CC BY
126. Производство лекарственных средств. Применение статистических методов валидации: ТКП 438 - 2012 (02041) - Введ. 01.03.2013. - Минск: Департамент фармацевтической промышленности Министерства здравоохранения Республики Беларусь, 2012. - 27 с.
7. Государственная фармакопея Республики Беларусь: в 3-х т. / под общ. ред. А. А. Шерякова. - Молодечно: Победа. -2008. - Т. 3: Контроль качества фармацевтических субстанций. - С. 699 - 701.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра промышленной технологии с курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8 (0212) 37-00-13, ysheryakova@mail.ru, Хишова О. М.
Поступила 31.07.2015 г.
С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач, В. И. Фадеев КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОВИАРГОЛА В СУППОЗИТОРИЯХ Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
В статье представлены результаты разработки и валидации методики рода-нометрического определения повиаргола в суппозиториях.
Выбрана среда растворения и способ интенсификации процесса, установлен срок годности титранта и рабочего раствора.
Разработанная методика валидирована по показателям: избирательность, линейность (коэффициент корреляции в уравнении линейной регрессии составляет 0,9998, отклонения найденных концентраций от теоретически рассчитанного содержания не превышают 0,67%), повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (относительное стандартное отклонение для одного аналитика составляет 0,895%, для второго — 0,901%, а для двух испытаний, проведенных в разные дни — 0,908%), правильность (правильность определения повиаргола в суппозиториях находилась в диапазоне 99,37—101,30%; среднее значение составило 100,21%). Установлен диапазон применения методики, который составляет 70—130% от номинального содержания повиаргола в суппозитории.
Ключевые слова: суппозитории, наночастицы серебра, повиаргол, титрование, валидация.
ВВЕДЕНИЕ
Перспективным направлением в медицине является разработка новых лекарственных средств антибактериального действия [1]. Потребность в них постоянно увеличивается в связи с повышением бактериальной резистентности к существующим лекарственным средствам [2].
Витебским государственным медицинским университетом, совместно с ООО "Рубикон", разрабатывается новое лекарственное средство, представляющее собой суппозитории с повиарголом, обладающим антимикробной и ранозаживляющей активностью. В качестве фармацевтической субстанции в суппозиториях используется
металл-полимерная композиция, содержащая высокодисперсное металлическое серебро.
Одним из этапов создания нового лекарственного средства является разработка методики анализа действующих веществ, входящих в его состав. Теме анализа на-ночастиц посвящена большая доля современных публикаций по нанотехнологии [3]. Для определения количественного содержания серебра предлагаются электрохимический [3, 4], рентгенофлюоресцент-ный [5], потенциометрический [6] и даже спектрофотометрический методы анализа [7]. Однако для определения серебра в лекарственном средстве в наибольшей степени подходит простой и надежный метод
роданометрического титрования, описанный в Государственной фармакопее Республики Беларусь в качестве метода количественного определения серебра протеина-та (протаргол) и серебра коллоидного для наружного применения (колларгол) [8].
Целью настоящей работы была разработка и валидация методики количественного определения повиаргола в суппозиториях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали опытно-промышленные серии суппозиториев с повиарголом (НД №1781/13).
Опытно-промышленные серии суппозиториев готовили по следующей технологии: в смесителе на водяной бане при температуре 60-650С расплавляли компоненты суппозиторной основы, охлаждали ее до температуры 40-420С и добавляли повиаргол. Смесь перемешивали в течение 15 мин при помощи диспергатора Ultra-turrax T50 при скорости вращения мешалки 6000 оборотов в минуту. Готовую суп-позиторную массу разливали в одноразовые ячейки и запаивали их при помощи аппарата Dott Bonapace 8C. Охлаждение готовых суппозиториев проводили при температуре 15°С в течение 15 минут [9].
Количественное содержание серебра в фармацевтической субстанции и суппозиториях определяли с помощью родано-метрического титрования. Для перевода наночастиц серебра в ионную форму использовали азотную кислоту.
Для приготовления 0,1М раствора аммония тиоцианата 7,612 г аммония тио-цианата Р растворяли в воде Р и доводили до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Для установления титра раствора к 20,0 мл 0,1М раствора серебра нитрата прибавляли 25 мл воды Р, 2 мл кислоты азотной разведенной Р, 2 мл раствора железа (III) аммония сульфата Р2 и титровали приготовленным раствором аммония тиоцианата до появления красновато-желтого окрашивания [10].
