в возрасте от 1,3 года до 16 лет (медиана возраста 3,15 года). Медиана времени наблюдения составила 5,2 года. Исходя из критериев стратификации протокола А^-МВ-2008 [24] в группу стандартного риска были включены
76 (45,7 %) больных, в группу промежуточного риска —
77 (46,4 %), в группу высокого риска — 13 (7,8 %).
Диагноз ОЛЛ устанавливали на основании стандартных морфологических показателей [25] и данных
иммунофенотипирования согласно критериям классификации Европейской группы по иммунологической характеристике лейкозов (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias, EGIL) [26, 27]. При цитогенетическом исследовании применяли краткосрочное культивирование клеток в течение 24 ч. Дифференциальную окраску хромосом на G-по-лосы проводили красителем Гимза после предварительной обработки препаратов трипсином. В большинстве случаев анализировали не менее 11 метафазных пластинок. Анализ хромосом выполняли в соответствии с международной номенклатурой хромосом человека, принятой на момент выполнения стандартного цито-генетического исследования [28—30]. В ходе данной работы все кариотипы были повторно оценены с учетом рекомендаций International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN 2016) [31]. У 3 (1,8 %) детей с ОЛЛ диагностирована болезнь Дауна. 22 пациентам дополнительно проведено исследование методом флуоресцентной гибридизации in situ с использованием зондов Vysis LSI ETV6(TEL)/RUNX1 (AML1) ES Dual Color Translocation Probe (Abbott Molecular, США) (n = 10) и XL t(12;21) ETV6/RUNX1 (Metasystems, Германия) (n = 12).
Наличие МОБ определяли методом проточной цитометрии по методике, описанной ранее [16, 32—34], с выделением групп риска на основании данных оценки на 15, 36 и 85-й дни (а для группы высокого риска — после 1-го блока интенсификации) [16]. Оценка МОБ на 15-й день выполнена 163 пациентам, на 36-й день — 166, а на 85-й день — 161.
При определении химерного транскрипта ETV6-RUNX1 лейкоциты и бластные клетки выделяли из костного мозга путем лизиса в 0,84 % растворе хлорида аммония, после чего проводили подсчет ядросодержа-щих клеток на гематологическом анализаторе KX-21 (Sysmex, Япония). В работу брали 5 х 106 ядросодер-жащих клеток. Для выделения РНК использовали TRIreagent (Molecular Research Center, США) в количестве 1,0 мл согласно инструкции производителя. Полученную РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fischer Scientific, Латвия) согласно инструкции производителя. Качество выделенной РНК исследовали с использованием микроструйных чипов RNA 6000 Nano LabChip (Caliper Technologies, США) на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent, Германия). В дальнейшую работу брались образцы с показателем целостности РНК более 4,2, который достаточен для получения достоверных результатов в ходе ПЦР [35]. Концентрацию полученной РНК определяли спектрофотометри-чески, после чего 1 мкг РНК переводили в комплементарную ДНК в ходе реакции обратной транскрипции, которая проходила при 37 °С в течение 60 мин с использованием реактива MML—V обратной транскрип-тазы (Promega, Германия) и смеси случайных нонаме-ров (ДНК-синтез, Россия). Гнездную ОТ-ПЦР проводили в объеме 20 мкл в 2 этапа. На 1-м этапе
гнездной ОТ-ПЦР брали комплементарную ДНК в количестве, эквивалентном 100 нг РНК, на 2-м этапе в ПЦР-смесь вносили 1 мкл ПЦР-продукта, полученного на 1-м этапе. Для проведения ПЦР использовали реагент «ДиаТак-полимераза» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора) и ампли-фикатор «GeneAmp PCR system 9700 Gold» (Applied Biosystems, Сингапур). Конечная концентрация ионов магния в ПЦР-реакции составляла 3 ммоль/л. Температурные условия ПЦР и нуклеотидные последовательности праймеров для выявления химерного транскрипта ETV6-RUNX1 в ходе гнездной ПЦР были взяты из работы J. Harbott и соавт. [36]. Детекцию проводили методом горизонтального электрофореза в 2 % агароз-ном геле. Верификацию выявленных ПЦР-продуктов выполняли с помощью прямого секвенирования на генетическом анализаторе «ABI Prism 3130» (Applied Biosystems, Япония) с использованием набора «BigDye Terminator 3.1» (Applied Biosystems, США) и праймеров из 2-го этапа гнездной ОТ-ПЦР. Чувствительность гнездной ОТ-ПЦР, которую оценивали методом лимитирующих разведений клеточной культуры REH, составила 5 х 10-5. Для исключения ложно-негативных результатов во всех образцах определялось наличие ПЦР-фрагмента транскрипта нормального гена ABL1 в ходе ОТ-ПЦР, идентичной гнездной ОТ-ПЦР на 1-м этапе.
Пациенты, у которых в ходе гнездной ОТ-ПЦР в момент установления диагноза был выявлен химерный транскрипт ETV6-RUNX1, обследованы также методом ПЦР-РВ согласно рекомендациям международного проекта «Европа против рака» [37, 38]. Нуклеотидная последовательность праймеров, флуоресцентных зондов и температурные условия ПЦР-РВ приведены в табл. 1. Чувствительность ПЦР-РВ составила 1 х 10-4. В качестве позитивного контроля применяли клеточную культуру REH, калибровочных стандартов — плаз-миды, несущие фрагменты транскриптов ETV6-RUNX1 и ABL1 (оба Qiagen, Франция). Для анализа брались образцы, в которых экспрессия нормального гена ABL1 превышала 10 тыс. копий [39]. Для количественной оценки величины МОБ на основании данных, полученных в ходе ПЦР-РВ, использовалось отношение количества копий химерного транскрипта ETV6-RUNX1 и нормального транскрипта ABL1 в процентах в конкретной точке наблюдения (ТН), включая момент установления диагноза.
Образцы костного мозга были исследованы в момент установления диагноза, а также в ТН, предусмотренных протоколом терапии для оценки морфологического статуса костного мозга: ТН1 — 15-й день индукционной терапии, ТН2 — 36-й день индукционной терапии, ТН3 — 85-й день для пациентов стандартной или промежуточной групп риска или после первого блока интенсификации для пациентов группы высокого риска. При мониторинге МОБ во избежание случайной ошибки все образцы во всех ТН тестировались
CV 4
CS
CV 4
Таблица 1. Праймеры, флуоресцентные зонды и условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления и количественного определения химерного транскриптаETV6-RUNX1
Table 1. Primers, fluorescent probes and PCR conditions for qualitative and quantitative detection of ETV6-RUNX1 fusion gene transcripts
ТИп ПЦР Исследуемый транскрипт Прямой праймер Обpатный npnhMep Флуоресцентный зонд
Type of PCR Detected fusion gene transcript Forward primer Reverse primer Fluorescent probe
Гнездная обратно-транскриптазная ПЦР: Nested reverse-transcriptase PCR: 1-й этап 1st phase agccccatcatgcaccctctgatcc gtggtcggccagcacctccacc -
ETV6-RUNX1 94 °С - 2 мин, 35 циклов: 94 °С 15 с - 64 °С 45 с - 72 °С 45 с, 72 °С - 6 мин 94 °С - 2 min, 35 cycles: 94 °С 15 sec - 64°С 45 sec - 72 °С 45 sec, 72 °С - 6 min
2-й этап gcagaattccactccgtggatttcaa acagtcc aacgcctcgctcatcttgcctgggctc -
2nd phase 94 °С - 2 мин, 25 циклов: 94 °С 15 с - 60 °С 45 с - 72 °С 45 с, 72 °С - 6 мин 94 °С - 2 min, 25 cycles: 94 °С 15 sec - 60 °С 45 sec - 72 °С 45 sec, 72 °С - 6 min
Одностадийная ПЦР One-step PCR cggccagtagcatctgactttg ccttggccatttttggtttgg -
ABL1 94 °С - 2 мин, 35 циклов: 94 °С 15 с - 64 °С 45 с - 72 °С 45 с, 72 °С - 6 мин 94 °С - 2 min, 35 cycles: 94 °С 15 sec - 64 °С 45 sec - 72 °С 45 sec, 72 °С - 6 min
ETV6-RUNX1 ctctgtctccccgcctgaa cggctcgtgctggcat HEX-tcccaatgggcatg gcgtgc-BHQ1
ПЦР в режиме реального времени Real-time PCR ABL1 agctccgggtcttaggctat tagttgcttgggacccagcc FAM-ccatttttg gtttgggcttcacaccatt-BHQ1
95 °С - 15 мин, 50 циклов: 95 °С 15 с - 60 °С 60 с 95 °С - 15 min, 50 cycles: 95 °С 15 sec - 60 °С 60 sec
cv
4
CS
cv
4
I
2 методами - гнездной ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ. МОБ-негативными считали образцы, в которых химерный транскрипт не был обнаружен в ходе как ОТ-ПЦР, так и ПЦР-РВ.
Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение XLSTAT 2016. При сравнении по качественным признакам использовали критерий х2 с поправкой Йейтса, а при сопоставлении по количественным признакам - критерий Манна-Уитни. Для выявления пороговых уровней (ПУ) отношения ETV6-RUNX1/ABL1, которые с наибольшей диагностической эффективностью позволяют разделять образцы пациентов с различными исходами терапии, был использован метод характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых) [40, 41]. Для удобства практического применения полученные ПУ приводили к ближайшим значениям, кратным 10 %. Результаты терапии оценивали по кривым бессобытийной выживаемости (БСВ), построенным по методу Каплана-Майера [42]. При расчете БСВ под событиями понимали рецидив, смерть вследствие любой причины как первое событие, выход из-под наблюдения, развитие вторичной опухоли. Стандартную ошибку рассчитывали по формуле Гринвуда. Также оценивали кумулятивную частоту развития рецидива (КЧР) [43]. Для сравнения кривых использовали непараметрические критерии: для БСВ — log-rank (логарифмический ранговый тест), для КЧР — Грея. Все различия считали статистически значимыми при р <0,05.
Результаты
Химерный транскрипт ETV6-RUNX1 выявлен у 34 (20,5 %) из 166 обследованных пациентов с ВП-ОЛЛ при проведении гнездной ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ во время установления диагноза. Несмотря на разницу в чувствительности гнездной ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ (5 х 10-5 и 1 х 10-4 соответственно), нами не выявлено дискор-дантных результатов между этими методами ни в момент установления диагноза, ни при мониторинге МОБ. При сравнении инициальных характеристик пациентов и показателей ответа на терапию на 8, 15 и 36-й дни терапии не зафиксировано статистически достоверной разницы между пациентами с наличием ^12;21)(р13^22)/ Е1У6^1Ш1 и без нее (табл. 2).
В ТН1 (на 15-й день терапии) из 33 обследованных 9 (27,3 %) пациентов с наличием химерного транскрипта ETV6-RUNX1 достигли МОБ-негативности. К окончанию индукционной терапии (в ТН2 — на 36-й день) уже 22 (64,7 %) из 34 пациентов находились в молекулярной ремиссии. В ТН3 (на 85-й день) доля МОБ-негативных пациентов возросла до 85,3 % (29 из 34 больных). Мы последовательно проанализировали прогностическое значение определения МОБ в качественном формате в 3 последовательных ТН (рис. 1). Результаты определения МОБ в ТН2 и ТН3 приводили к разделению пациентов на группы с различным прогнозом, в то время как качественное выявление химерного транскрипта ETV6-RUNX1 в ТН1 не дало статистически достоверных различий.
Таблица 2. Инициальные показатели и ответ на терапию пациентов с острым лимфобластным лейкозом из В-линейных предшественников в зависимости от наличия или отсутствия транслокации t(12;21)(p13;q22) /ETV6-RUNX1
Table 2. Initial parameters and treatment response criteria in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia based on presence or absence of translocation t(12;21)(p13;q22) / ETV6-RUNX1
Число больных с транслокацией t(12;21)(p13;q22) / ETV6-RUNX1 и без нее, абс. (%)
Number of patients with translocation t(12;21)(p13;q22) ETV6-RUNX1 and without it, abs. (%)
Медиана возраста, годы (диапазон) Median age, years (range) 3 (2-10) 3 (1,1-16,0) 0,443
Мальчики/девочки Boys/girls 18 (52,9) / 16 (47,1) 71 (53,8) / 61 (46,2) 0,917
Группа риска (по протоколу ALL-MB-2008): Risk group (Protocol ALL-MB-2008): стандартная, n = 76 standard, n = 76 промежуточная, n = 77 intermediate, n = 77 высокая, n = 13 high, n = 13 18 (52,9) 15 (44,1) 1 (2,9) 58 (43,9) 62 (47,0) 12 (9,1) 0,447
Инициальный лейкоцитоз более 30 x 109/л Initial WBC count >30 x 109/l 7 (20,6) 32 (24,2) 0,825
Размер селезенки >4 см ниже реберной дуги Spleen size >4 sm below coastal edge 10 (29,4) 56 (42,4) 0,236
Выявление бластов в ЦНС (ЦНС2- и ЦНС3-статусы)* Detection of blast cells in the CNS (CNS2- and CNS3-status)* 5(14,7) 24 (18,2) 0,824
Более 1000 бластов в 1 мкл периферической крови на 8-й день терапии More than 1000 blast cells in 1 microliter of peripheral blood at day 8 of remission induction 1 (2,9) 5 (3,8) 0,780
М3 статус костного мозга на 15-й день терапии M3 status of bone marrow at day 15 of induction remission 1 (2,9) 13 (9,8) 0,344
Отсутствие ремиссии на 36-й день терапии Not achieved remission at the end of induction (day 36) - 6 (4,5) 0,453
МОБ на 15-й день терапии: Flow-MRD at day 15 of induction remission: <0,1 % 0,1-10 % >10 % 14 (41,1) 15 (44,1) 3 (8,8) 49 (37,4) 63 (48,1) 19 (14,5) 0,707
МОБ на 36-й день терапии: Flow-MRD at day 36 of treatment: <0,1 % >0,1 % 30 (88,2) 4 (11,8) 110 (83,3) 22 (16,7) 0,662
МОБ на 85-й день терапии: Flow-MRD at day 85 of treatment: <0,01 % >0,01 % 31 (91,2) 3 (8,8) 116 (90,6) 12 (9,4) 0,815
*Выявление бластов в спинномозговой жидкости после центрифугирования при клеточности менее 10 кл/мкл (статус ЦНС2) и более 10 кл/мкл (статус ЦНС3) и нетравматичной люмбальной пункции. ЦНС — центральная нервная система. *Identification of blasts cells in the cerebrospinal fluid after centrifugation with cellularity less than 10 cells/^l (CNS2) and more than 10 cells/^l (CNS3) and non-traumatic lumbar puncture. CNS — central nervous system.
