CC BY
229. Куренкова, С. В. Продуктивность и химический состав Rhaponticum carthamoides (ЭД1Ы.), выращиваемого в республике Коми / С. В. Куренкова, Г. Н. Табаленкова // Растительные ресурсы. - 2000. - № 2. - С. 14-23.
10. Экдистероиды в культурах клеток Serrtulla coronata и А^а reptans / В.Н. Филиппова [и др.] // Химия растительного сырья. - 2002. - № 1. - С. 57-62.
11. Карусевич, А. А. Идентификация и количественное определение 20-гидрок-сиэкдизона в листьях левзеи сафлоровид-ной методом ВЭЖХ / А. А. Карусевич, Д. В. Моисеев, Г. Н. Бузук // Вестник фармации. - 2007. - № 3 (37). - С. 55-59.
12. Куркина, А. В. Флавоноиды фармакопейных растений / А. В Куркина. - Самара : ООО «Офорт», 2012. - 290 с.
13. Государственная фармакопея Республики Беларусь (ГФ РБ II): В 2 т. Т.1. Общие методы контроля качества лекарственных средств / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под общ. ред. Шеряко-ва А.А. - Молодечно: Победа, 2012. - 1220 с.
14. Карусевич, А. А. Изучение динамики накопления 20-гидроксиэкдизона и определение времени заготовки листьев левзеи сафлоровидной / А. А. Карусевич, Д. В. Моисеев, Г. Н. Бузук // Вестник фармации. - 2008. - № 1 (39). - С. 24-28.
15. Карусевич, А. А. Использование оксида алюминия при идентификации 20-ги-дроксиэкдизона в листьях левзеи сафлоро-видной с помощью тонкослойной хроматографии / А. А. Карусевич, Г. Н. Бузук // Вестник фармации. - 2011. - № 4 (54). -С. 5-12.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра фармакогнозии c курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8(0212) 37-09-29, Бузук Г.Н.
Поступила 13.01.2016 г.
С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач
СТАБИЛЬНОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ ВАГИНАЛЬНЫХ СУППОЗИТОРИЕВ
С НАНОЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
В статье представлены результаты исследования стабильности опытно-промышленных серий суппозиториев с наночастицами серебра и безопасности их применения. В работе использовали методы фармацевтико-технологических испытаний, биологический метод определения минимальной ингибирующей и минимальной бактерицидной концентрации, а также метод атомно-эмиссионного определения металлов в биологических объектах.
Установлено, что методика определения подлинности повиаргола в суппозиториях является специфичной и робастной при изменении объема реактивов (кислоты хлористоводородной Р1 в пределах 0,3±0,05 мл, раствора аммиака разведенного Р1 в пределах 3,0±0,5 мл, раствора аммиака Р в пределах 15±3 мл и раствора формальдегида Р в пределах 23±5 капель), времени центрифугирования и воздействия ультразвука (15±3 минуты). Доказано, что на результаты количественного определения повиаргола в суппозиториях не оказывает влияния изменение объема растворителя (24±5 мл), кислоты азотной (5±1 мл) и времени воздействия ультразвука (15±3 минуты).
Показано, что в процессе хранения в течение 12 месяцев остаются неизменными показатели микробиологической стабильности и качественных реакций на фармацевтическую субстанцию. Статистически значимо не изменяются время распадаемости, однородность дозирования, количественное содержание повиаргола и антимикробная активность лекарственного средства. Незначительными являются изменения цвета и средней массы суппозиториев.
Установлено, что серебро и лантан не всасываются в кровь и не накапливаются в печени в статистически значимых количествах при вагинальном применении в течение 10 суток.
Ключевые слова: суппозитории, наночастицы серебра, повиаргол, стабильность, безопасность, валидация.