Для приготовления 0,01М раствора аммония тиоцианата в мерную колбу вместимостью 100 мл вносили 10 мл 0,1М раствора аммония тиоцианата и доводили до метки водой Р.
Для определения условий проведения пробоподготовки изучали влияние приро-
ды растворителя (вода очищенная и азотная кислота), воздействия ультразвука и степени измельчения суппозиториев.
Методику определения повиаргола в суппозиториях валидировали по показателям: специфичность, линейность, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность, правильность и диапазон применения, согласно ТКП 432-2012 (02041) Производство лекарственных средств. Валидация методик испытаний [11] и Государственной фармакопее Республики Беларусь [10].
Специфичность методики изучали, титруя раствор, полученный в процессе про-боподготовки суппозиториев, и раствор плацебо, содержащий только вспомогательные вещества.
Определение линейности методики проводили для 8 уровней содержания повиаргола: 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130% от его номинального количества (90 мг).
Повторяемость изучали на 6 образцах суппозиториев с повиарголом. Для определения внутрилабораторной прецизионности 6 суппозиториев той же серии были проанализированы другим аналитиком в другой день.
Правильность изучали на модельных растворах, содержащих повиаргол в количестве 70%, 100% и 130% от номинального содержания.
Диапазон применения устанавливали исходя из того, что валидируемая методика имеет приемлемую степень линейности, прецизионности и правильности при анализе образцов с количественным содержанием повиаргола в диапазоне валидируе-мой методики. Использовали результаты из следующих тестов:
- избирательность;
- линейность;
- прецизионность;
- правильность.
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение условий проведения пробоподготовки суппозиториев. На
первом этапе были определены условия проведения пробоподготовки суппозиториев. Показано, что суппозитории повиар-гола быстрее растворялись в воде Р, чем в кислоте азотной Р (р<0,05). Определено,
что воздействие ультразвука позволяет в 5,9-6,0 раз сократить время растворения суппозиториев. Установлено, что среда растворения и воздействие ультразвука статистически значимо не влияли на высвобождение повиаргола из лекарственной формы (р>0,05) (таблица 1).
Следовательно, пробоподготовку необходимо осуществлять следующим образом: в химический стакан вместимостью 100 мл поместить 1 суппозиторий, прибавить 24 мл воды Р и воздействовать ультразвуком в течение 15 минут. К полученному раствору необходимо прибавить 6 мл кислоты азотной Р.
Таблица 1 - Исследование вариантов пробоподготовки суппозиториев повиаргола (п=3)
Среда растворения Целый суппозиторий Разделение суппозитория на 5-7 частей Ультразвук
Время растворения, мин Содержание повиаргола, % Время растворения, мин Содержание повиаргола, % Время растворения, мин Содержание повиаргола, %
Вода очищенная, 24 мл 65,3±3,5 99,8±1,0 45,3±5,5 99,8±1,0 11,7±0,6 99,8±1,0
Кислота азотная Р, 30 мл 81,0±5,6 100,3±1,0 57,7±6,4 99,8±1,0 13,3±0,6 99,8±1,0
Определение устойчивости рабочего раствора. Была изучена стабильность растворов, получаемых из суппозиториев повиаргола в процессе пробоподготовки (рисунок 1). За 100% была принята номинальная концентрация повиаргола, согласно нормативной документации (90 мг).
Определено, что водные растворы, полученные из суппозиториев повиаргола в процессе пробоподготовки, остаются стабильными в течение 3 часов (р = 0,423 через 3 часа и р = 0,038 через 4 часа), в то время как в растворе кислоты азотной уже через 2 часа наблюдается статистически значимое падение концентрации (р = 0,1835 через 1,5 часа и р = 0,0378 через 2 часа).
Определение стабильности раствора титранта. В результате исследования стабильности раствора аммония тиоцианата установлено, что при его хранении без доступа света он остается стабильным в течение 20 суток (снижение концентрации к 20 суткам эксперимента статистически не достоверно, р>0,05). При хранении раствора на свету изменение концентрации происходит уже через 15 суток (р = 0,013) (рисунок 2).
