CC BY
10
УДК 618.11/.19-006.6:576.53.083.3
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭКСПРЕССИИ ЭСТРОГЕНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ БЕТА В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РАКА ЯИЧНИКОВ И МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Т.А. Богуш1*, А.А. Башарина1, О.С. Бурова1, Е.А. Богуш12, В.Ю. Кирсанов2,
A.М. Щербаков1, В.А. Сюваткин1, О.М. Рябинина1, М.А. Барышникова1,
B.С. Косоруков1
(1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации; 2Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет); *е-таИ: tatbogush@mail.ru)
Иммунофлуоресцентным методом, ассоциированным с проточной цитометри-ей, проведена сравнительная количественная оценка экспрессии эстрогеновых рецепторов бета (ERP) в культурах клеток рака яичников линий COLO-704, OVCAR-3, EFO-21 и SK-OV-3, а также рака молочной железы линии MCF-7. Высокий уровень экспрессии ERp (88-91%) выявлен во всех исследованных клетках, но по интенсивности экспрессии маркёра отмечены существенные различия между культурами клеток рака яичников (в OVCAR-3, EFO-21 и SK-OV-3 выше, чем в COLO-704 соответственно в 1,6; 2,3 и в 3,5 раза). Более того, в клетках SK-OV-3, EFO-21 и OVCAR-3 интенсивность экспрессии ERp была значительно выше по сравнению с клетками MCF-7: в 2,7; 1,4 и в 1,9 раз соответственно. Авторы предполагают, что в отличие от рака молочной железы у больных раком яичников именно ERp, а не ERa, могут стать главной мишенью антиэстрогенов. Выявленные различия в экспрессии ERp в ряду широко используемых культур клеток рака яичников позволяют рекомендовать их для дальнейших фундаментальных исследований вклада именно ERp в реализацию биологических эффектов антиэстрогенов.
Ключевые слова: эстрогеновые рецепторы бета, проточная цитометрия, С0Ь0-704, 0УСЛЯ-3, ББ0-21, 8К-0У-3, ЫСБ-7.
Расширение показаний к применению антиэстрогенов - это тренд современной фундаментальной и клинической онкологии. В частности, первый таргетный препарат тамоксифен, который на протяжении более 40 лет является золотым стандартом адъювантной терапии рака молочной железы, в 2018 г. введен в стандарты терапии рака яичников в рекомендациях Европейского общества гинекологической онкологии и Российского общества клинической онкологии [1, 2]. При этом следует подчеркнуть, что в отличие от рака молочной железы, где четко обозначена мишень тамок-сифена - эстрогеновые рецепторы альфа (БЯа), для рака яичников мишень этого антиэстрогена не определена и препарат рекомендован для лечения больных раком яичников низкой степени злокачественности (ЯШ8С0).
Однако мишенью антиэстрогенов служат рецепторы и другого типа - эстрогеновые рецепторы бета (БЯР), которые также участвуют в важнейших этапах клеточного сигналинга [3, 4], контролируют пролиферативную активность клеток [5] и экспрессируются у больных в ткани рака яичников [6], причем даже более интенсивно по сравнению с БЯа [7].
Приведенные данные указывают на необходимость расширения фундаментальных исследований по сравнительному изучению роли БЯР в реализации биологических эффектов антиэстрогенов при воздействии на клетки рака не только молочной железы, но и яичников. Однако до настоящего времени в литературе отсутствуют сведения о показателях экспрессии БЯР в клетках разных культур рака яич-
ников человека в сравнении с раком молочной железы.
Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы дать количественную иммунофлуоресцент-ную характеристику уровня и интенсивности экспрессии ERß в полученных из международных банков культурах клеток рака яичников линий COLO-704, OVCAR-3, EFO-21 и SK-OV-3 в сравнении с одной из наиболее изученных и часто используемых в фундаментальных исследованиях клеточной линией рака молочной железы MCF-7.
Материалы и методы
Исследование проведено на панели клеточных линий. Клетки рака яичников EFO-21 (ACC 235) и COLO-704 (ACC 198) получены из коллекции Leibniz Institute DSMZ; OVCAR-3 (HTB-161) и SK-OV-3 (HTB-77) (Американская коллекция клеточных культур (АТСС)). Клетки культуры сравнения - клетки рака молочной железы линии MCF-7 (HTB-22) также получены из АТСС. До проведения экспериментов все культуры хранили в криобанке НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Идентичность клеточных линий подтверждали непосредственно перед экспериментами с помощью анализа коротких тандемных повторов (GORDIZ). Клетки MCF-7 и SK-OV-3 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; Gibco), клетки EFO-21, COLO-704 и OVCAR-3 - в среде Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640; Gibco). Среды содержали 10% эмбриональной сыворотки телят (HyClone), 50 ед./мл гентамицина (ПанЭко) и 0,1 мг/мл пирувата натрия (Santa Cruz). Условия в инкубаторе (NuAir): температура 37 °С, 5% СО2, относительная влажность 80-85%. В экспериментах использовали культуры в логарифмической фазе роста. Один миллион клеток каждой культуры высевали на чашки Петри (60 мм, Corning) и через 24 ч фиксировали по протоколу, описанному ранее [8].