ВВЕДЕНИЕ
В рамках работы по созданию вагинальных суппозиториев «Арвагин» с нано-частицами серебра (повиаргол), обладающих антимикробным и ранозаживляющим действием, Витебским государственным медицинским университетом совместно с ООО «Рубикон» разработаны состав и технология лекарственного средства, проведена апробация технологии получения суппозиториев на технологическом оборудовании предприятия [1]. Определены условия для пробоподготовки суппозиториев, разработана и валидирована методика определения повиаргола в лекарственном средстве [2-4]. Следующим этапом работы были валидация методики определения подлинности повиаргола, валидация методики количественного определения по показателю робастность, изучение стабильности и безопасности разработанного лекарственного средства.
Изучение стабильности позволяет получить данные о влиянии на качество лекарственного средства используемых материалов, вида первичной и вторичной упаковки, различных факторов окружающей среды, установить сроки годности и регламентировать условия хранения [5]. Для изучения лекарственных средств применяют 2 вида испытаний - долгосрочные и ускоренные. Долгосрочные проводятся в режиме реального времени при тех условиях хранения, при которых предполагается хранить лекарственное средство. Ускоренные испытания позволяют за более короткое время установить его срок годности за счет более жестких условий хранения (температура, влажность), но именно из-за них этот метод практически не используется при испытаниях суппозиториев, поскольку при температуре около 40 градусов большинство из них плавятся [6].
Для вагинальных суппозиториев с на-ночастицами серебра проводились только долгосрочные испытания, но были выбраны 2 температурных режима: 8°С и 25°С. Это было сделано для того, чтобы определить, можно ли хранить разработанные
суппозитории без холодильника при комнатной температуре.
При испытании безопасности суппозиториев было важно определить, происходит ли всасывание в кровь и накопление в организме серебра и лантана, входящего в состав суппозиториев в виде повиаргола и лантана нитрата [1].
Целью настоящей работы было вали-дировать методики определения повиарго-ла в суппозиториях по показателям специфичность и робастность, оценить стабильность и безопасность суппозиториев с наночастицами серебра.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования использовали опытно-промышленные серии суппозиториев Арвагин №010115, №020115 и №030115, произведенных в условиях ООО «Рубикон» [1].
Суппозитории каждой серии маркировали и помещали в холодильник для хранения при температуре 8°С и в помещение с контролируемой температурой 25°С. Пробы отбирали каждые 3 месяца.
Опытно-промышленные серии суппозиториев испытывали по следующим показателям: описание лекарственного средства, распадаемость суппозиториев, однородность массы для единицы дозированного лекарственного средства, однородность содержания действующего вещества в единице дозированного лекарственного средства, микробиологическая чистота [4].
Подлинность повиаргола определяли качественными реакциями:
1 - При прибавлении кислоты хлористоводородной Р1 наблюдали белый творожистый осадок, растворяющийся при прибавлении 3 мл раствора аммиака разведенного Р1.
2 - На стенках пробирки образуется блестящий налет металлического серебра при реакции с раствором аммиака Р и раствором формальдегида Р.
При валидации методики определения подлинности повиаргола в суппозиториях по показателю специфичность проводили
качественные реакции с каждым из компонентов суппозиториев по отдельности (по-виаргол, лантана нитрат, макрогол 1000). При валидации методики определения подлинности повиаргола в суппозиториях по тесту робастность изучали влияние на результаты испытаний времени воздействия ультразвука и центрифугирования (12, 15 и 18 минут). Для качественной реакции №1 изучали влияние на результаты испытания объемов кислоты азотной Р (8,0, 10,0, 12,0 мл), кислоты хлористоводородной Р1 (0,25, 0,30, 0,35 мл) и раствора аммиака разведенного Р1 (2,5, 3,0, 3,5 мл). Для качественной реакции №2 - раствора аммиака Р (12,0, 15,0, 18,0 мл) и раствора формальдегида Р (18, 23 и 28 капель).
