CC BY
68
УДК 615.32:616.831:616.379-008.64:615.214-092.9
В.І. Жилюк, В.Й. Мамчур
СТАН ГЛУТАТІОНЗАЛЕЖНОЇ ЛАНКИ СИСТЕМИ АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ МОЗКУ У ЩУРІВ З АЛОКСАН-ІНДУКОВАНИМ ДІАБЕТОМ ЗА УМОВ ВИКОРИСТАННЯ НООТРОПІВ
ДЗ «Дніпропетровська медична академія МОЗ України»
кафедра фармакології, клінічної фармакології та фармакоекономіки
(зав. - д. мед. н., проф. В.Й. Мамчур)
Ключові слова: ноотропи, алоксановий діабет, головний мозок, система глутатіону Key words: nootropic drugs, alloxan diabetes, brain, glutathione system
Резюме. В работе рассмотрено влияние средств ноотропной терапии на активность системы глутатиона у крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Проведенными исследованиями установлено, что энтроп, ноопепт, пентоксифиллин, прамирацетам, цереброкурин и цитиколин, но не пирацетам и экстракт гинкго билоба, способствуют восстановлению активности глутатионзависимого звена системы антиоксидантной защиты в тканях головного мозга крыс с аллоксан-индуцированным диабетом.
Summary. Influence of nootropic drugs on activity of glutathione system in rats with experimental diabetes was examined in this article. Our research has established that entrop, noopept, pentoxifylline, pramiracetam, cerebrocurin and citicoline but not piracetam and ginkgo biloba extract promote restoring glutathione-dependent section of antioxidant defensive system in brain tissues of rats with alloxan-induced diabetes.
Окиснювальний стрес та активні форми кисню беруть участь у патогенезі понад 100 захворювань. Зокрема, при цукровому діабеті та його судинних ускладненнях окиснювальний стрес є невід’ємною частиною метаболічних порушень. Захист тканин від згубного впливу АФК здійснюють внутрішньоклітинні системи, зокрема система глутатіону, яка представлена відновленим глутатіоном і ферментами його метаболізму - глутатіонредуктазою (ГР), глута-тіонпероксидазою (ГПО) та глутатіонтрансфе-разою [4, 7]. Глутатіон (у^1иату1-су8Іеіпу1^1у-сіпе; 08И), відіграє ключову роль у функціонуванні тіолдисульфідредуктази - глутаредоксину (шляхом відновлення окисненої форми), який входить до складу суперсімейства тіоредоксинів. Це поліфункціональний фермент, що утворює глутаредоксин-залежну систему та відіграє важливу роль у підтримці внутрішньоклітинного гомеостазу і редокс-залежної регуляції цілого ряду внутрішньоклітинних процесів, серед них проліферації, диференціювання та апоптозу [3].
Гіперглікемія сприяє активації сорбітолового шляху обміну глюкози, що, поряд з активацією НАДФН-оксидази, призводить до виснаження цитозольного рівня НАДФН і внаслідок цього -рівня відновленого глутатіону [12, 14, 15]. У свою чергу, дефіцит глутатіону сприяє окислювальній напрузі, яка відіграє роль у механізмах старіння і патогенезі багатьох хвороб (ква-
шіоркор, ураження печінки, серповидно-клітинна анемія, ВІЛ, СНІД, рак, інфаркт міокарда та діабет) [13]. Істотне значення глутатіон має і в механізмах толерантності нейронів до ішемії та нейродегенеративних процесів (хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона та інсульт) [5, 10,
11, 13]. Це може свідчити про корисну роль антиоксидантної терапії для попередження ускладнень цукрового діабету [12].
Сьогодні одним з напрямків, спрямованих на усунення або ослаблення проявів ішемічного ушкодження головного мозку різного походження, зокрема когнітивного дефіциту, є призначення засобів з церебропротекторними властивостями, зокрема - ноотропів. Однак у літературі відсутні систематизовані дані щодо участі цих препаратів у механізмах антиоксидантного захисту мозку, зокрема і при хронічній гіперглікемії.
Метою наших досліджень було порівняльне визначення впливу препаратів церебропротек-торної та ноотропної терапії на функціонування глутатіонзалежної ланки системи антиоксидантного захисту в тканинах головного мозку щурів з алоксановим діабетом.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проведені на 120 білих щурах чоловічої статі масою 250 - 300 г, що утримувались на стандартному раціоні віварію (температура повітря: 22 ± 2°С, світлий/темний цикл: 12/12 годин). Експериментальну модель цукро-
вого діабету відтворювали шляхом одноразового підшкірного введення алоксану моногідрату (Sigma, США) в дозі 150 мг/кг у вигляді 5% розчину в ацетатному буфері, рН 4,5 після попередньої 24-годинної депривації їжі (при збереженому доступі до води) тваринам [8, 9]. Для зменшення загибелі тварин внаслідок гіпоглікемічного шоку після введення алоксану, щури протягом 24 годин після індукції діабету замість води отримували 5% розчин глюкози.
