CC BY
22
УДК 543.23::66.096.4:[577.15+[678.7-139:661.185.2]]
КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФЕРМЕНТ-ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ ГЕКСАГИСТИДИНСОДЕРЖАЩЕЙ ОРГАНОФОСФАТГИДРОЛАЗЫ И.В. Лягин, Е.Н. Ефременко, А.В. Кабанов
(кафедра химической этимологии; e-mail: elena_efremenko@list.ru)
Получен набор нековалентных и ковалентных полиэлектролитных комплексов на основе фермента гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы. Использовали полианионы и поликатионы в виде блок-сополимеров с полиэтиленгликолем. Для получения ковалентных комплексов фермента применяли разные сшивающие агенты: глутаровый альдегид, К-этил-К-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDC) и 3-сульфо-К-гидрокси-сукцинимид. Лучший результат по каталитической эффективности действия ковалентно-сшитого комплекса достигнут в случае EDC, он составил (2,8±0,3)*108 МГ^с-1. Проведенная модификация поверхности белка направлена на создание препаратов для биомедицинского назначения.
Ключевые слова: гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза, полиэлектролит, фермент-полиэлектролитный комплекс.
Фосфорорганические соединения (ФОС) представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфос-фоновой кислот, а также их производных. К их числу относятся пестициды, широко применяемые в сельском, приусадебном и домашнем хозяйстве, а также ингибиторы коррозии, применяемые в теплоэнергетике, нефте- и газодобывающей промышленности, пластификаторы и стабилизаторы, используемые в строительной промышленности, в составе моющих и чистящих средств промышленного назначения, а также высокотоксичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия - зоман, зарин, Ух и продукты их разложения (метилфосфоно-вая кислота и ее эфиры) [1-2].
Ежегодное производство, хранение и применение ФОС в объеме сотен тысяч тонн [3] для нужд сельского хозяйства, а также низкая скорость разложения ФОС в условиях окружающей среды приводят к накоплению и обнаружению этих веществ первоначально в почве, а затем в грунтовых и речных водах, продуктах питания, табачных и хлопчатобумажных изделиях, домашней пыли [4-5]. Кроме того, проникновение ФОС в организм человека может происходить транс-дермально при непосредственном контакте с загрязненными объектами. ФОС оказывают на организм человека нейротоксичное воздействие, которое в зависимости от концентрации может быть острым или отдаленным. Эти вещества являются также мутагенами, вызывающими хромосомную аберрацию, при
этом негативный эффект, как правило, носит кумулятивный характер.
Проблема разложения ФОС в самых разнообразных объектах может быть решена биотехнологически с использованием высокоактивного фермента - органофосфатгидролазы, содержащей гексагистидино-вую последовательность на N-конце молекулы белка (His6-OPH) [6]. Была показана высокая эффективность действия этого фермента в средах сложного химического состава при гидролизе различных ФОС (пестицидов и отравляющих веществ) [7-8], что позволило вплотную подойти к решению вопроса о применении этого фермента для биомедицинских целей, в частности, для разложения ФОС in vivo. Поскольку His6-OPH является бактериальным ферментом, то для нивелирования возможного иммунного ответа со стороны организма при его введении необходима модификация поверхности His6-OPH. Из литературы известно, что с этой целью может использоваться пэгилирование [9] или образование полиэлектролитных комплексов [10]. Кроме того, полиэлектролитные комплексы между ферментом и полимером могут существенно стабилизировать белок, а модификация такого комплекса путем химической сшивки может дополнительно повысить стабильность этих биокатализаторов при использовании. Цель данной работы состояла в разработке и исследовании каталитических характеристик кова-лентно-сшитых фермент-полиэлектролитных ком-
плексов на основе His6-OPH, предназначенных для гидролиза различных ФОС.
Материалы и методы
Для получения His6-OPH в клетках E. coli SG13009[pREP4] использовали ранее запатентованную экспрессионную систему [11]. Выделение и очистку His6-OPH проводили, как это было описано ранее [12].