Количественное определение повиаргола проводили методом роданометри-ческого титрования [2]. Робастность методики доказывали путем определения влияния объема среды растворения (19,0, 24,0 и 29,0 мл), объема кислоты азотной Р (5,0, 6,0 и 7,0 мл) и времени воздействия ультразвука (12, 15 и 18 минут) на ее прецизионность и правильность.
При исследовании микробиологической чистоты суппозиториев антимикробное действие лекарственного средства нейтрализовали путём промывания мембраны тремя порциями по 100 см3 фосфатного буферного раствора pH 7,2. (2.6.12, 2.6.13, 5.1.4 категория 2) [4].
Изучение биологической активности проводили путем установления минимальной ингибирующей и минимальной бактерицидной концентрации (МИК и МБК) суппозиториев. В исследовании использовали стандартные типовые штаммы микроорганизмов из коллекции АТСС: грамположи-тельный вид Staphylococcus aureus, грамо-трицательный вид Pseudomonas aeruginosa и дрожжеподобный гриб Candida albicans.
При изучении МИК в ряду из 10 пробирок двукратно разводили рабочий раствор, полученный растворением 1 суппозитория в 15 мл воды Р, в жидкой среде Мюл-лер-Хинтон. В каждую пробирку вносили 0,2 мл взвеси суточной бульонной культуры Escherichia coli с величиной посевной дозы 109 КОЕ/мл. Пробирки инкубировали при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Эксперимент проводили в трех повторах в разные дни. Результаты изучения оценивали визуально, определяя наличие или отсутствие роста микроорганизмов в
среде, содержащей различные концентрации испытуемого соединения. Последняя пробирка ряда с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует МИК в отношении данного штамма.
Бактерицидную концентрацию определяли путем посева на агар содержимого из 3-5 последних пробирок ряда с отсутствием видимых признаков роста микроорганизмов. После оптимального для каждого микробного вида срока инкубации посевов отмечали наименьшую концентрацию вещества в пробирке, посев из которой не дал роста. Эту концентрацию принимали за МБК [7].
Изучение стабильности опытно-промышленных серий суппозиториев с пови-арголом проводили в течение 12 месяцев.
Для оценки безопасности суппозиториев изучали степень всасывания металлов в кровь и их накопление в печени. Исследование выполняли на 16 белых рандомбредных крысах-самках, которых содержали согласно правил GLP в стандартных условиях вивария при температуре +24-25°С. Придерживались требований Директивы Совета ЕС по вопросам защиты животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [8, 9].
Оценивали всасывание серебра и лантана при вагинальном введении в течение 10 суток. Экспериментальных животных разбили на 2 группы (по 8 самок в каждой). Опытной группе 2 раза в день вагинально вводили модельный суппозиторий (54 мг), представляющий собой 1:56 часть целого суппозитория. Животным 2 группы 2 раза в день вводили 54 мг макрогола 1000 [9].
Через 10 суток животных выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. У каждого отбирали кровь и печень для анализа.
Содержание металлов определяли атомно-эмиссионным методом в НПО "Бе-линтераналит" [10].
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel и Statistica 10.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По тесту робастность была валидиро-вана методика количественного определения повиаргола в суппозиториях. Установлено, что объем растворителя (в интервале от 19 до 29 мл), объем добавленной кисло-
ты азотной (в интервале от 5 до 7 мл) и время воздействия ультразвука (в интервале от 12 до 18 минут) статистически значимо не влияли на результаты определения фармацевтической субстанции (RSD составляет 0,857%, 0,757%, 0,900% соответственно при критерии приемлемости не больше 1%. Процент восстановления находился в пределах 99,6-101,5% при критерии приемлемости 98,0-102,0%).