Рівень глюкози крові визначався на 11 добу після введення алоксану за допомогою глюкометра Optium Omega (Abbot Diabetes Care Inc., США). Для подальших досліджень були використані тільки тварини з підвищеним рівнем глюкози (>11 ммоль/л) [8, 9].
Препарати: гінкго білоба екстракт (EGb 761) (40 мг/кг n=10, внутрішньошлунково), пенток-сифілін (100 мг/кг, n=10, внутрішньошлунково), пірацетам (500 мг/кг, n=10, внутрішньошлун-ково), прамірацетам (300 мг/кг, n=10, внутрішньошлунково), цереброкурин (0,05 мл/кг, n=10, внутрішньо-очеревинно), цитиколін (500 мг/кг, n=10, внутрішньошлунково), N-фенілацетил-Ь-проліл гліцину (ноопепт) (10 мг/кг, n=10, внутрішньошлунково) та ^карбамоіл-метил-4-фе-ніл-2-пірролідон (ентроп) (100 мг/кг, n=10, внутрішньошлунково) вводили 1 раз на добу протягом 20 діб, починаючи з 11 дня експерименту та встановлення рівня гіперглікемії. Інтактним тваринам (n=20) та тваринам контрольної групи (n=20) у відповідному режимі внутрішньошлун-ково (в/ш) вводили дистильовану воду.
На 30 добу тварин виводили з експерименту шляхом декапітації. Для біохімічних досліджень фрагменти мозку гомогенізували у рідкому азоті. Цитозольну фракцію виділяли методом диференційованого центрифугування.
Вміст окисненого та відновленого глутатіону визначали флюорометрично [3]. Активність глу-татіонпероксидази і глутатіонредуктази визначали спектрофотометрично [1].
Статистична обробка даних наукових досліджень проводилась з використанням програми STA-TISTICA 6.1 (серійний номер AGAR 909 E415822 FA) та включала розрахунки середніх арифметичних значень (М), їх похибок (±m), вірогідність різниці середніх арифметичних (р) за допомогою непараметричного - U- критерію Манна-Уітні [6].
Усі експериментальні процедури здійснені згідно з «Положенням про використання тварин у біомедичних дослідах» та Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, які використовуються в експериментах та інших наукових цілях, від 18.03.1986 г.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Встановлено, що у щурів з алоксановим діабетом у тканинах головного мозку відзначалося суттєве на 85,5% (р<0,001) зниження вмісту відновленої форми глутатіону на фоні чотирикратного зростання рівня його окисненої форми (табл.). Зіставно зареєстровано зниження активності ГПО і ГР на 60,5% (р<0,00І) і 67,7% (р<0,001) відповідно.
За умов проведення експериментальної терапії встановлено, що ноопепт, пентоксифілін, цитиколін, прамірацетам, ентроп та цереброкурин (розташовані в порядку зростання активності), на відміну від пірацетаму та EGb 76І, сприяли суттєвому зростанню в 3,6 - 5,5 разу (р<0,001) рівня відновленого глутатіону. Ці явища зафіксовані на фоні суттєвого підвищення активності ГР на І05,5% (р<0,00І) у ентропу і до 253,7% (р<0,001) у цереброкурину (табл.). Однак слід зазначтити, що всі досліджені засоби призводили до статистично значущого зменшення вмісту окисненої форми глутатіону.
По відношенню до активності ГПО спостерігалася подібна картина. Ентроп, ноопепт, пен-токсифілін, прамірацетам, цереброкурин та ци-тиколін відповідно на 113,1% (р<0,001), 91,9% (р<0,001), 106,3% (р<0,001), 69,5% (р<0,001), 138,6% (р<0,001) та 117,7% (р<0,001) збільшували цей показник. Водночас за умов використання пірацетаму та EGb 761 відзначалися протилежні зміни, які характеризувалися низькою активністю цього ферменту, що навіть на 28% (р<0,001) та 19,9% (р<0,001) поступався значенням групи контролю, що може бути по-в’ язано з низькою активністю глутатіонредук-тази.