Ферментативную активность определяли спек-трофотометрически на УФ-видимом спектрофотометре «Agilent 8453» (Германия), снабженном тер-мостатируемым кюветным отделением, по накоплению продукта гидролиза Параоксона («Sigma», США) - 4-нитрофенолят аниона (X = 405 нм, s = 18500 М-1см-1, рН 10,5).
В типичном эксперименте в спектрофотометри-ческую кювету, содержащую 0,1 М карбонатный буфер, добавляли аликвоту 10 мМ водного раствора субстрата. Реакция инициировалась внесением в кювету аликвоты раствора фермента чистотой 98±1%. Концентрация фермента в кювете составляла 10-10-10-9 М.
За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, осуществляющее гидролиз 1 мкмоль Параоксона в 1 мин при 25°С.
Расчет скорости ферментативной реакции проводили по начальным линейным участкам кинетических кривых (vo = tga). Максимальную скорость ферментативной реакции ^макс) и константу Ми-хаэлиса (^М) определяли, используя гиперболическую аппроксимацию и двойные обратные координаты 1/vo - 1/[S] (Лайнуивера-Берка) в программе Origin Pro 8.1 SR3.
Для получения фермент-полиэлектролитных комплексов, согласно методу (модифицированному), описанному в работе [13] использовали раствор вы-сокоочищенного фермента His6-OPH с концентрацией не менее 0,2 мг/мл в карбонатном буфере (рН 10,5).
Комплексы на основе поликатионов получали добавлением к раствору фермента 20 мг/мл водного раствора блок-сополимера ПЭГ с полилизином (ПЭГ113-ПЛ10, Mw = 6,6 кДа) («Alamanda Polymers», США) или ПЭГ с полиэтиленимином (ПЭГ-ПЭИ, Mw = 12 кДа) в мольном соотношении фермент:полимер, равном 1:5 или 1:1 соответственно. После этого смесь перемешивали на вортексе, готовили аликвоты (по 1 мл) и выдерживали в течение 30 мин. при +8оС. Затем в аликвоты вносили по 10 мкл 25%-го раствора глутарового альдегида. После инкубации при +8оС в смесь вносили по 5 мкл
50 мМ NaBH4 («Sigma», США) и все перемешивали. После экспонирования в течение различных интервалов времени образцы помещали в диализные мешки, где они диализовались против 2 л 0,1 М карбонатного буфера (рН 10,5) в течение 20 ч.
Комплексы на основе полианионов получали добавлением к раствору фермента 20 мг/мл водного раствора блок-сополимера ПЭГ с полиглу-таминовой кислотой (ПЭГ113-ПГК50, Mw = 13 кДа) («Alamanda Polymers», США) в мольном соотношении фермент:полимер, равном 2:1 или 1:5. После этого смесь перемешивали на вортексе, готовили аликвоты (по 1 мл) и выдерживали в течение 30 мин при +8оС. Затем в смесь вносили по 30 мкл раствора ^этил-^-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлорида (EDC) («Sigma», США) или натриевой соли 3-сульфо-^гидрокси-сукцинимида (SNHS) («Sigma», США) такой концентрации, чтобы мольное соотношение глутаминовой кислоты и сшивающего агента составляло 1:1, 1:10 или 1:100. После экспонирования в течение некоторого времени при комнатной температуре образцы помещали в термошейкер, где они выдерживались при 37оС и 900 об/мин в течение 3 мин. Затем образцы охлаждали до комнатной температуры и хранили при +8оС. Все эксперименты проводили как минимум в трех повторностях.
Результаты и их обсуждение
Разработка и исследование фермент-полиэлектролитных комплексов His6-OPH на основе поликатионов
В качестве поликатионов в работе использовали блок-сополимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) с полилизином (ПЭГ113-ПЛ10, Mw = 6,6 кДа) или полиэтиленимином (ПЭГ-ПЭИ, Mw = 12 кДа). Такой выбор был обусловлен тем, что ПЭГ113-ПЛ10 и ПЭГ-ПЭИ несут разные заряды (0,08 и 0,55 соответственно) в расчете на мономерное звено. Таким образом, оболочка, формируемая из ПЭГ блок-сополимеров на поверхности фермента, в этих двух случаях существенно различается.
