Научная статья на тему 'Стабилизация поликатионом LysK - фермента, лизирующего клетки Staphylococcus aureus'

Стабилизация поликатионом LysK - фермента, лизирующего клетки Staphylococcus aureus Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
67
11
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ / BACTERIOPHAGE LYTIC ENZYME / LYSK / СТАФИЛОКОККОВЫЕ ИНФЕКЦИИ / СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ / ENZYME STABILIZATION / ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТЫ / POLYELECTROLYTES / ПОЛИБРЕН / STAPHYLOCOCCUS INFECTIONS / POLYBRENE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Филатова Любовь Юрьевна, Беккер С.С., Донован Д.М., Гладилин Александр Кириллович, Клячко Наталья Львовна

Изучено влияние поликатиона (полибрена) на активность и стабильность LysK фермента, лизирующего клетки Staphylococcus aureus. Обнаружено увеличение стабильности в 10 80 раз при 37°С. Установлено, что стабилизационный эффект определяется числом точечных взаимодействий противоположно заряженных групп фермента и поликатиона.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Филатова Любовь Юрьевна, Беккер С.С., Донован Д.М., Гладилин Александр Кириллович, Клячко Наталья Львовна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Стабилизация поликатионом LysK - фермента, лизирующего клетки Staphylococcus aureus»

КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ УДК 577.152.3:579.234

СТАБИЛИЗАЦИЯ ПОЛИКАТИОНОМ LysK - ФЕРМЕНТА, ЛИДИРУЮЩЕГО КЛЕТКИ Staphylococcus Aureus

Л.Ю. Филатова, С.С. Беккер,* Д.М. Донован,* А.К. Гладилин, Н.Л. Клячко

(кафедра химической энзимологии; e-mail: luhfil@ramhler.ru)

Изучено влияние поликатиона (полибрена) на активность и стабильность LysK - фермента, лизирующего клетки Staphylococcus aureus. Обнаружено увеличение стабильности в 10 - 80 раз при 37°С. Установлено, что стабилизационный эффект определяется числом точечных взаимодействий противоположно заряженных групп фермента и поликатиона.

Ключевые слова: бактериолитический фермент, LysK, стафилококковые инфекции, стабилизация ферментов, полиэлектролиты, полибрен.

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является возбудителем ангины, пневмонии, мастита, флебита, эндокардита и других опасных заболеваний. В настоящее время более 90% штаммов золотистого стафилококка устойчивы к одному и более антибиотикам [1].

Бактериофаги, вирусы бактерий, и их литические ферменты можно рассматривать как потенциальную альтернативу антибиотикам [2, 3]. Фермент LysK продуцируется бактериофагом К при заражении им клеток Staphylococcus aureus [4]. LysK разрушает (ли-зирует) ковалентные связи петидогликанового остова клеточных стенок стафилококков, резистентных к метициллину, ванкомицину и тейкопланину, вызывая их гибель [4, 5]. Основным ограничением для использования LysK в медицине является его низкая стабильность при физиологической температуре (37°).

Данная работа посвящена исследованию взаимодействия LysK с поликатионом (полибреном), а также выявлению особенностей и закономерностей стабилизирующего действия данного соединения на фермент при 37°.

Материалы и методы Материалы

Рекомбинантный фермент, лизирующий клетки Staphylococcus aureus (LysK), был выделен и очищен по методике [4]. Препарат фермента хранили в виде водного раствора (20 мМ трис, pH 7,5) в концентрации 3,5 мг/мл. Препарат автоклавированных клеток Staphylococcus aureus (штамм C 47) предос-

тавлен компанией "Вектор" (г. Новосибирск). Все остальные реагенты произведены фирмой "Sigma" (чистота ~99%).

Методики

Активность фермента определяли по следующей методике. В буфере (pH 7,5), содержащем 20 мМ фосфата калия, готовили суспензию клеток Staphylococcus aureus таким образом, чтобы оптическая плотность была равной 0,6 при длине волны 600 нм. К 0,5 мл суспензии клеток добавляли 5 мкл раствора фермента концентрацией 0,5 мг/мл и проводили измерение уменьшения оптической плотности во времени на спектрофотометре "Ultrospec 2100-pro" с термостатируемым кюветным отделением при температуре 37°С и длине волны 600 нм. Активность фермента определяли по тангенсу угла наклона начального участка на кривой зависимости оптической плотности суспензии клеток от времени.

Комплексы LysK с поликатионом готовили семикратным разбавлением исходного препарата фермента (до концентрации 0,5 мг/мл) раствором полибрена заданной концентрации в 20 мМ трисовом буфере (рН 9). Полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем измеряли активность LysK. Содержание полибрена в конечных растворах составляло 0,001-0,5%.

Для исследования стабильности растворы фермента (с добавлением и без добавления полиэлектролита) концентрацией 0,5 мг/мл инкубировали в выбранные промежутки времени при 37°, затем отбирали аликвоты по 5 мкл для измерения активности.

*Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Animal and Natural Resources Institute, Beltsville Agricultural Research Center, USA.

Ацилирование аминогрупп молекул ЬузК янтарным ангидридом проводили по методике [6]. Степень модификации определяли по методике [7] титрованием аминогрупп молекул ЬузК раствором 2,4,6-тринитро-бензолсульфокислоты.

Результаты и их обсуждение

В литературе подробно описаны комплексы ферментов с полиэлектролитами в водных растворах. Установлено, что такие комплексы образуются спонтанно при смешении компонентов и существуют за счет электростатических взаимодействий между противоположно заряженными группами белка и полииона [8, 9].