Таким чином, перебіг хронічної гіперглікемії, що розвинулася внаслідок введення алоксану, призводить до активації процесів вільно-радикального окиснення в тканинах головного мозку та пригнічення глутатіонзалежної ланки системи антиоксидантного захисту. Це відіграє ключову роль у процесах ушкодження нейроцитів та розвитку патологічних станів. Однією з причин декомпенсації системи глутатіону є інтенсифікація процесів його окиснення та сповільнення його відновлення через низьку активність глута-тіонредуктази і також пригнічення активності ключового антиоксидантного ферменту - глута-тіонпероксидази. Ентроп, ноопепт, пентокси-філін, прамірацетам, цереброкурин та цитиколін, однак не пірацетам та екстракт гінкго білоба, проявляють виразні протирадикальні властивості, що асоціюються з підвищенням активності ферментів та рівня відновленого глутатіону в тканинах великих півкуль.
12/ Том ХУП/ 4
5
Вплив засобів з ноотропною активністю на деякі показники глутатіон-залежної системи антиоксидантного захисту в головному мозку щурів з алоксановим діабетом (М ± т)
Групи тварин Глутатіон відмов., мм/гр/тканини Глутатіон окисн.. мм/гр/тканини Г лутатіонредуктаза. ум.од./мг/мин/гр/тканини Глутатіонпероксидаза. ум.од./мг/мин/гр/тканини
Інтактні (n = 20) 4.0 ± 0.141*** 0.22 ± 0.018*** 16.7 ± 0.76*** 59.7 ± 0.977***
Контроль (АД) (n = 20) 0.58 ± 0.026 0.89 ± 0.043 5.4 ± 0.21 23.6 ± 1.91
EGb 761 (n = 10) 0.66 ± 0.022* 0.52 ± 0.016*** 6.7 ± 0.17*** 18.9 ± 0.38***
Ентроп (n = 10) 3.1 ± 0.13*** 0.34 ± 0.026*** 11.1 ± 0.50*** 50.3 ± 2.07***
Ноопепт (n = 10) 2.1 ± 0.08*** 0.24 ± 0.011*** 12.0 ± 0.49*** 45.3 ± 1.31***
Пентоксифілін (n = 10) 2.2 ± 0.08*** 0.27 ± 0.010*** 12.5 ± 0.37*** 48.7 ± 1.54***
Пірацетам (n = 10) 0.61 ± 0.019 0.54 ± 0.021*** 6.1 ± 0.24 17.0 ± 0.39**
Прамірацетам (n = 10) 2.3 ± 0.07*** 0.39 ± 0.017*** 14.0 ± 0.20*** 40.0 ± 0.65***
Цереброкурин (n = 10) 3.2 ± 0.09*** 0.35 ± 0.013*** 19.1 ± 0.57*** 56.3 ± 0.93***
Цитиколін (n = 10) 2.3 ± 0.09*** 0.19 ± 0.006*** 13.6 ± 0.41*** 51.4 ± 1.66***
Примітки : - р < 0,01 по відношенню до активного контролю; - р < 0,001 по відношенню до активного контролю
ВИСНОВКИ
1. Формування алоксанового діабету супро- відновленню активності системи глутатіону в
воджується виснаженням глутатіонзалежної лан- тканинах головного мозку.
ки системи антиоксидантного захисту.
3. За ступенем активності препарати можна
2. Ентроп, ноопепт, пентоксифілін, прамі- розмістити таким чином: цереброкурин > ентроп
рацетам, цереброкурин та цитиколін, але не пі- = цитиколін > пентоксифілін > прамірацетам >
рацетам та екстракт гінкго білоба, сприяють ноопепт.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа / В.С. Асатиани. - М.: Наука, 1969. - 739 с.
2. Изучение глутатиона и ферментов его метаболизма у больных старших возрастных групп с хронической церебральной ишемией / В.И. Кулин-ский, Л.С. Колесниченко, В.В. Шпрах [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - Т. 1, № 39. - С. 63-65.
3. Калинина Е.В. Участие тио-, перокси- и глу-таредоксинов в клеточных редокс-зависимых процесах / Е.В. Калинина, Н.Н. Чернов, А.Н. Саприн // Успехи биологической химии. - 2008. - Т. 48. - С. 319-358.
4. Кулинский В.И. Биологическая роль глута-тиона / В.И. Кулинский, Л. С. Колесниченко // Успехи соврем. биологии. - 1990. - Т. 110, № 1 (4). - С. 2033.
5. Система глутатиона крови при цереброваскулярных заболеваниях и коррекция нарушений ее функции а-липоевой кислотой / Л.С. Колесниченко,
В.И. Кулинский, В.В. Шпрах [и др.] // Журнал неврологии и психиатрии. - 2008. - № 9. - С. 36-40.
6. Халафян А.А. STATISTICA 6. Статистический анализ данных / А.А. Халафян. - М.: Бином-Пресс, 2007. - 512 с.