В качестве базовой для получения фермент-полиэлектролитного комплекса использовали методику, описанную в работе [13], заменив буфер на 0,1 М карбонатный (рН 10,5). При этом процесс получения ковалентно сшитых ферментных комплексов оптимизировался по двум основным параметрам: 1) времени обработки фермент-полиэлектролитного комплекса сшивающим агентом (глутаровым альдегидом); 2) времени восстановления оснований Шиффа
Рис. 1. Изменение ферментативной активности в ходе обработки фермент-полиэлектролитных комплексов на основе фермента Н1б6-ОРН и различных поликатионов сшивающим агентом (глутаровым альдегидом): 1 - ПЭГ113-ПЛ10, 2 - ПЭГ-ПЭИ
Рис. 2. Изменение ферментативной активности в ходе восстановления оснований Шиффа в фермент-полиэлектролитных комплексах на основе фермента н1б6-ОРН и различных поликатионов с использованием №БН4: 1 - ПЭГ113-ПЛ10, 2 - ПЭГ-ПЭИ.
с использованием 0,25 мМ раствора №БН4. При увеличении времени обработки глутаровым альдегидом наблюдалось снижение ферментативной активности (рис. 1). Очевидно, что кинетика этого процесса зависит от типа поликатиона (ПЛ10 или ПЭИ), и в случае ПЭГ-ПЭИ, в котором плотность зарядов выше, процесс заканчивался быстрее. Тем не менее после 6 ч экспонирования независимо от использованного поликатиона остаточная активность составляла ~50% от исходного уровня. Дальнейшее экспонирование фермент-полиэлектролитных комплексов в присутствии сшивающего агента мы сочли нецелесообразным и выбрали данное время (6 ч) в качестве оптимального.
Увеличение времени восстановления получаемых оснований Шиффа с использованием №БН4 также привело к снижению ферментативной активности (рис. 2). При этом снижение за 1 ч исходной активности в случае ПЭГ-ПЭИ составило 20%, а в случае
ПЭГ113-ПЛ10 - 10%. Для дальнейших экспериментов было выбрано наиболее оптимальное (20 мин) время обработки восстанавливающим агентом.
Определены каталитические характеристики ко -валентно сшитых фермент-полиэлектролитных ком -плексов, полученных в оптимальных условиях, в реакциях гидролиза пестицида Параоксона (табл. 1). Установлено, что ковалентно сшитые фермент-полиэлектролитные комплексы, полученные на основе поликатионов, обладают существенно ухудшенными каталитическими характеристиками по сравнению с нативным ферментом. По всей видимости, защитная роль поликатионов в комплексе с ферментом недостаточна, а значит глутаровый альдегид имеет свободный доступ к КН2-группам в активном центре фермента, способствуя значительному снижению активности полученных ферментных препаратов.
Исследована стабильность ковалентно сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов разной кон -
Т а б л и ц а 1
Каталитические характеристики гидролиза Параоксона под действием ковалентно сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов на основе фермента Ш86-ОРН и различных поликатионов
Блок-сополимер Мольное соотношение Км, мкМ ^макс^ с_1 V /(Е хКм), М-1 с-1 макс ^ о М>"
- 1:0 10,0±0.5 5100±100 (5,1±0,3)х108
ПЭГ113-ПЛ10 1:5 68,7±2,8 2160±30 (3,1±0,1)х107
ПЭГ-ПЭИ 1:1 81,4±4,9 2390±60 (2,9±0,1)х107
Примечание. Ео - начальная концентрация фермента.
Рис. 3. Изменение ферментативной активности ковалентно сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов на основе фермента Н1з6-ОРН и различных поликатионов при хранении в концентрации 15 мкг/мл (А) и 150 мкг/мл (Б) в
фосфатно-солевом буфере: 1 - ПЭГ113-ПЛ10, 2 - ПЭГ-ПЭИ
центрации в условиях хранения при +8оС (рис. 3). Установлено существенное снижение ферментативной активности при хранении таких препаратов, имеющих концентрацию по белку 15 мкг/мл (рис. 3, а). В частности, за 3 ч эти препараты теряли 70-80% своей исходной активности.