Установлено, что значение изоэлектрической точки молекулы ЬузК составляет 8,6. При величине рН < 8,6 молекулы фермента заряжены положительно, а при более высоком значении - отрицательно. Поэтому взаимодействие ЬузК с полибреном исследовали при рН 9, т.е. в условиях, когда фермент и по-лиион противоположно заряжены.

При включении фермента в комплексы с полибре-ном сохраняется активность ЬузК и увеличивается стабильность (рис. 1). На рис. 1 приведены кривые инактивации фермента и фермент-полиэлектролитных комплексов. Показано, что величина стабилизационного эффекта определяется содержанием полиэлектролита в системе, т.е. количеством положительных зарядов на молекулу ЬузК. Через 2 ч инкубации при 37°С фермент без добавок полибрена сохранял 3% активности, в то время как при концентрациях поликатиона 0,001; 0,1 и 0,5% остаточная активность ЬузК достигала уровня 30, 60 и 90% соответственно.

Время, ч

Рис. 1. Стабилизация Ьу8К полибреном. Условия эксперимента: рН 9, Т = 37°С, концентрация фермента 0,5 мг/мл в растворе, содержащем 0 (1); 0,001 (2); 0,1 (3); 0,5 (4) % полиэлектролита

л

Время, ч

Рис. 2. Стабилизация полибреном Ьу8К, модифицированного янтарным ангидридом. Условия эксперимента: рН 9, Т = 37°С, содержание полибрена в растворе 0,1%, концентрация фермента 0,5 мг/мл. Степени модификации молекулы Ьу8К: 0 (1), 30 (2), 50 (3) и 70 (4)%

Остаточная активность фермента в комплексах с по-либреном достигала практически нулевого уровня за отрезок времени, на порядок превышающий время инактивации ЬузК без добавок полиэлектролита. Стабилизирующее действие полибрена можно объяснить тем, что многоточечный характер взаимодействия между молекулами фермента и полибрена способствует закреплению каталитически активной конфор-мации ЬузК.

Для подтверждения данной гипотезы были получены комплексы с полибреном ЬузК, модифицированного янтарным ангидридом. При модификации аминогрупп молекулы фермента янтарным ангидридом увеличивается число отрицательно заряженных групп на ее поверхности и, следовательно, число электростатических контактов с молекулами полииона. При титровании ЬузК тринитробензолсульфокис-лотой было обнаружено, что молекула фермента содержит 20 аминогрупп. На рис. 2 приведены кривые инактивации комплексов ЬузК с полибреном. Степень модификации ЬузК составляла 0, 30, 50 и 70%, содержание полиэлектролита (0,1%) было фиксированным. Из рисунка видно, что чем выше степень модификации, тем больше стабилизационный эффект. Этот факт указывает на важную роль в стабилизации каталитически активной конформации молекулы фермента точечных электростатических взаимодействий противоположно заряженных групп ЬузК и поликатиона. При степени модификации 30-70% стабильность фермента в комплексе с поликатионом возрастает в 3-10 раз по сравнению с немодифицирован-ным ЬузК в комплексе с полибреном и в 20 - 80 раз

ляется закрепление каталитически активной конфор-мации молекулы фермента благодаря многоточечному взаимодействию противоположно заряженныгс групп белковой глобулы и полибрена.

5. Flaherty S.O. et. al. // J. Bacteriology. 2004. 186. P. 2862.

6. Riordan J.F., ValeeB.L. // Meth. Enzymol. 1967. 11. P. 565.

7. FieldsR. // Biochemistry. 1971. 124. P. 581.

8. ChaniotakisN.A. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. 378. P. 89.

9. Iyer P. V., Ananthanarayan L.A. // Process Biochemistry. 2005. 43. P. 1019.

Поступила в редакцию 15.06.09

STABILIZATION BY POLYCATION OF LYSK THE ENZYME LYSING STAPHYLOCOCCUS AUREUS CELLS

L.Yu Filatova, S.C. Becker, D.M. Donovan, A.K. Gladilin, N.L. Klyachko

(Division of Chemical Enzymology)

Influence of polycation (polybrene) on activity and stability of LysK - the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells was investigated. As found, polybrene caused 10-80 times increase of LysK stability at 37°C. Stabilizing effect depended on a number of point interactions of oppositively charged groups of the enzyme and polycation.

Key words: Bacteriophage lytic enzyme, LysK, Staphylococcus infections, Enzyme stabilization, Polyelectrolytes, Polybrene.

Сведения об авторах: Филатова Любовь Юрьевна - сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (lubfil@rambler.ru); Stephen C. Becker - Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Animal and Natural Resources Institute, Beltsville Agricultural Research Center, USA;Dr. Phone: 301-504-9150; fax: 301504-8571; David M. Donovan - Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Animal and Natural Resources Institute, Beltsville Agricultural Research Center, USA, Dr. Phone: 301-504-9150; fax: 301-504-8571 (david.donovan@ars.usda.gov); Гладилин Александр Кириллович - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (gladilin@direct.ru); Клячко Наталья Львовна - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (Klyachko@enzyme.chem.msu.ru).

по сравнению с ферментом без добавок полиэлектролита и модификации аминогрупп.

Таким образом, основной причиной стабилизации LysK при образовании комплекса с поликатионом яв-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Фадеева Т.В., Верещагина С.А., Коган А.С., Григорьев Е.Г. // Инфекции в хирургии. 2007. 5. №1. С. 578.

2. Fishetti V.A. // Trends in Microbiology. 2005. 13. P. 491.

3. Fishetti V.A. // Current Opinion in Microbiology. 2008. 11. P. 393.

4. Flaherty S.O. etal. // J. Bacteriology. 2005. 187. P. 7161.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.