7. Dave G. Hyperglycemia induced oxidative stress in type-1 and type-2 diabetic patients with and without nephropathy / G. Dave, К. Kalia // Cell. Mol. Biol. -2007. - Vol. 30, N 53 (5). - Р.68-78.
8. Dave K. R. Effect of alloxan-induced diabetes on serum and cardiac butyrylcholinesterases in the rat / K. R. Dave, S. S. Katyare // J. Endocrinology. - 2002. - Vol. 175, N 1. - Р. 241-250.
9. Diabetes-induced changes in the 5-hydro-xytryptamine inhibitory receptors involved in the pressor effect elicited by sympathetic stimulation in the pithed rat / M. Garcia, A. Moran, E. Calama [et al.] // Brit. J. Pharmacology. - 2005. - Vol. 145, N 5. - Р. 593-601.
10. Dringen R. Glutathione metabolism and oxidative stress in neurodegeneration / Dringen R. // Eur. J. Bio-chem. - 2000. - Vol. 267. - P. 4903-4903.
11. Dringen R. Glutathione pathways in the brain / R. Dringen, J. Hirrlinger // Biol. Chem. - 2003. - Vol. 384, N 4. - P. 505-516.
12. Evidence for Accelerated Rates of Glutathione Utilization and Glutathione Depletion in Adolescents With Poorly Controlled Type 1 Diabetes / D. Darmaun, S. D. Smith, S. Sweeten [et al.] // Diabetes. - 2005. - Vol. 54. - P. 190-196.
13. Glutathione metabolism and its implications for health / Guoyao Wu, Yun-Zhong Fang, Sheng Yang [et al.] // Nutr. - 2004. - Vol. 134. - P. 489-492.
14. Glutathione synthesis is diminished in patients with uncontrolled diabetes and restored by dietary supplementation with cysteine and glycine / Rajagopal V. Sekhar, Siripoom V. Mckay, Sanjeet G. Patel [et al.] // Diabetes Care. - 2011. - Vol. 34, N 1. - P. 162-167.
15. Urso C. Oxidative stress and endothelial dysfunction / C. Urso, G. Caimi // Minerva Med. - 2011. - Vol. 102, N 1. - P. 59-77.
♦
УДК 616.379-008.64-092.9:612.81/.82-071
О.Г. Родинський, МЕХАНІЗМИ ФУНКЦІОНУВАННЯ
ОГ■ Зінов >єва ЦЕНТРАЛЬНОЇ ТА ПЕРИФЕРИЧНОЇ
НЕРВОВОЇ СИСТЕМИ В УМОВАХ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ
ДЗ «Дніпропетровська медична академія МОЗ України» кафедра фізіології
(зав - д. мед. н., проф. О.Г. Родинський)
Резюме. Актуальность изучения вопроса развития сахарного диабета и диабетической невропатии не теряет своего значения на сегодняшний день, так как с каждым годом продолжает расти количество больных диабетом и растет количество его осложнений, приводящих к увеличению инвалидности и смертности. Комплексного подхода к изучению рефлекторной дуги спинного мозга практически не было, встречаются единичные исследования отдельных ее звеньев, что не позволяет сделать конкретные выводы относительно поражения нервной системы при сахарном диабете. Применение электрофизиоло-гических методов позволит комплексно подойти к изучению проблемы диабетической невропатии на экспериментальных моделях, позволит отследить все звенья рефлекторной дуги и дать полную картину поражений нервной системы, особенно на ранних сроках возникновения диабета.
Summary. The urgency of studying diabetes mellitus and diabetic neuropathy remains relevant nowadays, as each year the number of people with diabetes as well as the number of complications, increases; this leads to increased disability and death rate. Actually, there was no integrated approach to the study of spinal reflex arc, only single studies of some of its units are found; this doesn’t allow to make specific conclusions about the nervous system injuries in diabetes mellitus. The usage of electrophysiological techniques provides a comprehensive approach to the problem of diabetic neuropathy in experimental models, and allows to study all the links of the reflex arc and to obtain a complete picture of the nervous system injuries, especially in early stages of diabetes.
Цукровий діабет (ЦД) - це метаболічне за- призводить до специфічних довготривалих мік-хворювання, яке супроводжується гіпергліке- роваскулярних та неврологічних ускладнень мією та порушенням обміну білків та жирів, що [13,26,48,].
Ключові слова:
експериментальний цукровий діабет, діабетична невропатія, електрофізіологічні дослідження Key words: experimental diabetes, diabetic neuropathy, electrophysiological studies
12/ Том XVU/ 4
7