cv
4
ев
cv
cv
4
es
cv
4
p (log-rank) = 0,194
p (Грей) = 0,189 / p (Gray's test) = 0.189
г
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
— МОБ-: БСВ 1,00; n = 9; 0 событий / MRD-: EFS 1.00; n = 9; 0 events
— МОБ+: БСВ 0,70 ± 0,16; n = 25; 4 события / MRD+: EFS 0.70 ± 0.16; n = 25; 4 events
1
0,9 0,8 cc 0,7 G 0,6 cl 0,5 S 0,4 0,3 0,2 0,1 0
p (log-rank) = 0,005
p (Грей) = 0,006 / p (Gray's test) = 0.006
Г
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
— МОБ-: КЧР 0,00; n = 9; 0 рецидивов / MRD-: CIR 0.00; n = 9; 0 relapses
— МОБ+: КЧР 0,30 ± 0,17; n = 25; 4 рецидива / MRD+: CIR 0.30 ± 0.17; n = 25; 4 relapses
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
— МОБ-: БСВ 1,00; n = 22, 0 событий / MRD-: EFS 1.00; n = 22; 0 events
— МОБ+: БСВ 0,49 ± 0,21; n = 25; 4 события / MRD+: EFS 0.49 ± 0.21; n = 25; 4 events
1
0,9 0,8 cc 0,7 G 0,6 cl 0,5 S 0,4 0,3 0,2 0,1 0
1
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
p (log-rank) = 0,001
1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
— МОБ-: КЧР 0,00; n = 22, 0 рецидивов / MRD-: CIR 0.00; n = 22; 0 relapses
— МОБ+: КЧР 0,51 ± 0,22, n = 12; 4 рецидива / MRD+: CIR 0.51 ± 0.22; n = 12; 4 relapses
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
— МОБ-: БСВ 0,86 ± 0,13; n = 29; 1 событие / MRD-: EFS 0.86 ± 0.13; n = 29; 1 event
— МОБ+: БСВ 0,40 ± 0,22; n = 5; 3 события / MRD+: EFS 0.40 ± 0.22; n = 5; 3 events
1
0,9 0,8 cc 0,7 G 0,6 Q- 0,5 ЧК 0,4 0,3 0,2 0,1 0
p (Грей) = 0,001 / p (Gray's test) = 0.001
1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
— МОБ-: КЧР 0,14 ± 0,13; n =29; 1 рецидив / MRD-: CIR 0.14 ± 0.13; n = 29; 1 relapse
— МОБ+: КЧР 0,61 ± 0,17; n =5; 3 рецидива / MRD+: CIR 0.61 ± 0.17; n = 5; 3 relapses
Рис. 1. Прогностическое значение качественного определения химерного транскрипта ETV6-RUNX1 у t(12;21)-позитивньа пациентов (n = 34) с острым лимфобластным лейкозом из B-линейных предшественников. Для каждой точки наблюдения (ТН) определены бессобытийная выживаемость (БСВ) и кумулятивная частота развития рецидивов (КЧР): а, б, в — соответственно THt, ТН2, ТН3 на 15, 36, 85-й день лечения. МОБ+ и МОБ- — минимальная остаточная болезнь с позитивным и негативным статусом соответственно
Fig. 1. Prognostic significance of ETV6-RUNX1 qualitative detection in t(12;21)-positive BCP-ALL patients (n = 34). For each time-point (TP) event-free survival (EFS) (upper row) and cumulative incidence of relapse (CIR) (lower row) were calculated: a, б, в, respectively THt, ТН2, ТН3 on the days 15, 36, 85. MRD+ and MRD- — minimal residual disease with positive and negative status respectively
Для выявления ПУ отношения ETV6-RUNX1/ABL1, которые с наибольшей эффективностью позволяют разделять пациентов с разными исходами терапии, был выполнен ROC-анализ для ТН1 — ТН3, а также во время установления диагноза (ТН0). Он проведен 30 пациентам, у которых имелись данные о количестве копий ETV6-RUNX1 и ABL1 в каждой из ТН. Практически применимые ПУ составили 500,0; 1,0; 0,1 и 0,01 % для ТН0, ТН1, ТН2 и ТН3 соответственно (рис. 2). БСВ и КЧР для групп пациентов, выделенных в соответствии с этими ПУ в ТН0 — ТН3, представлены на рис. 3. Для всех 4 ТН результаты оказались высокодостоверными. Инициальная гиперэкспрессия ETV6-RUNX1 (ETV6-RUNX1/ABL1 >500,0 %) сопровождалась замедленным клиренсом бластных клеток: прогностически неблагоприятный уровень МОБ сохраняли 4 пациента из 5 в ТН1, а 3 — в ТН2 и ТН3. У 3 последних пациентов в дальнейшем развились рецидивы. Среди 8 пациентов с высоким уровнем МОБ в ТН1 у 5 определялась МОБ более 0,1 % в ТН2. Все 4 рецидива были зафиксированы именно у этих больных.
Данные ПЦР-РВ, полученные в ТН1 — ТН3, были сопоставлены с результатами определения МОБ методом проточной цитометрии в качественном и количе-
ственном форматах. Общая качественная сопоставимость результатов в 99 образцах составила 84,8 % (рис. 4). При этом она была несколько ниже в ТН2 (76,5 %) по сравнению с ТН1 и ТН3 (83,9 и 94,1 % соответственно). Интересно отметить, что 11 из 15 дискордантных образцов были негативны по данным ПЦР, но слабопозитивны по данным проточной цитометрии; медиана МОБ в этих образцах составляла 0,003 % (диапазон 0,001—0,013 %). К настоящему моменту ни у одного из пациентов, у которых были получены дискордант-ные результаты как в сторону ПЦР-РВ, так и в сторону проточной цитометрии, рецидивов не наблюдалось.
При сравнении количественных результатов определения МОБ разными методами мы попарно сопоставляли процентное соотношение ETV6-RUNX1/ABL1 с процентом опухолевых клеток, выявленным при проведении проточной цитометрии и рассчитанным от общего количества исследованных ядросодержащих клеток в образце. Исследование было проведено в 95 образцах, 40 из которых были негативны по данным обоих методов. Выявлена высокая степень корреляции между количественными данными по определению МОБ методами ПЦР-РВ и проточной цитометрии = 0,953, р <0,0001) (рис. 5). Ранее нами было показано, что при
б
а
в
ТН1 / TP1
ТН2 / TP2
ТН3 / TP3
1
0,9
0,6 -
О 0,5
5 0,4
ш 0,3
Л 0,2
S3 0,1 £ 0 =Г 0
0,1 0,2 1 -
ППК 0,81 / AUC 0.81 ПУ 500,02 / TL 500.02 * p = 0,062
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 специфичность / 1 - specificity
:s 1
й 0,9
§ 0,8
^ 0,7
н 0,6
ос0,5
5 0,4 ш 0,3
Л 0,2 ст0,1 £ 0
^ 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1 - специфичность/ 1 - specificity
IX
ППК 0,94 / AUC 0.94 ПУ 1,05 / TL 1,05 p <0,001
'S 1
й 0,9
§ 0,8
^ 0,7
н 0,6
ос0,5
5 0,4 ш 0,3
Л 0,2 ст0,1 £ 0
1
0,9
ППК 0,98 / AUC 0.98 ПУ 0,18 / TL 0,18 p <0,001
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1 - специфичность/ 1 - specificity
ППК 0,87 / AUC 0.87 ПУ 0,04 / TL 0,04 p <0,005
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1 - специфичность/ 1 - specificity
CV 4
es
Рис. 2. Результаты ROC-анализа. ППК — площадь под кривой (показатель, отражающий достоверность полученного результата), • — оптимальные пороговые уровни (ПУ), позволяющие с наибольшей эффективностью разделять пациентов с разными исходами терапии, ТН — точка наблюдения
Fig. 2. Results of ROC-curve analysis. AUC — area under curve (represent the reliability of the results), • — optimal threshold level (TL), allowing the most effective stratification of patients with different therapy outcomes, TP — time point
ТН0 (ПУ 500 %) /
1
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 С 0,4
m
p (log-rank) = 0,002 i
°0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
1
0,9 0,8 ^ 0,7
Ь 0,6
^ 0,5 8 0,4 m 0,3 0,2 0,1 0
ТН, (ПУ 1 %) / TP, (TL 1%)
p (log-rank) = 0,001
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