Количественная оценка показателей экспрессии ERß в культурах клеток проведена ранее разработанным иммунофлуоресцентным методом, ассоциированным с проточной цитометри-ей [8]. В работе использованы первичные моно-клональные антитела к ERß (клон 14C8, ab288, Великобритания), а также вторичные антитела, конъюгированные с DyLight650 (ab98729, Великобритания). Исследование проведено в области линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антител вблизи достижения плато. Рабочие концентрации первичных антител к ERß составили 2,5 и 5,0 мкг белка/мл,
вторичных - 0,5 мкг белка/мл. Для удаления из анализа дебриса после завершения инкубации с антителами клетки инкубировали со специфическим красителем ДНК Hoechst 33258 («Sigma-Aldrich», США). В анализ включали только клетки с окрашенными ядрами, клеточные конгломераты выводили из анализа путем дополнительного гейтирования. Флуоресценцию клеток измеряли на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США).
Для оценки экспрессии ERß в культурах клеток использовали два показателя - интенсивность и уровень экспрессии, рассчитанные с помощью программы FlowJo 10.0.08 («FlowJo LLC», США). Интенсивность экспрессии ERß - среднее геометрическое значение специфической флуоресценции антител в образце. Уровень экспрессии маркёра (в процентах) - число специфически флуоресцирующих клеток относительно контроля (инкубация клеток только с вторичными антителами).
Для визуализации распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции использовали гистограммы, построенные в программе WinMDI 2.9.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью i-критерия Стьюдента, включенного в пакет GraphPad Prism 7.0 («GraphPad Software», США). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты типичного эксперимента, демонстрирующие гистограммы распределения клеток в зависимости от внутриклеточной флуоресценции после инкубации с моноклональными антителами к ERß, представлены на рис. 1. Видно, что все клеточные культуры исследованы в линейном диапазоне зависимости специфической флуоресценции клеток от концентрации специфических антител, так как показатели экспрессии (уровень и интенсивность) увеличивались при росте концентрации антител. Отметим, что при использованной концентрации антител уровень экспрессии маркёра достигает плато, так как изменение показателя при увеличении концентрации антител не превышает 10%.
В целом, экспрессия ERß выявлена во всех исследованных культурах клеток, при этом различия в уровне экспрессии маркёра между клетками рака молочной железы линии MCF-7 и разными культурами клеток рака яичников были несущественны. Так, уровень экспрессии ERß в клетках MCF-7 составил 88%, а в клетках рака яичников SK-OV-3, OVCAR-3, EFO-21 и C0L0-704 - 89, 88, 91 и 90%
Рис. 1. Уровень и интенсивность экспрессии БЯр в клетках культур рака молочной железы МСБ-7 и рака яичников 8К-0У-3, 0УСЛЯ-3, С0Ь0-704, ББ0-21 при разных концентрациях специфических монокло-нальных антител. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток, измеренная в условных единицах в канале БЬ6, логарифмическая шкала; по оси ординат - количество клеток. Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции после инкубации только с вторичными антителами (закрашенные, контроль) и с моноклональными антителами к БЯр в концентрации 2,5 или 5,0 мкг/мл (сплошная и пунктирные линии границ, соответственно). Стрелками показан уровень экспрессии БЯр (%)
соответственно. Таким образом, в клетках всех исследованных культур уровень экспрессии БЯР был высоким.
Иной оказалась ситуация с показателем интенсивности экспрессии БЯР, т.е. с числом рецепторов, экспрессирующихся в каждой опухолевой клетке. На рис. 2 представлен типичный результат одного из трех экспериментов. Видно, что по сравнению с клетками рака молочной железы линии МСБ-7 лишь в одной из четырех исследованных культур рака яичников (клетках линии С0Ь0-704) интенсивность экспрессии БЯР практически не отличалась от показателя клеток рака молочной железы МСБ-7 и была лишь в 1,3 раза ниже. В остальных культурах клеток рака яични-
ков (в 75% случаев) интенсивность экспрессии БЯР по сравнению с клетками рака молочной железы МСБ-7 оказалась значительно выше: в 2,7; 1,4 и в 1,9 раза соответственно в клетках 8К-0У-3, ББ0-21 и 0УСЛЯ-3.