Хранение ковалентно сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов в концентрированном (150 мкг/мл) виде также приводило к существенному снижению активности, и за 6 ч потеря активности достигала 20-35% (рис. 3, б).
Таким образом, было установлено, что получение фермент-полиэлектролитных комплексов на основе His6-OPH с использованием разных поликатионов приводит к существенному ухудшению каталитических характеристик фермента и невысокой стабильности этих препаратов при хранении.
Разработка и исследование фермент-полиэлектролитных комплексов His6-OPH на основе полианионов
Полианионы также были использованы в работе для получения ковалентно сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов на основе His6-OPH. Ко -валентное связывание компонентов таких комплексов может проводиться за счет реакции сшивающих агентов с карбоксильными группами, имеющимися на поверхности фермента, а также в боковых радикалах полианиона, например полиглутаминовой кислоты.
В качестве сшивающих агентов использовали ^этил-^-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDC) и натриевую соль 3-сульфо-Ы-гидрокси-сукцинимида (SNHS), которые добавляли в разной
концентрации к фермент-полиэлектролитным ком -плексам на основе His6-OPH и ПЭГ113-ПГК50, взятых в мольном соотношении фермента и полимера, равном 2:1 и 1:5.
Исследована кинетика изменения ферментативной активности фермент-полиэлектролитных комплексов после внесения сшивающих агентов (рис. 4). Результирующая ферментативная активность полученных образцов ковалентно-сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов представлена на рис. 5. Стоит отметить, что и EDC, и SNHS оказались более «мягкими» сшивающими агентами по сравнению с глутаровым альдегидом, приводящим к 50%-й потере ферментативной активности. Снижение ферментативной активности под действием EDC и SNHS не превышало 20%. В свою очередь, использование фермент-полиэлектролитных комплексов при мольном соотношении фермента и полимера, равном 1:5, позволило достичь получения препаратов с минимальным уровнем инактивации фермента (10%). Необходимо отметить, что наблюдаются различия профилей зависимости остаточной активности фермент-полиэлектролитных комплексов от количества используемого для химической прошивки сшивающего агента и его природы (рис. 5).
Исследованы каталитические характеристики фермент-полиэлектролитных комплексов на основе His6-OPH и ПЭГ113-ПГК50, полученных при мольном соотношении 2:1 или 1:5 в 0,1 М карбонатном бу -фере (рН 10,5) и сшитых ковалентно под действием 100-кратного избытка EDC или SNHS по отношению к введенной в фермент-полиэлектролитный комплекс глутаминовой кислоте. Выбор 100-кратного избытка сшивающего агента обусловлен тем, что
Рис. 4. Кинетика изменения ферментативной активности фермент-полиэлектролитных комплексов на основе Н1Б6-ОРН и ПЭГ113-ПГК50, полученных при мольном соотношении «фермент:полимер» 2:1 (1, 2 , 3) и 1:5 (4, 5, 6) в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5) под действием ББС (А) и 8КН8 (Б); мольное соотношение «глутаминовая кислота: сшивающий агент» составляло 1:1 (3, 6), 1:10 (2, 5) и 1:100 (1, 4)
Рис. 5. Ферментативная активность фермент-полиэлектролитных комплексов, полученных на основе Н1б6-ОРН и ПЭГ113-ПГК50 при мольном соотношении 2:1 (1) и 1:5 (2) в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5) и сшитых ковалентно под действием ББС (А) и 8КН8 (Б) через 45 мин с момента начала сшивки фермент-полиэлектролитных комплексов
(за 100% принята исходная активность фермента)
в этом случае степень сшивки фермент-полиэлектролитных комплексов одинакова.
Рассчитанные каталитические константы действия ковалентно-сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов в реакции гидролиза Параоксо-на представлены в табл. 2. Сравнение каталитических характеристик фермент-полиэлектролитных комплексов, сшитых ББС или 8МН8, показало, что ББС - оптимальный сшивающий агент, позволяющий достичь максимальной эффективности ферментативного гидролиза.