■ <ПУ: БСВ 0,67 ± 0,27; n = 25; 1 событие / — <ПУ: БСВ 1,00; n = 23; 0 событий / <TL: EFS 0.67± 0.27; n = 25; 1 event <TL: EFS 100; n = 23; 0 events
■ >ПУ: БСВ 0,40 ± 0,22; n = 5; 3 события / — >ПУ: БСВ 0,30 ± 0,23; n = 8; 4 события /
ТН2 (ПУ 0,1 %) / TP2 (TL 0.1%)
1
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
p (log-rank) <0,001
ТН3 (ПУ 0,01 %) / TP3 (TL 0.01%)
>TL EFS 0.40 ± 0.22; n = 5; 3 events
>TL EFS 0.30 ± 0.23; n = 8; 4 events
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
— <ПУ: БСВ 1,00; n = 28; 0 событий / <TL: EFS 1.00; n = 28; 0 events
— >ПУ: БСВ 0,00; n = 5; 4 события / >TL: EFS 0.00; n = 5; 4 events
1
0,9 0,8 ^ 0,7 iii 0,6 / 0,5 СВ 0,4
Б 0,3 0,2 0,1 0
0 1
p (log-rank) <0,001
2 3 4 5 6 7 8
Время наблюдения, годы / Observation time, years
— <ПУ: БСВ 0,85 ± 0,13; n = 29; 1 событие / <TL: EFS 0.85 ± 0.13; n = 29; 1 event
— >ПУ: БСВ 0,25 ± 0,22; n = 4; 3 события / >TL: EFS 0.25 ± 0.22; n = 4; 3 events
«V
б
а
в
г
ТН1 / TP1
ТН2 / TP2
ТН3/TP3
ТН0 / TPo
б
а
в
г
TP0 (TL 500%)
1
0,9 0,8 СС 0,7 С 0,6
£ 0,5 =г 0,4 * 0,3 0,2 0,1 0
0
p (Грей) = 0,003 / p (Gray's test) = 0.003
1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
1
0,9 0,8 СС 0,7 С 0,6
£ 0,5 =г 0,4 * 0,3 0,2 0,1 0
p (Грей) = 0,001 / p (Gray's test) = 0.001
;
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
1
0,9 0,8 te 0,7
С 0,6
£ 0,5 =г 0,4 * 0,3 0,2 0,1 0
p (Грей) <0,001 / p (Gray's test) <0.001
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
1
0,9 0,8 СС 0,7
С 0,6
£ 0,5 =г 0,4 * 0,3 0,2 0,1 0
p (Грей) <0,001 / p (Gray's test) <0.001
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время наблюдения, годы / Observation time, years
■ <ПУ: КЧР 0,33 ± 0,26, n = 25; 1 рецидив / — <ПУ: КЧР 0,00; n = 23; 0 рецидивов / — <ПУ: КЧР 0,00; n = 28; 0 рецидивов / — <ПУ: КЧР 0,14 ± 0,13; n = 29; 1 рецидив / <TL: CIR 0.33 ± 0.26, n = 25; 1 relapse <TL: CIR 0.00, n = 23; 0 relapses <TL: CIR 0.00, n = 28; 0 relapses <TL: CIR 0.14 ± 0.13, n = 29; 1 relapse
■ >ПУ: КЧР 0,60 ± 0,21, n = 5; 4 рецидива / — >ПУ: КЧР 0,70 ± 0,23; n = 5; 4 рецидива / — >ПУ: КЧР 1,00; n = 5; 4 рецидива / — >ПУ: КЧР 0,75 ± 0,21; n = 4; 4 рецидива / >TL: CIR 0.60 ± 0.21, n = 5; 4 relapses >TL: CIR 0.70 ± 0.23, n = 5; 4 relapses >TL: CIR 1.00, n = 5; 4 relapses >TL: CIR 0.75 ± 0.21, n = 4; 4 relap>es
— ETV6-RUNX1/ASL >ПУ/ETV6-RUNX1/ABL >TL
— ETV6-RUNX1/ABL <ПУ /ETV6-RUNX1/ABL <TL
Рис. 3. Прогностическое значение отношения ETV6-RUNX1/ABL1 с учетом выявленных пороговых уровней (ПУ) для времени установления диагноза (точка наблюдения 0 — ТН0) и 3 последовательных точек наблюдения (THt — ТН3), бессобытийная выживаемость (БСВ) и кумулятивная частота развития рецидивов (КЧР) для каждой ТН: а, б, в, г — соответственно ТН0, ТН1, ТН2, ТН3
Fig. 3. Prognostic significance of ETV6-RUNX1/ABL1 ratio based on identified threshold levels (TL) for diagnosis time (day 0 — TP0) and 3 consecutive time-points (TP1 — TP3); event-free survival (EFS) (upper row) and cumulative incidence of relapse (CIR) (lower row) for each TP: а, б, в, г — ТРд, ТР1, ТР2, ТР3 respectively
Е7У6кЯЦЛХ1-позитивных ОЛЛ для результатов определения МОБ проточной цитометрией в ТН1 и ТН2 прогностически значимыми также являются ПУ в 1,0 и 0,1 %
соответственно [16]. В табл. 3 (см. на с. 22) показано, что оба метода при использовании одинаковых ПУ позволяют выделять в целом одинаковые группы пациентов.
сч
4
CS
о
^ "о
U is
с- ^
за
О
с
0
1 ТЗ ф U
X t! ¡о
ю о
Все образцы (n = 99) / All samples (n = 99)
б
ТН, (n = 31) / TP, (n = 31)
37 4 22 2 11 1 4 1
11 47 3 4 7 15 1 28
Обнаружено / Не обнаружено / Обнаружено / Не обнаружено / Обнаружено / Не обнаружено / Обнаружено / Не обнаружено / Detected Not detected Detected Not detected Detected Not detected Detected Not detected
Проточная цитометрия / Flow cytometry
Сопоставимость 84,8 % / Concordance 84.8%
Сопоставимость 83,9 % / Concordance 83.9%
Сопоставимость 76,5 % / Concordance 76.5%
Сопоставимость 94,1 % / Concordance 94.1%
«V
Рис. 4. Качественное сопоставление выявления ETV6-RUNX1 и минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии в 3 последовательных точках наблюдения (ТН): а — все образцы (n = 99), б — THt на 15-й день лечения, в — ТН2 на 36-й день лечения, г — ТН3 на 85-й день лечения. ОТ-ПЦР — обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
Fig. 4. Qualitative concordance of ETV6-RUNX1 detection andflow-cytometric minimal residual disease in 3 consecutive time-points (TP): а — all samples (n = 99); б — TP j — day 15 of remission induction; в — TP2 — day 36 of remission induction; г — TP3 — day 85 of treatment. RT-PCR — reverse transcriptase polymerase chain reaction
1000
ca
cc
s
T
LU
0,001
0,0001
0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 МОБ по данным проточной цитометрии, % / MRD by flow cytometry, %
1000
а
в
г
ТН2 (n = 34) / TP2 (n = 34)
ТН3 (n = 34) / TP3 (n = 34)
Рис. 5. Количественное сравнение результатов определения минимальной остаточной болезни (МОБ) методом проточной цитометрии и отношения ETV6-RUNX1/ABL1, определенного в ходе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Fig. 5. Quantitative concordance of minimal residual disease (MRD) by multicolor flow cytometry and ETV6-RUNX1/ABL1 ratio revealed by real-time quantitative PCR
Обсуждение
Нами установлено, что инициальная гиперэкспрессия ETV6-RUNX1 предопределяет неблагоприятный прогноз ^12;21)-позитивного ОЛЛ у детей. В работе W. Stams и соавт. также было показано, что
у пациентов с транслокацией ^12;21)(р13^22) высокий уровень экспрессии нормального RUNX1, химерного ETV6-RUNX1 и реципрокного RUNX1-EW6 транс-криптов были ассоциированы с плохим прогнозом. Интересно отметить, что этот эффект не был связан
Таблица 3. Сравнение результатов количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и проточной цитоме-трии для выделения групп пациентов с различным риском развития рецидива на 15-й и 36-й дни индукционной терапии Table 3. Comparison of results of real time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) and flow cytometry for identification patients' groups with various risk of relapse on days 15 and 36 of remission induction
Значение транскрипта при исследовании методом ПЦР-РВ
Transcript value in the RQ-PCR assay
Число больных (количество рецидивов)
Number of patients (number of relapses)
Проточная цитометрия
МОБ <1 % [RD <1.0 %
День 15-
ETV6-RUNX1/ABL1 <1 %
ETV6-RUNX1/ABL1 >1 %
Итого Total
20 (0) 3 (1) 23 (1)
1 (0)
5 (3)
6 (3)
21 (0) 8 (4)
29 (4)
День 36-й Da
ETV6-RUNX1/ABL1 <0,1 % ETV6-RUNX1/ABL1 >0,1 %
Итого Total
МОБ <0,1 % 28 (0) 2 (1) 30 (1)
МОБ >0,1 % 0 (0) 3 (3)
3 (3)
28 (0) 5 (4)
33 (4)
cv
4
CS
cv
4
I
с резистентностью к преднизолону, винкристину и L-аспарагиназе — стандартным препаратам для лечения ОЛЛ [17].