При валидации методики определения подлинности доказана ее специфичность. При проведении реакции между лантана нитратом и макроголом (компоненты суп-позиторной основы) с кислотой хлористоводородной не выделяется белый творожистый осадок, а в реакции «серебряного зеркала» не образуется налет металлического серебра. При исследовании робастности методики установлено, что на результаты испытания подлинности повиаргола в суппозиториях с кислотой хлористоводородной не влияет объем реактива в пределах 8-12 мл для кислоты азотной Р, в пределах 0,25-0,35 для кислоты хлористоводород-
ной Р1 и в пределах 2,5-3,5 мл для раствора аммиака разведенного Р1. На результаты испытания подлинности повиаргола в суппозиториях с помощью реакции «серебряного зеркала» не оказывает влияние изменение объема раствора аммиака Р в пределах 12-18 мл и раствора формальдегида Р в пределах 18-28 капель. На результаты испытаний с помощью обеих реакций не оказывает влияния изменение времени воздействия ультразвука и центрифугирования в интервале 12-18 минут.
При исследовании стабильности опытно-промышленных серий суппозиториев с повиарголом, приготовленных по разработанной технологической схеме, установлено, что время и условия хранения лекарственного средства не оказывают влияния на протекание реакций подлинности на повиаргол. Статистически значимо не изменяется время распадаемости, однородность содержания действующего вещества в единице дозированного лекарственного средства, а также количественное содержание повиаргола (р>0,05) (таблица 1).
Таблица 1 - Влияние срока и условий хранения на показатели качества суппозиториев _с наночастицами серебра_
Температура хранения 8°С
Контролируемые показатели Спецификация Срок хранения, месяцы
0 3 6 9 12
Распадаемость Не более 30 минут, (п=3) 23±1 22±1 23±1 23±1 23±1
23±1 23±1 22±1 23±1 23±1
23±1 22±1 23±1 23±1 23±1
Однородность дозированных единиц АУ<15, (п=10) 3,29 3,22 3,26 3,11 3,08
3,12 3,19 3,32 3,10 3,00
3,32 3,23 3,22 3,21 3,12
Количественное определение повиаргола 76,5-103,5, (п=10) 90,0-91,5 89,4-91,0 90,3-91,9 89,6-91,2 90,0-91,5
90,0-91,5 89,4-91,0 90,3-91,9 89,6-91,2 90,0-91,5
90,0-91,5 89,4-91,0 90,3-91,9 89,6-91,2 90,0-91,5
Температура хранения 25°С
Контролируемые показатели Спецификация Срок хранения, месяцы
0 3 6 9 12
Распадаемость Не более 30 минут, (п=3) 22±1 23±1 23±1 23±1 23±1
23±1 23±1 23±1 23±1 23±1
23±1 23±1 23±1 23±1 23±1
Однородность дозированных единиц АУ<15, (п=10) 3,29 3,28 3,31 3,30 2,96
3,22 3,30 3,30 3,29 3,18
3,29 3,27 3,27 3,26 3,23
Количественное определение повиаргола 76,5-103,5, (п=10) 90,0-91,5 89,4-91,0 90,3-91,9 89,6-91,2 90,0-91,5
90,0-91,5 89,4-91,0 90,3-91,9 89,6-91,2 90,0-91,5
90,0-91,5 89,4-91,0 90,3-91,9 89,6-91,2 90,0-91,5
При изучении стабильности определено, что на протяжении всего времени наблюдения антимикробный эффект суппозиториев оставался неизменным, показатели МИК и МБК не изменялись (p>0,05) (таблица 2).
Установлено, что во всех трех параллельных испытаниях все штаммы микроорганизмов показывали одинаковую чувствительность к лекарственному средству.
Показано, что все серии суппозиториев выдерживали требования ГФ РБ по общему количеству аэробных бактерий и грибов (не более 102 в 1 г), количеству энтеробакте-рий и других грамотрицательных бактерий (101 в 1 г) при температуре хранения 8°С и 25°С. В образцах полностью отсутствовали микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.
Установлено, что сразу после приготовления суппозитории имеют оливково-зеленый цвет. При хранении их при температуре 8°С цвет становится более темным,
приобретает коричневый оттенок, а при температуре 25°С цвет суппозиториев изменяется на темно-коричневый. Эти изменения цвета допускаются проектом фармакопейной статьи предприятия.