Идентичность каталитических характеристик фермент-полиэлектролитных комплексов, сшитых 8КН8, свидетельствует о том, что этот сшивающий агент взаимодействует в первую очередь с ферментом, в то
время как ББС - с сополимером. В случае 8КН8 снижение ферментативной активности, происходящее до одного общего уровня (3660±120 с-1), предопределено количеством функциональных групп на поверхности фермента, способных вступать в химическое взаимодействие с этим сшивающим агентом. Ввиду значительного избытка 8КН8 (мольное соотношение с ферментом составляло 1:2500 и 1:25000) очевидно, что большая часть сшивающего агента находилась в свободном виде в растворе.
Сравнение каталитических констант ковалентных фермент-полиэлектролитных комплексов, сшитых ББС (табл. 2), и нековалентных комплексов (табл. 3), полученных на основе Ш86-ОРН и блок-сополимера ПЭГ113-ПГК50, позволило сделать вывод о том, что
Т а б л и ц а 2
Каталитические характеристики гидролиза Параоксона под действием фермент-полиэлектролитных комплексов на основе фермента Шз6-ОРН и сополимера ПЭГ113-ПГК50, полученных при различных мольных соотношениях в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5) и сшитых ковалентно под действием разных сшивающих
агентов
Мольное соотношение ЕЭС
Км, мкМ V /Е , с-1 макс о5 V™ ^о^мХ М-1с-1 Км, мкМ V /Е, максмакр о' с-1 V™ /(Ео*Км), М-'с-1
2:1 15,9±0,9 4510±210 (2,8±0,3)х108 22,2±2,6 3620±120 (1,6±0,2)х108
1:5 19,0±1,6 4070±150 (2,1±0,3)х108 22,1±1,7 3690±130 (1,7±0,2)х108
Примечание. Ео - начальная концентрация фермента.
Т а б л и ц а 3
Каталитические характеристики гидролиза Параоксона под действием нековалентных фермент-полиэлектролитных комплексов на основе фермента Шз6-ОРН и блок-сополимера ПЭГ113-ПГК50, полученных при рН 10,5 и взятых в различных мольных соотношениях.
Мольное соотношение Км, мкМ V /Е , с-1 макс о5 ^(Ео*Км), М-1с-1
2:1 16,7±0,9 5005±60 (3,0±0,2)х108
1:5 38,0±1,7 4190±100 (1,1±0,1)х108
Примечание. Ео - начальная концентрация фермента.
у ковалентно сшитых фермент-полиэлектролитных комплексов происходит ожидаемое снижение каталитической константы на 3-10%. В случае использования максимального количества сополимера наблюдалось снижение константы Михаэлиса в 2 раза по сравнению с нековалентными фермент-полиэлектролитными комплексами. По всей видимости, это свидетельствует о существенном структурировании полимерной оболочки, в результате которого исчезают стерические затруднения, создающиеся блок-сополимером, для взаимодействия фермента с субстратом. В результате для образца фермент-полиэлектролитного комплекса, полученного при мольном соотношении фермента и полимера, равном 1:5 и ковалентно сшитого ЕЭС (табл. 2), удалось значительно увеличить (в 1,9 раза) константу эффективности действия по сравнению с его нековалентным вариантом (табл. 3).
В сравнении с известными аналогами, полученными путем пэгилирования ОРН [9, 14], разработанные
нами фермент-полиэлектролитные комплексы на основе Н186-ОРН обладают более высокими каталитическими характеристиками. Каталитическая константа действия фермент-полиэлектролитных комплексов на основе И86-ОРН и ПЭГ113-ПГК50 в 1,3-4,0 раза выше, константа Михаэлиса в 1,5-16,8 раза ниже, а в целом константа эффективности действия в 2,3-25,5 раза больше, чем у аналогов.