Использование качественной ОТ-ПЦР, обнаруживающей наличие химерного транскрипта ETV6-RUNX1 для оценки МОБ, началось в середине 1990-х годов, почти сразу же после описания методики ПЦР-диаг-ностики данной генетической аберрации [44, 45]. K. Seeger и соавт. не смогли выявить прогностическую роль различной скорости клиренса ETV6-RUNX1 у пациентов с первичным ОЛЛ, получавших терапию по протоколу ALL-BFM-95, в отличие от пациентов с рецидивом ОЛЛ, лечившихся по протоколу ALL-REZ BFM-96 [20]. Также отсутствие взаимосвязи между прогнозом и количеством химерного транскрипта ETV6-RUNX1 на момент окончания индукционной терапии (день 33) по протоколам 58881 и 58951 Европейской организации по изучению и лечению рака (European Organization for Research and Treatment of Cancer, EORTC) было зафиксировано в исследовании S. Drunat и соавт. [19]. Противоположные данные были получены J. Madzo и соавт. на относительно большой группе детей с t (12;21)-позитивным ОЛЛ (n = 57), получавших терапию по протоколу ALL-BFM-95: сохранение МОБ на 33-й день было связано с повышенной вероятностью рецидива ОЛЛ [22]. Схожие результаты были описаны J. Lee и соавт: выявление химерного транскрипта ETV6-RUNX1 по окончании индукции ремис-
сии являлось независимым прогностическим фактором, ведущим к снижению бессобытийной и общей выживаемости [13].
В нашем исследовании качественное выявление химерного транскрипта ETV6-RUNX1 имело прогностическое значение только при определении на 36-й и 85-й дни терапии, но не на 15-й день. В то же время 9 МОБ-негативных в ТН1 пациентов безусловно представляют собой группу с наилучшим ответом на терапию и являются возможными кандидатами на снижение интенсивности или продолжительности лечения в будущем. ТН2 и ТН3 оказались более предпочтительными для выявления пациентов с высоким риском развития рецидива с помощью качественной ОТ-ПЦР. Тем не менее более точные результаты были получены при исследовании МОБ методом количественной ПЦР-РВ. Определенные с помощью ROC-анализа ПУ позволили очень точно выделить группы пациентов с плохим прогнозом во всех 3 ТН. Однако если в группе высокого риска, сформированной по результатам выявления МОБ в ТН1, рецидивировали 50 % пациентов, то при определении такой группы по данным ТН2 рецидивы были зафиксированы уже в 80 % случаев. Кроме того, не было ни одного пациента с высоким уровнем МОБ в ТН2, кто не был бы отнесен к группе с плохим прогнозом в ТН1. Таким образом, определение МОБ на момент окончания индукционной терапии позволило максимально уточнить группу высокого
сч
4
CS
CV 4
риска, избежав избыточного включения в нее пациентов с медленным клиренсом опухолевых клеток по данным, полученным в ТНГ В то же время, если для выделения группы детей с плохим прогнозом предпочтительнее использовать результаты определения МОБ в ТНр то для выявления пациентов с хорошим ответом на терапию, наоборот, более подходит день 15-й [16]. Эта задача крайне актуальна именно при ETV6-RUNX1 -позитивном ОЛЛ, так как традиционно наличие данной генетической аберрации считается благоприятным фактором риска и именно в этой группе пациентов в перспективе может оказаться обоснованным снижение интенсивности или продолжительности химиотерапии. Последнее с успехом было предпринято японскими исследователями при лечении по протоколу TCCSG L92—13, в рамках которого БСВ у пациентов с наличием ETV6-RUNX1, достигших клинико-гематологической ремиссии, составляла 93,8 ± 6,1 % [46].
Сравнительный анализ определения МОБ различными методами выполнялся неоднократно, и чаще всего это делалось для сопоставления данных проточной цитометрии и определения индивидуальных перестроек Ig/TCR [47—53]. Сравнение метода выявления химерных транскриптов [23, 54—56] или химерных генов [57] с 1 из 2 упомянутых методов проводится значительно реже. Так, T. Taube и соавт. выявили кон-кордантные результаты количественного определения химерного транскрипта ETV6-RUNX1 и индивидуальных перестроек Ig/TCR в 34 из 36 образцов от детей
с рецидивом ОЛЛ [23]. В 2 дискордантных образцах (5,5 %) величина МОБ, определенная по данным индивидуальных перестроек Ig/TCR, была значительно выше, чем по результатам мониторинга химерного транскрипта ETV6-RUNX1, несмотря на сопоставимую чувствительность обоих тестов. Схожие результаты получены также E. Fronkova и соавт. Они выявили высокую корреляцию между этими методами (R2 = 0,903) при прямом количественном сравнении [54]. Также авторами было показано, что только 8 из 117 образцов (6,8 %) различались между собой более чем в 10 раз, причем эта тенденция чаще всего проявлялась тем, что результаты определения ETV6-RUNX1 были ниже по сравнению с Ig/TCR. Это несколько расходится с нашими данными, опубликованными ранее и свидетельствующими о более высокой частоте обнаружения химерных транскриптов в РНК, нежели при подходах, основанных на мониторинге химерных генов в геномной ДНК для выявления МОБ. Однако необходимо отметить, что проведенное нами сравнение касалось перестроек гена MLL [58].