Определение специфичности методики. Показано, что разработанная методика определения повиаргола является специфичной, поскольку при добавлении 1 капли титранта раствор плацебо сразу менял окраску. При добавлении титранта к раствору, полученному в процессе пробопод-готовки суппозиториев, изменение окраски происходило при прибавлении 5,7-5,8 мл.
Определение линейности методики.
При исследовании линейности установлено, что график зависимости объема титран-та от массы навески представляет собой прямую линию. Коэффициент корреляции в уравнении линейной регрессии составляет 0,9998 (при норме не менее 0,999), пересечение с осью У - 0,25% (при критерии приемлемости не более 3%) (рисунок 3).
Показано, что отклонения найденных концентраций повиаргола от теоретически рассчитанного содержания не превышают 0,67% (таблица 2).
Определение повторяемости методики. Определено, что относительное стандартное отклонение в тесте повторяемость составляет 0,895% (критерий приемлемости не более 1%). При исследовании внутрила-бораторной прецизионности значение данного показателя для второго аналитика составило 0,901%, а для двух испытаний, проведенных в разные дни - 0,908% (критерий приемлемости не более 2%) (таблица 3).
Определение правильности методики. Показано, что правильность определения повиаргола в суппозиториях находилась в диапазоне 99,4-101,3%, а среднее значение составляло 100,2% (при норме 100±1%) (таблица 4).
Таким образом, установлен диапазон применения методики количественного определения повиаргола в суппозиториях в пределах 70-130% от его номинального содержания, поскольку в этом диапазоне разработанная методика имеет приемлемую степень линейности, прецизионности и правильности.
Время хранения, мин
Рисунок 1 - Влияние среды растворения на стабильность растворов, получаемых из суппозиториев с повиарголом в процессе пробоподготовки (n = 3)
Время хранения, дни
Рисунок 2 - Влияние условий хранения на стабильность 0,01М раствора аммония
тиоцианата
Рисунок 3 - Зависимость объёма титранта, пошедшего на титрование, от массы навески
63
Таблица 2 - Результаты исследования линейности методики количественного _определения повиаргола в суппозиториях_
Концентрация повиаргола от номинального содержания, % Рассчитанное содержание повиаргола, мг Полученное содержание повиаргола в образце, мг Отклонение точек от калибровочной прямой, %
60 0,0541 0,0543 0,35
70 0,0639 0,0636 0,45
80 0,0712 0,0713 0,20
90 0,0812 0,0807 0,67
100 0,0894 0,0900 0,63
110 0,0991 0,0992 0,17
120 0,1085 0,1086 0,07
130 0,1171 0,1163 0,66
Таблица 3 - Результаты исследования прецизионности методики количественного
определения повиаргола в суппозиториях
№ определения
1 2 3 4 5 6
Аналитик №1
Масса навески, мг 89,4 89,8 89,8 91,3 90,4 90,1
Объем титранта, мл 5,80 5,80 5,70 5,70 5,80 5,80
Содержание повиаргола, мг 90,0 90,0 88,4 88,4 90,1 90,1
RSD аналитика №1, % 0,895
Аналитик №2
Масса навески, мг 90,5 89,9 89,2 91,0 90,7 90,3
Объем титранта, мл 5,80 5,70 5,70 5,80 5,70 5,70
Содержание повиаргола, мг 90,0 88,4 88,4 90,0 88,4 88,4
RSD аналитика №2, % 0,901
RSD между результатами двух аналитиков, % 0,908
Таблица 4 - Результаты изучения правильности методики количественного определения _повиаргола в суппозиториях_
Образец Масса навески образца повиаргола, мг Объем титранта, мл Процент восстановления (98,0-102,0%)
70% 0,0718 4,60 99,4
0,0718 4,60 99,4
0,0712 4,60 100,2
100% 0,09 5,80 100,0
0,089 5,80 101,1
0,0898 5,80 100,2
130% 0,1179 7,70 101,3
0,1174 7,60 100,4
0,1179 7,60 100,0
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате работы выбраны условия для пробоподготовки суппозиториев пови-аргола: вода в качестве среды растворения и ультразвук как средство интенсификации процесса растворения. Установлено, что раствор титранта остается стабильным
в течение 20 суток при его хранении без доступа света.