Результаты трех независимых экспериментов сравнительного анализа интенсивности экспрессии БЯР в клетках рака яичников разных линий и рака молочной железы МСБ-7 приведены в таблице. Сравнение проведено при двух значениях концентрации первичных моноклональных антител в линейной области зависимости флуоресценции от концентрации антител, при этом в обоих случаях получены практически идентичные результаты: интенсивность экспрессии БЯР в трех
Рис. 2. Интенсивность экспрессии БЯр в клетках культур рака яичников С0Ь0-704, 0УСЛЯ-3, БР0-21, 8К-0У-3 в сравнении с клетками рака молочной железы МСР-7 при концентрации специфических моноклональных антител 2,5 мкг/мл. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток, измеренная в условных единицах в канале РЬ6, логарифмическая шкала; по оси ординат - количество клеток. Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции после инкубации с моноклональными антителами к БЯр: закрашенные - клетки рака молочной железы линии МСР-7; незакрашенные - клетки рака яичников разных линий. Обозначения: | и | - соответственно увеличение и уменьшение интенсивности флуоресценции клеток рака яичников относительно показателя в клетках рака молочной железы МСР-7. Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов при использовании концентрации моноклональных антител к БЯр 2,5 мкг/мл
Рис. 3. Различия в интенсивности экспрессии БЯр в клетках культур рака яичников при ранжировании показателей от меньшего к большему (*/-критерий Стьюдента, р < 0,05). По оси абсцисс - названия исследованных культур клеток рака яичников; по оси ординат - отношение интенсивности экспрессии БЯр в исследованных культурах к
показателю в клетках С0Ь0-704
Интенсивность экспрессии ERp в клетках рака яичников по сравнению с клетками рака молочной железы линии MCF-7 при концентрации первичных антител (мкг белка/мл): I - 2,5; II - 5,0
Культура клеток рака яичников Интенсивность флуоресценции клеток рака яичников относительно показателя клеток рака молочной железы MCF-7
I II
C0L0-704 0,74 ± 0,27 0,75 ± 0,23
0VCAR-3 1,37 ± 0,15* 1,35 ± 0,13*
EF0-21 1,70 ± 0,31* 1,64 ± 0,25*
SK-0V-3 2,60 ± 0,56* 2,43 ± 0,42*
* f-критерий Стьюдента, p < 0,05.
из четырех исследованных культур клеток рака яичников оказалась статистически значимо выше по сравнению с культурой рака молочной железы и лишь в клетках С0Ь0-704 была практически такой же (р > 0,05).
Что касается панели исследованных культур клеток рака яичников в целом, то по показателю интенсивности экспрессии БЯР относительно наименьшей интенсивности экспрессии маркёра в клетках С0Ь0-704 их можно ранжировать от меньшего к большему следующим образом (рис. 3). Экспрессия БЯР в клетках 0УСЛЯ-3 выше, чем в С0Ь0-704 в 1,6 раз; в клетках ББ0-21 - в 2,3 раза, а в клетках 8К-0У-3 - почти в 3,5 раза. В случае с ББ0-21 и 8К-0У-3 различия достигают статистической значимости < 0,05).
Таким образом, при сравнительной количественной иммунофлуоресцентной оценке показателей экспрессии БЯР в культурах клеток рака яичников и рака молочной железы, выделенных из интерстициальных жидкостей больных при дис-семинации заболевания по полостям (см. раздел «Материалы и методы»), получены следующие результаты.
Показано, что БЯР экспрессируются практически во всех клетках исследованных культур, как рака яичников, так и рака молочной железы линии МСБ-7, т.е. по этому показателю клетки опухолей разных локализаций не различаются. Однако по интенсивности экспрессии маркёра выявлены принципиальные различия как между клетками рака яичников и молочной железы, так и между клетками рака яичников разных линий. Последнее наблюдение совпадает с описанными нами принципиальными различиями между количественными показателями экспрессии маркёра в ткани серозного рака яичников разных больных [7, 9]. При этом показано, что не сам факт наличия в опухоли
рецепторов БЯР, а уровень их экспрессии прогнозирует течение серозного рака яичников после завершения первой линии химиотерапии препаратами платины и таксанами. Благоприятным предик-тивным маркёром служит выявление в опухоли экспрессии БЯР более чем в 40% клеток [7, 10].
Более того, анализ количественных показателей экспрессии БЯР и БЯа в ткани опухолей больных раком яичников продемонстрировал более высокий уровень экспрессии БЯР по сравнению с БЯа. Это позволило предположить, что у больных раком яичников рецепторы именно БЯР, а не БЯа, могут стать главной мишенью воздействия антиэстрогенов [7]. Вероятно, этим можно объяснить упомянутое в рекомендациях ЯИ88С0 отсутствие корреляции эффекта тамоксифена с экспрессией в опухоли БЯа [1].