Также хорошо сопоставимые результаты получены в работе S. Alm и соавт. при сравнении количества химерного транскрипта ETV6-RUNX1 и МОБ, определяемой методом проточной цитометрии. Однако в этом исследовании процент опухолевых клеток, выявленный методом проточной цитометрии, сравнивался с частным от деления ETV6-RUNX1 / нормальный ген в каждой из ТН к этой же величине в момент установления диагноза (ТН0) [55]. Нам представляется
Таблица 4. Различный подход к определению минимальной остаточной болезни Table 4. Various approaches for the minimal residual disease detection
Метод Method Способ
Определение клональных перестроек генов Ig/TCR Detection of clonal Ig/TCR rearrangements Логарифмическое снижение количества ДНК из клеток, имеющих клоноспеци-фические перестройки генов Ig/TCR, относительно ДНК из исходной опухолевой популяции Log10 decline of DNA isolated from cells, carrying clonal Ig/TCR rearrangements, in relation to DNA from an initial blast cells population
Определение химерных генов Detection of fusion genes in DNA Логарифмическое снижение количества ДНК из клеток, несущих химерный ген, относительно ДНК из исходной опухолевой популяции Log10 decline of DNA isolated from cells, carrying fusion gene in relation to DNA from an initial blast cells population
Определение химерных транскриптов (вариант 1) Detection of fusion gene transcripts in RNA (option 1) Отношение нормализованной экспрессии химерного гена в определенной точке наблюдения по отношению к инициально диагностированной Ratio of normalized expression of fusion gene transcript at a precise time-point in relation to initial the normalized expression
Определение химерных транскриптов (вариант 2) Detection of fusion gene transcripts in RNA (option 2) Отношение экспрессии химерного гена опухолевыми клетками к экспрессии нормального гена всеми клетками костного мозга на момент проведения исследования Ratio of fusion gene transcript expression in blast cells to expression of control gene from all nucleated cells at a precise time-point
Многоцветная проточная цитометрия Multicolor flow cytometry Процентное содержание опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток костного мозга на момент проведения исследования Percentage of blast cells out of all nucleated cells at a precise time-point
LO
О
1000,000
о. §
s *
о и ü £
т О о
£ тз
et S О
CÛ
m -
m Q о §
100,000
10,000
1,000
0,100
0,010
0,001
0,000
ТКМ 1 от сиблинга / BMT1 from sibling ТКМ 2 от сиблинга / BMT2 from sibling
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ПЦР-РВ / real-time PCR
проточная цитометрия / flow cytometry
О О О О
tU tu tu tu
■ донорский химеризм / donor Chimerism
o n o
Q
о
Рис. 6. Пример совместного мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) методами полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с определением значения ETV6-RUNX1/ABL1 и проточной цитометрии. ТКМ — трансплантация костного мозга, DLI — инфузия донорских лимфоцитов, F1, F2, FLAG, FLAM — химиотерапевтические блоки при лечении рецидива, ПТ — поддерживающая терапия Fig. 6. Example of combined minimal residual disease (MRD) monitoring by real-time quantitative PCR (RT-PCR) with detection of ETV6-RUNX1/ABL1 ratio and by multicolor flow cytometry. BMT — bone marrow transplantation, DLI — donor lymphocyte infusion, F1, F2, FLAG, FLAM — blocks of chemotherapy in the treatment of relapse, МТ — maintenance therapy
cv
4
CS
cv
4
более логичным для сопоставления с данными проточной цитометрии применять в качестве величины МОБ отношение количества транскриптов химерного и нормального генов (табл. 4, вариант 2), так как такой способ расчета величины МОБ наиболее близок к методике ее измерения иммунофенотипированием (см. табл. 4). Более того, полученный нами коэффициент корреляции между данными ПЦР-РВ и проточной цитометрии (R2 = 0,953) практически не отличается от этого же показателя, если бы мы проводили расчет по методике S. Alm и соавт. (R2 = 0,964).
Принципиально важным является и то, что выявленные нами ранее для ETV6-RUNX1 -позитивного ОЛЛ прогностически значимые уровни цитометриче-ски определяемой МОБ как для ТН, так и для ТН2 [16] оказались идентичными тем ПУ, которые были
получены в данном исследовании для количественной ПЦР-РВ. Кроме того, при длительном мониторинге МОБ параллельно 2 методами кинетика элиминации опухолевых клеток оказалась сходной (рис. 6). Полученная нами в данной работе высокая качественная и количественная сопоставимость результатов ПЦР и проточной цитометрии свидетельствует о валидно-сти полученных результатов и минимизирует возможные случайные ошибки при анализе прогностического значения МОБ, определяемой методом ПЦР-РВ как отношение ETV6-RUNX1/ABL1. Важно отметить, что методы как проточной цитометрии [16], так и выявления химерных транскриптов [59] являются наиболее воспроизводимыми и относительно недорогими для мониторинга МОБ, а идентичность прогностически значимых ПУ МОБ для обоих методов делает
0
сч
4
CS
CV 4
их наиболее удобными для совместного применения у пациентов с t(12;21).
Сравнение результатов с нашей собственной более ранней работой показало снижение сопоставимости качественного определения химерного транскрипта ETV6-RUNX1 и данных проточной цитометрии с 96,3 % [56] до 84,8 %. Возможно, отчасти это связано с более чем 3-кратным увеличением числа исследованных ^12;21)-позитивных образцов.
Однако, несмотря на статистическую значимость полученных результатов, сложно делать однозначные выводы о прогностической роли выявления МОБ по данным, полученным на относительно небольшой когорте пациентов в моноцентровом исследовании. Поэтому крайне актуальным является вопрос проведения стандартизации определения МОБ данным методом в рамках многоцентрового исследования. Наиболее целесообразным представляется обследование всех ETV6-RUNX1 -позитивных пациентов в нескольких референсных лабораториях, использующих единые протокол анализа, условия проведения обратной транскрипции и ПЦР и контрольные материалы. При этом на 1-м этапе необходимо проведение сравнительного анализа результатов на разведениях клеточной линии REH, затем на образцах пациентов, после чего станет возможным перейти к мониторингу МОБ в многоцентровом формате. Ранее неоднократно было показано, что ETV6-RUNX1 представляет собой маркер, экспрессия которого остается стабильной не менее 48 ч c момента взятия биологического мате-
риала [20, 22, 23], что существенно облегчает исследование в многоцентровом режиме.
Заключение
Таким образом, в ходе проведенного нами анализа было показано, что определение количества химерного транскрипта ETV6-RUNX1 на разных этапах терапии ВП-ОЛЛ имеет важное прогностическое значение. Гиперэкспрессия ETV6-RUNX1 при установлении диагноза, а также величина МОБ, определяемая как отношение количества копий химерного транскрипта ETV6-RUNX1 к транскрипту нормального гена ABL1, на 15-й и 36-й дни терапии по протоколу А^-МВ-2008 являются важными факторами риска, влияющими на прогноз ^12;21)-позитивного ОЛЛ у детей. Также была показана хорошая качественная и количественная сопоставимость результатов определения МОБ при исследовании методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта ETV6-RUNX1. Прогностически значимые уровни МОБ для 2 методов оказались идентичными. Поскольку включенные в данное исследование пациенты представляют собой часть группы многоцентрового исследования А^-МВ-2008, полученные результаты обязательно должны быть ва-лидированы в проспективном режиме в многоцентровом формате. Дальнейшее обсуждение прогностического значения результатов определения МОБ при ^12;21)-позитивном ОЛЛ у детей может позволить включить данную технологию в систему стратификации этих пациентов на группы риска в будущем.
Благодарности. Авторы выражают благодарность всем врачам и медицинским сестрам отделения детской онкологии и гематологии Областной детской клинической больницы № 1 (Екатеринбург).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests. Authors declare no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Romana S.P., Le Coniat M., Berger R. t(12;21): a new recurrent translocation in acute lymphoblastic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1994;9:186-91. PMID: 7515661.
2. Golub T., Barker G., Bohlander S. et al. Fusion of the TEL gene on 12p13
to the AML1 gene on 21q22 in acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(11):4917-21. PMID: 7761424.
3. Romana S.P., Mauchauffe M.,
Le Coniat M. et al. The t(12;21) of acute lymphoblastic leukemia results in a tel-AML1 gene fusion. Blood 1995;85(12): 3662-70.PMID: 7780150.
4. Liang D., Shih L., Yang C. et al. Frequencies of ETV6-RUNX1 fusion and hyper-diploidy in pediatric acute lymphoblastic leukemia are lower in Far East than West.
Pediatr Blood Cancer 2010;55(3):430-3. DOI: 10.1002/pbc.22628.PMID: 20658612.
5. Moricke A., Zimmermann M., Reiter A. et al. Long-term results of five consecutive trials in childhood acute lymphoblastic leukemia performed by the ALL-BFM study group from 1981 to 2000. Leukemia 2010;24(2):265-84. DOI: 10.1038/ leu.2009.257. PMID: 20010625.
6. Moorman A., Ensor H., Richards S. et al. Prognostic effect of chromosomal abnormalities in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia: results from the UK Medical Research Council ALL97/99 randomised trial.
Lancet Oncol 2010;11(5):429-38. DOI: 10.1016/S1470-2045(10)70066-8. PMID: 20409752.
7. Shurtleff S., Buijs A., Behm F. et al. TEL/AML1 fusion resulting from a cryptic
t(12;21) is the most common genetic lesion in pediatric ALL and defines a subgroup of patients with an excellent prognosis. Leukemia 1995;9(12):1985-9.PMID: 8609706.