Определено, что валидируемая методика по всем показателям соответствует требованиям ТКП и Государственной фармакопеи Республики Беларусь. Коэффициент корреляции в уравнении линейной регрессии составляет 0,9998, отклонения
найденных концентраций от теоретически рассчитанного содержания не превышают 0,67%. Относительное стандартное отклонение в тесте повторяемость для одного аналитика составляет 0,895, для второго -0,901%, а для двух испытаний, проведенных в разные дни - 0,908%. Правильность определения повиаргола в суппозиториях находилась в диапазоне 99,4-101,3%, среднее значение составляло 100,21%.
Определен диапазон применения методики, составляющий 70-130% от номинального содержания повиаргола в суппозиториях.
SUMMARY
S. E. Rzheussky, V. V. Kuhach, V. I. Fadeev QUANTIFYING OF POVIARGOL IN SUPPOSITORIES
The article presents the results of the development and validation of methods of titrimetric determination of Poviargol in suppositories.
Dissolution medium and a method of intensifying the process were selected, the shelf life of the titrant and the working solution was determined.
The developed method was validated in terms of: selectivity, linearity (correlation factor in the equation of linear regression is 0,9996, deviation of found concentrations from the theoretically calculated content does not exceed 0,67%), repeatability, intermediate precision (relative standard deviation for one analyst is 0,895%, for the second - 0,901%, and for the two tests carried out on different days - 0,908%), accuracy (accuracy of the determination of Poviargol in suppositories was in the range 99,37-101,30%, and the average value was 100,21%). The range of application of a technique, which is 70-130% of the nominal content of Poviargol in suppositories, was determined.
Keywords: suppositories, silver nanopar-ticles, Poviargol, titration, validation.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bashar, H. The antibiotics market / H. Bashar // Drug Discovery. - 2010. -С. 675-676.
2. Колбин, А. С. Исследования в области новых антибактериальных средств - есть ли перспективы? / А. С. Колбин, С.
B. Сидоренко, Ю. Е. Балыкина // Педиатрическая фармакология. - 2010. - Том 7. -
C. 12-15.
3. Разработка вольтамперометрическо-го определения железа и серебра для оценки степени деградации наночастиц на их основе / Г. Б. Слепченко [и др.] // Известия Томского политехнического университета. - 2011. - №3. - С. 46-49.
4. Электрохимический метод определения концентрации наночастиц серебра и золота в живых клетках / Ю.А. Сунцова [и др.] // Ученые записки казанского университета. - 2012. - Том 153, кн. 3. - С. 105-115.
5. Юсупов, Р. А. Методика выполнения измерений концентрации серебра в технологических водах предприятия / Р. А. Юсупов, С. А. Бахтеев, И. Р. Гатиятуллин // Вестник Казанского технологического университета. - 2011. - №19. - С. 306-308.
6. Шумар, С. В. Потенциометрическое определение серебра с использованием математической модели процесса / С. В. Шумар // Известия Томского политехнического университета. - 2012. - №3. -С. 116-119.
7. Карпов, С. Оптические эффекты в металлических наноколлоидах / С. Карпов // Фотоника. - 2012. - №2. - С. 40-51.
8. Государственная фармакопея Республики Беларусь. В 3 т. Т. 3.Контроль качества фармацевтических субстанций / М-во здравоохранения. Респ. Беларусь, УП "Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении"; под общ. ред. А.А. Шерякова. - Молодечно; Типография "Победа", 2009. - 728 с.
9. Ржеусский, С. Э. Разработка вагинальных суппозиториев с наночастицами серебра / С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач // Вестник фармации. - 2015. - №2. - С. 40-45.
10. Государственная фармакопея Республики Беларусь: в 2-х т. / под общ. ред. А.А. Шерякова. - Молодечно: Победа, 2012. - Т. 1: Общие методы контроля лекарственных средств. - 1220 с.
11. ТКП 432-2012 (02041) Производство лекарственных средств. Валидация методик испытаний.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра организации и экономики фармации с курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8 (0212) 60-14-08, Ржеусский С. Э.
Поступила 31.07.2015 г.