При исследовании однородности массы определено, что отклонения от средней массы суппозиториев всех серий остаются в пределах 0,12%, при допустимых отклонениях, составляющих 5%. Отмечено незначительное увеличение средней массы суппозиториев к 3-у месяцу наблюдений (р<0,05). При температуре хранения 8°С это увеличение к 12 месяцу хранения составляет 1,9%, а при хранении при 25°С -1,4% (рисунок).
Таким образом, изменение цвета суппозиториев и увеличение средней массы не являются значительными изменениями и не оказывают существенного влияния на количественное содержание действующего вещества, биологическую активность и другие показатели качества.
Таблица 2 - Влияние времени хранения на антимикробную активность суппозиториев __с повиарголом (п=3)_
Вид микроорганизма Время наблюдения, месяцы
0 3 6 9 12
Candida albicans МИК 0,06 0,13 0,13 0,13 0,13
МБК 0,13 0,25 0,25 0,25 0,25
Staphylococcus aureus МИК 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016
МБК 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13
Pseudomonas aeruginosa МИК 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
МБК 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13
Рисунок - Зависимость средней массы суппозиториев от времени и условий
58
хранения
Для выбора подходящих методов определения статистической значимости различий между средними значениями содержания тяжелых металлов в биологических объектах проверялись гипотезы о нормальности распределения полученных данных.
Тестирование гипотезы о нормальности распределения концентраций серебра в образцах крови и печени животных при помощи теста Шапиро-Уилка показало, что для контрольных групп оно статисти-
Установлено, что не обнаружено достоверных различий между содержанием серебра и лантана у животных, получавших эти тяжелые металлы в составе суппозиториев, и животными контрольной группы (р>0,05). Это свидетельствует о том, что серебро и лантан не всасываются в кровь и не накапливаются в печени в статистически значимых количествах при их вагинальном применении в течение 10 суток, что свидетельствует о безопасности разработанных суппозиториев при соблюдении указаний по применению.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Доказано, что методика определения подлинности повиаргола в суппозиориях является специфичной и робастной к изменениям количества реактивов: кислоты азотной Р в пределах 10,0±2,0 мл, кислоты хлористоводородной Р1 в пределах 0,3±0,05 мл, раствора аммиака разведенного Р1 в пределах 3,0±0,5 мл, раствора аммиака Р в пределах 15,0±3,0 мл и раствора формальдегида Р в пределах 23±5 капель. Изменение времени воздействия ультразву-
чески значимо отличается от нормального. Поэтому для оценки достоверности различий между контрольными и опытными группами при определении серебра использовали критерий Манна-Уитни.
Тестирование гипотезы о нормальности распределения концентраций лантана во всех случаях показало, что выборки статистически значимо не отличались от нормального. В связи с этим для их статистической обработки применяли критерий Фишера (таблица 3).
ка и центрифугирования в пределах 15±3 минуты не оказывает влияния на результаты испытаний. Установлено, что методика количественного определения повиаргола в суппозиториях является робастной при изменении объема растворителя в пределах 24,0±5,0 мл, объема кислоты в пределах 6,0±1,0 мл и времени воздействия ультразвука в пределах 15±3 минуты.
Определено, что условия и срок хранения суппозиториев в течение 12 месяцев не влияют на протекание качественных реакций на фармацевтическую субстанцию и микробиологическую чистоту. Показано, что не происходит статистически значимых изменений в показателях однородности дозирования, количественном содержании и времени распадаемости суппозиториев с наночастицами серебра (p>0,05). Определено, что опытно-промышленные серии суппозиториев с наночастицами серебра в течение 12 месяцев сохраняют свои антимикробные свойства по отношению к Candida albicans, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Установлено, что изменения цвета и средней массы суппозиториев не являются значительными.