8. Borkhardt A., Cazzaniga G., Viehmann S. et al. Incidence and clinical relevance
of TEL/AML1 fusion genes in children with acute lymphoblastic leukemia enrolled in the German and Italian multicenter therapy trials. Blood 1997;90(2):571-7. PMID: 9226156.
9. Kobayashi H., Rowley J. Identification
of cytogenetically undetected 12p13 translocations and associated deletions with fluorescence in situ hybridization. Genes Chromosomes Cancer 1995;12(1):66-9. PMID: 7534114. 10. Loh M., Goldwasser M., Silverman L. et al. Prospective analysis of TEL/AML1-positive patients treated on Dana-Farber
Cancer Institute Consortium Protocol 95-01. Blood 2006;107(11):4508-13. DOI: 10.1182/blood-2005-08-3451. PMID: 16493009.
11. Forestier E., Heyman M., Andersen M.-K. et al. Outcome of ETV6/RUNX1-positive childhood acute lymphoblastic leukaemia in the NOPHO-ALL-1992 protocol: frequent late relapses but good overall survival. Br J Haematol 2008;140(6):665-72. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2008.06980.x. PMID: 18241254.
12. Bhojwani D., Pei D., Sandlund J. et al. ETV6-RUNX1-positive childhood acute lymphoblastic leukemia: improved outcome with contemporary therapy. Leukemia 2012;26(2):265-70. DOI: 10.1038/ leu.2011.227. PMID: 21869842.
13. Lee J., Kim S., Jang P. et al. Outcome and prognostic factors for ETV6/RUNX1 positive pediatric acute lymphoblastic leukemia treated at a single institution in Korea. Cancer Res Treat 2017;49(2):446-53. DOI: 10.4143/crt.2016.211.PMID: 27506214.
14. Pui C.-H., Pei D., Raimondi S. et al. Clinical impact of minimal residual disease in children with different subtypes of acute lymphoblastic leukemia treated with Response-Adapted therapy. Leukemia 2017; 31(2):333-9. DOI: 10.1038/leu.2016.234. PMID: 27560110.
15. Conter V., Bartram C., Valsecchi M.-G. et al. Molecular response to treatment redefines all prognostic factors in children and adolescents with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia: results
in 3184 patients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study. Blood 2010;115(16):3206-14. DOI: 10.1182/blood-2009-10-248146. PMID: 20154213.
16. Попов А.М., Вержбицкая Т. Ю.,
Цаур Г.А. и др. Применение проточной цитометрии для определения минимальной остаточной болезни у детей с острым лимфобластным лейкозом, получающих терапию по протоколам со сниженной интенсивностью. Онко-гематология 2015;10(4):44-55. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Flow cytometric minimal residual disease monitoring in children with acute lymphoblastic leukemia treated by regimens with reduced intensity. Onko-gematologiya = Oncohematology 2015;10(4):44-55. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/1818-8346-2015-10-4-44-55.
17. Stams W., den Boer M., Beverloo B. et al. Expression levels of TEL, AML1, and the fusion products TEL-AML1 and AML1-TEL versus drug sensitivity and clinical outcome in t(12;21)-positive pedi-atric acute lymphoblastic leukemia. Clin Cancer Res 2005;11(8):2974-80.
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-04-1829. PMID: 15837750.
18. Ballerini P., Landman Parker J., Laurendeau I. et al. Quantitative analysis of TEL/AML1 fusion transcripts by real-
time RT-PCR assay in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2000;14(8):1526-8. PMID: 10942253.
19. Drunat S., Olivi M., Brunie G. et al. Quantification of TEL-AML1 transcript for minimal residual disease assessment in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 2001;114(2):281-9. PMID: 11529845.
20. Seeger K., Kreuzer K.-A., Lass U. et al. Molecular quantification of response to therapy and remission status
in TEL-AML1-positive childhood all by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Cancer Res 2001;61(6):2517-22. PMID: 11289124.
21. Bolufer P., Barragán E., Verdeguer A. et al. Rapid quantitative detection of TEL-AML1 fusion transcripts in pediatric acute lym-phoblastic leukemia by real-time reverse transcription polymerase chain reaction using fluorescently labeled probes. Haematologica 2002;87(1):23-32. PMID: 11801462.
22. Madzo J., Zuna J., Muzíková K. et al. Slower molecular response to treatment predicts poor outcome in patients with TEL/AML1 positive acute lymphoblastic leukemia: prospective real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction study. Cancer 2003;97(1):105-13. DOI: 10.1002/cncr.11043.PMID: 12491511.
23. Taube T., Eckert C., Körner G. et al. Realtime quantification of TEL—AML1 fusion transcripts for MRD detection in relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia Comparison with antigen receptor-based MRD quantification methods. Leuk Res 2004;28(7):699-706. DOI: 10.1016/ j.leukres.2003.11.006. PMID: 15158091.
24. Литвинов Д.В., Карелин А.Ф., Романова К.И. и др. Лечение острого лимфоб-ластного лейкоза у детей: современные возможности и нерешенные проблемы. Доктор. Ру 2015;10(111):30—7. [Litvinov D.V, Karelin A. F., Romanova K.I. et al. Treatment of acute lymphoblastic leukemia in children: current possibilities and unsolved problems. Doctor.ru 2015;10(111):30-7. (In Russ.)].
25. Bennett J., Catovsky D., Daniel M. et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 1976;33(4):451-8. PMID: 188440.
26. Bene M.C., Castoldi G., Knapp W. et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995;9(10):1783-6. PMID: 7564526.
27. Béné M.C., Nebe T., Bettelheim P. et al. Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia 2011;25(4): 567-74. DOI: 10.1038/leu. 2010.312. PMID: 21252983.
28. ISCN 2005: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2005). Eds.: L. Shaffer, N. Tommerup. Basel: S. Karger, 2005.
29. ISCN 2009: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2009). Eds.: L. Schaffer, M. Slovak, L. Campbell. Basel: S. Karger, 2009.
30. ISCN 2013: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2013). Eds.: L. Schaffer, J. McGovan-Jordan,
M. Schmid. Basel: S. Karger, 2013.
31. ISCN 2016 An International System for Human Cytogenomic Nomenclature (2016). Eds.: J. McGowan-Jordan, A. Simons,
M. Schmid. Basel: S. Karger, 2016.
32. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю., Цаур Г.А. и др. Особенности мониторинга минимальной остаточной болезни при В-линейных острых лимфо-бластных лейкозах методом проточной цитометрии у детей первого года жизни. Детская онкология 2008;2;32—5. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.J., Tsaur G.A. et al. Peculiarities of minimal residual disease monitoring by flow cytometry in infants with B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Detskaya onkologiya = Pediatric Oncology 2008;2:32-5. (In Russ.)].
33. Цаур Г.А., Попов А.М., Фечина Л.Г., Румянцев С.А. Методические основы диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни при острых лейкозах у детей первого года жизни. Онкогематология 2016;11(1):62—74. [Tsaur G.A., Popov A.M., Fechina L.G., Rumyantsev S.A. Methodological aspects of diagnostics and minimal residual disease monitoring in infant acute leukemias. Onkogematologiya = Oncohematology 2016;11(1):62-74. (In Russ.)].
DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-1-62-74.
34. Попов А.М., Белевцев М.В., Боякова Е.В. и др. Стандартизация определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей
с В-линейным острым лимфобластным лейкозом. Опыт работы российско-белорусской кооперативной группы. Онкогематология 2016;11(4):64—73. [Popov A.M., Belevtsev M.V., Boyako-va E.V. et al. Standardization of flow cyto-metric minimal residual disease monitoring in children with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Russia—Belarus multicenter group experience. Onkogema-tologiya = Oncohematology 2016;11(4):64—73. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-4-64-73.