Таким образом, были разработаны и исследованы ковалентно сшитые фермент-полиэлектролитные комплексы на основе Н186-ОРН и различных блок-сополимеров. Варьирование блок-сополимера, а также условий получения таких ком -плексов позволило получить высокоэффективные биокатализаторы, способные гидролизовать ФОС. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании полианиона (блок-сополимера ПЭГ с полиглутаминовой кислотой), который ковалентно связывали с ферментом с помощью производного карбодиимида (ЕЭС).
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (договор
№1Ш.34.31.0004 от 30 ноября 2010 г).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kwong T.C. // Ther. Drug. Monit. 2002. 24. N 1. P. 144.
2. Gupta R.C. Handbook of toxicology of chemical warfare agents. L., 2009. P. 1168.
3. Gold R.S., Wales M.E., Grimsley J.K. // Disarm. Technol. 2000. 23. P. 263.
4. Obendorf S.K., Lemley A.T., Hedge A., et al. // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2006. 50. N 1. P. 31.
5. Lemley A., Hedge A., Obendorf S.K., et al. // Bull. Environ. Contamin. Toxicol. 2002. 69. N 2. P. 155.
6. Votchitseva Y.A., Efremenko E.N., Aliev T.K., Varfolomeyev, S.D. // Biochemistry (Mosc.). 2006. 71. P. 167.
7. Sirotkina M., Lyagin I., Efremenko E. // Int. Biodeterior. Biodegradation. 2012. 68. P. 18.
8. Ефременко Е.Н., ЗавьяловаН.В., Лягин И.В., Сенько О.В., Гудков Д.А., Аксенов А.В., Степанов Н.А., Сироткина М. С., Спиричева О.В., Иванов Р. В., Лозинский В.И., Варфоломеев С.Д., Кондратьев В.Б., Холстов В.И. Способ биоразложения фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, получаемых
после химического уничтожения вещества типа Vx. Пат. РФ № 2408724, 2011. Бюл. № 1.
9. Novikov B.N., Grimsley J.K., Kern R.J., et al. // J. Control. Release. 2010. 146. P. 318.
10. Kabanov A.V, Bronich T., Batrakova E., Gendelman H. Compositions for protein delivery and methods of use thereof. Pat. WO 2008/141155 A1, 2008.
11. Ефременко Е.Н., Вотчитцева Ю.А., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы. Пат. РФ № 2255975, 2005. Бюл. № 19.
12. Efremenko E., Votchitseva Y., Plieva F., et al. // Appl. Microbiol. Biot. 2006. 70. P. 558.
13. Kabanov A.V, Bronich T., Batrakova E., Gendelman H. Compositions for protein delivery and methods of use thereof. Patent US 2010/0291065 A1, 2010.
14. Jun D., Musilova L., Link M., et al. // Chem.-Biol. Interact. 2010. 187. P. 380.
Поступила в редакцию 30.01.14
CATALYTIC CHARACTERISTICS OF ENZYME-POLYELECTROLYTE COMPLEXES BASED ON HEXAHISTIDINE-CONTAINING ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE
I.V. Lyagin, E.N. Efremenko, A.V. Kabanov
(Chemical Enzymology Department)
A number of covalent and non-covalent polyelectrolyte complexes based on enzyme such as hexahistidine-containing organophosphorus hydrolase were developed in the work. Polyanions and polycations were used in the form of block-copolymers with poly(ethylene glycol). To obtain covalent complexes of the enzyme, different coupling agents (glutaric aldehyde, N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt) were tried. The best catalytic efficiency of action of covalently bound complex ((2.8±0.3)x108 M^s-1) was obtained in the case of samples with EDC. The modification of the protein surface was undertaken as an approach to its further biomedical application.
Key words: hexahistidine-containing organophosphorus hydrolase, polyelectrolyte, enzyme-polyelectrolyte complex.
Сведения об авторах: Лягин Илья Владимирович - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (lyagin@mail.ru); Ефременко Елена Николаевна - зав. лаб. экобиокатализа кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. биол. наук (elena_ efremenko@list.ru); Кабанов Александр Викторович - зав. лаб. химического дизайна бионаноматериалов кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (skabanov@me.com).