Таблица 3 - Всасывание наночастиц серебра и лантана при интравагинальном введении
Серебро Лантан
Кровь Печень Кровь Печень
Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт
Границы определения металла, мкг/кг 0-205 5-307 2-188 9-131 0-26 5-21 1-40 4-25
Среднее содержание металла, мкг/кг 101 76 34 101 15 9 17 19
р-значение по критерию Шапиро-Уилка 0,017 0,284 0,001 0,480 0,155 0,467 0,248 0,884
р-значение при оценке достоверности различий выборки 0,637 0,074 0,133 0,742
Показано, что серебро и лантан не всасываются в кровь и не накапливаются в печени в статистически значимых количествах при вагинальном применении в течение 10 суток.
SUMMARY
S. E. Rzheussky, V. V. Kuhach STABILITY AND SECURITY OF VAGINAL SUPPOSITORIES WITH SILVER NANOPARTICLES
The article presents the results of stability and safety studies of pilot industrial suppositories series which contain silver nanoparticles. The methods of pharmaceutical and technological tests were used in this work, as well as biological method for determining the minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations, and atomic-emission method of determination of metals in biological objects.
It was found out the method of determining the authenticity of suppositories Poviar-gol is specific and robust when changing the quantity of reagents (P1 hydrochloric acid within 0,3±0,05 ml diluted ammonium solution P1 within 3,0±0,5 ml, ammonium solution P within 15±3 and formaldehyde solution P within 23±5 drops), centrifugation time and ultrasound treatment (15±3 minutes). It was proved that the results of the quantitative determination of Poviargol suppositories are not affected by the change of the volume of solvent (24±5 ml), nitric acid (5±1 ml) and the ultrasound exposure time (15±3 minutes).
It was shown that during 12-months storage microbiological stability and qualitative responses to pharmaceutical substance indicators remained unchanged. Disintegration time, content uniformity, quantitative content of Poviargol and antimicrobial activity of the drug did not alter statistically. Minor changes affected the color and the average weight of suppositories. It was established that for vaginal application for 10 days silver and lanthanum are not absorbed into the bloodstream and do not accumulate in liver in a statistically significant quantities.
Keywords: suppositories, silver nanopar-ticles, Poviargol, stability, security, validation.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ржеусский, С. Э. Разработка вагинальных суппозиториев с наночастицами серебра / С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач //
Вестник фармации. - 2015. - №2 (68). -С. 40-45.
2. Ржеусский, С. Э. Количественное определение повиаргола в суппозиториях / С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач, В. И. Фадеев // Вестник фармации. - 2015. №3 (69). -С.60-65.
3. ТКП 432-2012 (02041) Производство лекарственных средств. Валидация методик испытаний.
4. Государственная фармакопея Республики Беларусь: в 2-х т. / под общ. ред.
A. А. Шерякова.-Молодечно: Победа,2012.-Т. 1: Общие методы контроля лекарственных средств. - 1220 с.
5. Основные подходы к изучению стабильности лекарственных средств: отечественный и международный опыт / И. В. Сакаева [и др.] // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. - 2013. - №3. - С. 8-10.
6. МУ 09140.07-2004. Методические указания. Изучение стабильности и установление сроков годности новых субстанций и готовых лекарственных средств.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией
B. П. Фисенко. - М.: Информационно-издательское агентство «Ремедиум», 2000. - 399 с.
8. ТКП 125-2008 (02040). Надлежащая лабораторная практика - Минск: М-во здравоохранения Респ. Беларусь, 2008. - 34 с.
9. Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р. У Хар-биева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.
10. Инструкция 4.1.10-14-24-2005 Лаборатории медицинские. Определение содержания химических элементов в биологических материалах атомно-эмиссион-ным методом: утв. Гл. гос. санитар. врачом Респ. Беларусь 09.08.2005.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра организации и экономики фармации с курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8 (0212) 60-14-08, Ржеусский С.Э.
Поступила 22.01.2016 г.