35. Цаур Г.А., Друй А.Е., Попов А.М. и др. Возможность использования микроструйных биочипов для оценки качества и количества РНК у пациентов
с онкологическими и онкогематоло-гическими заболеваниями. Вестник Уральской медицинской академической науки 2011;4:107-11. [Tsaur G.A., Druy А.Е., Popov А.М. et al. Microfluidic
cv
4
CS
cv
4
cv
4
CS
cv
4
biochips for RNA quantity and quality evaluation in patients with oncological disorders. Vestnik Uralskoy medicinskoy aka-demicheskoy nauki = Bulletin of the Ural Medical Academic Research 2011;4:107-11. (In Russ.)].
36. Harbott J., Viehmann S., Borkhardt A.
et al. Incidence of TEL/AML1 fusion gene analyzed consecutively in children with acute lymphoblastic leukemia in relapse. Blood 1997;90(12):4933-7. PMID: 9389711.
37. Gabert J., Beillard E., van der Velden V. et al. Standardization and quality control studies of "real-time" quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia — a Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003;17(12):2318—57. DOI: 10.1038/ sj.leu.2403135. PMID: 14562125.
38. Beillard E., Pallisgaard N., van der Velden V. et al. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using "realtime" quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) —
a Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003;17(12):2474—86. DOI: 10.1038/ sj.leu.2403136. PMID: 14562124.
39. Cross N., White H., Müller M. et al. Standardized definitions of molecular response in chronic myeloid leukemia. Leukemia 2012;26(10):2172—5. DOI: 10.1038/ leu.2012.104. PMID: 22504141.
40. Zweig M., Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin Chem 1993;31:561—77. PMID: 8472349.
41. Obuchowski N. ROC analysis. Am J Roentgenol 2005;184(2):364—72. DOI: 10.2214/ ajr. 184.2.01840364. PMID: 15671347.
42. Kaplan E., Meier P. Non-parametric estimation from incomplete observations.
J Am Statc Assoc 1958;53:457—81.
43. Слинин А.С., Быданов О.И., Карачун-ский А.И. Анализ выживаемости и вероятности возникновения отдельных событий у пациентов с острым лейкозом. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2016; 15(3):34—9. [Slinin A.S., Bydanov O.I., Karachunskiy A.I. Analysis of survival and possibility of certain events in patients with acute leucosis. Voprosy gematologii, onko-logii i immunopatologii v pediatrii = Pedi-atric hematology/oncology and immuno-pathology 2016;15(3):34—9. (In Russ.)]. DOI: 10.20953/1726-1708-2016-3-34-39.
44. Cayuela J.-M., Baruchel A., Orange C.
et al. TEL-AMLl fusion RNA as a new target to detect minimal residual disease in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood 1996;88(1): 302—30. PMID: 8704188.
45. Satake N., Kobayashi H., Tsunematsu Y. et al. Minimal residual disease with TEL-AML1 fusion transcript in childhood acute lymphoblastic leukaemia with t(12;21).
Br J Haematol 1997;97(3):607-11. PMID: 9207408.
46. Kato M., Ishimaru S., Seki M. et al. Long-term outcome of 6-month maintenance chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia in children. Leukemia 2017;31:580-4. DOI: 10.1038/leu.2016.274. PMID: 27698447.
47. Neale G., Coustan-Smith E., Pan Q. et al. Tandem application of flow cytometry and polymerase chain reaction for comprehensive detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 1999;13(8):1221-6. PMID: 10450750.
48. Malec M., Björklund E., Söderhäll S. et al. Flow cytometry and allele-specific oligonucleotide PCR are equally effective in detection of minimal residual disease in ALL. Leukemia 2001;15(5):716-27.
PMID: 11368431.
49. Neale G., Coustan-Smith E., Stow P. et al. Comparative analysis of flow cytometry and polymerase chain reaction for the detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2004;18(5):934-8. DOI: 10.1038/ sj.leu.2403348. PMID: 15029212.
50. Malec M., van der Velden V., Björklund E. et al. Analysis of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia: comparison between RQ-PCR analysis of Ig/TcR rearrangements and multicolor flow cytometry immunophenotyping. Leukemia 2004;18(10):1630-6. DOI: 10.1038/ sj.leu.2403444. PMID: 15295608.
51. Kerst G., Kreyenberg H., Roth C. et al. Concurrent detection of minimal residual disease (MRD) in childhood acute lym-phoblastic leukemia by flow cytometry and real-time PCR. Br J Haematol 2005; 128(6):774-82. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2005.05401.x. PMID: 15755280.
52. Robillard N., Cavé H., Méchinaud F. et al. Four-color flow cytometry bypasses limitations of IG/TCR polymerase chain reaction for minimal residual disease detection in certain subsets of children with acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2005;90(11):1516-23. PMID: 16266899.
53. Gaipa G., Cazzaniga G., Valsecchi M.G. et al. Time point-dependent concordance of flow cytometry and real-time quantitative polymerase chain reaction for minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2012;97(10):1582-93. DOI: 10.3324/ haematol. 2011.060426. PMID: 22581001.
54. Fronkova E., Madzo J., Zuna J. et al. TEL/AML 1 real-time quantitative reverse transcriptase PCR can complement minimal residual disease assessment in child-
hood ALL. Leukemia 2005;19(7):1296-7. DOI: 10.1038/sj.leu.2403759. PMID: 15858617.
55. Alm S., Engvall C., Asp J. et al. Minimal residual disease monitoring in childhood B lymphoblastic leukemia with t(12;21)(p13; q22); ETV6-RUNX1: concordant results using quantitation of fusion transcript and flow cytometry. Int J Lab Hematol 2017; 39(2):121-8. DOI: 10.1111/ijlh.12593. PMID: 28004528.
56. Попов А.М., Цаур Г.А., Вержбицкая Т.Ю. и др. Сравнение результатов определения минимальной остаточной болезни методами проточной цитометрии и ПЦР химерного транскрипта у детей с ОЛЛ из В-линейных предшественников. Гематология и трансфузиология 2010;55(2): 3-9. [Popov A.M., Tsaur G.A., Verzhbits-kaya T.Y. et al. Comparison of the results of evaluating the minimum residual disease by flow cytometry and by detecting the chi-meric transcript by the polymerase chain reaction in children with B-cell acute lym-phoblastic leukemia. Gematologiya i trans-fuziologiya = Hematology and transfusio-logy 2010;55(2):3-9. (In Russ.)].
57. Metzler M., Mann G., Monschein U. et al. Minimal residual disease analysis in children with t(12;21)-positive acute lymphoblastic leukemia: comparison of Ig/TCR rearrangements and the genomic fusion gene. Haematologica 2006;91(5):683-6.PMID: 16627248.
58. Цаур Г.А., Попов А.М., Плеханова О.М. и др. Транслокация t(1;11)(p32;q23)
с образованием химерного гена MLL-EPS15 при острых лейкозах: обзор литературы и описание 6 новых случаев. Подходы к мониторированию минимальной остаточной болезни. Онкоге-матология 2013;1:17-32. [Tsaur G.A., Popov A.M., Plekhanova O.M. et al. Translocation t(1;11)(p32;q23) with MLL-EPS15 fusion gene formation in acute leukemias: a review and 6 new cases report. Approaches to minimal residual disease monitoring. Onkogematologiya = Oncohematology 2013;1:17-32. (In Russ.)].
59. Цаур Г.А., Попов А.М., Наседкина Т.В. и др. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни, определенной путем выявления химерных транскриптов у детей первого года жизни, больных острым лимфобластным лейкозом, получающих терапию
по протоколу MLL-Baby. Гематология и трансфузиология 2012;57(4):12-22. [Tsaur G.A., Popov A.M., Nasedkina T.V. et al. Prognostic significance of the minimal residual disease evaluated by detection of MLL fusion gene transcripts in infants under 1 year of age with acute lymphoblas-tic leukemia treated by the MLL-Baby protocol. Gematologiya i transfuziolo-giya = Hematology and transfusiology. 2012;57(4):12-22. (In Russ.)].
Статья поступила: 22.07.2017. Принята в печать: 17.11.2017. Article received: 22.07.2017. Accepted for publication: 17.11.2017.