Полученные результаты, а именно, количественные различия в экспрессии БЯР в ряду широко используемых культур клеток рака яичников, позволяют рекомендовать их для дальнейших фундаментальных исследований вклада именно БЯР в реализацию биологических эффектов антиэстрогенов. Это, безусловно, полезно с практической точки зрения, если учесть упомянутое выше введение в клиническую практику антиэстрогенов как нового подхода в терапии рака яичников, с одной стороны, и отсутствие критериев отбора больных для этой терапии, с другой.
Работа выполнена в рамках программы исследований ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (темы НИР: «Разработка и оценка клинической значимости новой технологии молекулярного прогнозирования резистентности и агрессивности солидных эпителиальных новообразований», рег. № АААА-А20-120020690077-0; «Разработка принципов персонифици-
рованной вакцинотерапии меланомы», рег. № АААА-А20-120022090056-5) и проекта РФФИ № 18-29-09017 (эксперименты с клеточными культурами).
Конфликта интересов нет. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием людей или животных в качестве объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Тюляндин С .А., Коломиец Л. А., Морхов К. Ю., Нечушкина В.М., Покатаев И.А., Тюляндина А.С., Урманчеева А.Ф., Хохлова С.В. // Злокачественные опухоли: Практические рекомендации RUSSCO #3s2. 2018. Т. 8. С. 145 (DOI: 10.18 027/2224-5057-2018-8-3s2-145-155).
2. Colombo N., Sessa C., du Bois A., Ledermann J., Mc-Cluggage W.G., McNeish I., Morice P., Pignata S., Ray-Coquard I., Vergote I., Baert T., Belaroussi I., Dashora A., Olbrecht S., Planchamp F., Querleu D. // Annals of Oncology. 2019. Vol. 30. N 5. P. 672 (DOI: 10.1093/annonc/mdz062).
3. Jia M., Dahlman-Wright K., Gustafsson J.A. // Best practice & research. Clinical endocrinology & metabolism. 2015. Vol. 29. N 4. P. 557 (DOI: 10.1016/j. beem.2015.04.008).
4. Ya§ar P., AyazG.,User S. D., Gupur G., Muyan M. // Reproductive Medicine and Biology. 2016. Vol. 16. N 1. P. 4 (DOI: 10.1002/rmb2.12006).
5. Treeck O., Diepolder E., Skrzypczak M., Schuler-Toprak S., Ortmann O. // BMC Cancer. 2019. Vol. 19. N 1 P. 745 (DOI: 10.1186/s12885-019-5928-2).
6. Chan K.K.L., Siu M.K.Y., Jiang Y.X., Wang J.J.,
Wang Y., Leung T.H.Y., Liu S.S., Cheung A.N.Y., Ngan H.Y.S. // BMC Cancer. 2017. Vol. 17. N 1. P. 606 (DOI: 10.1186/s12885-017-3601-1).
7. Богуш Т.А., Башарина А.А., Богуш Е.А., Рябини-на О.М., Тюляндина А. С., Тюляндин С.А. // ДАН. 2018. Т. 482. № 3. С. 340 ( DOI: 10.31857/S086956520003105-8) [Bogush T.A., Basharina A.A., Bogush E.A., Ryabinina O.M., Tjulandina A.S., Tjulandin S.A. // Dokl. Biochem. Biophys. 2018. Vol. 482. N 1. P. 249 (DOI: 10.1134/ S1607672918050058)].
8. Богуш Т.А., Шатурова А.С., Дудко Е.А., Жураев Э.Э, Полоцкий Б.Е., Унгиадзе Г.В., Давыдов М.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2011. Т. 52. № 4. С. 305. [Bogush T.A., Shaturova A.S., Dudko E.A., Juraev E.E., Polotsky B.E., Ungiadze G.V., Davydov M.I. // Mosc. Univ. Chem. Bull. 2011. Vol. 66. N 4. P. 305].
9. Богуш Т.А., Башарина А.А., Богуш Е.А., Тюляндина А.С., Тюляндин С.А., Давыдов М.М. // Рос. биотерапевт. журн. 2017. Т. 16. № 4. C. 34 (DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-4-34-37).
10. Богуш Т.А., Башарина А.А., Богуш Е.А., Вихлянцева Н.О., Чемерис Г.Ю., Жорданиа К.И., Тюляндина А. С., Тюляндин С.А. //Онкогинекология. 2019. № 1. C. 4.
Поступила в редакцию 10.11.2019 Получена после доработки 12.12.2019 Принята к публикации 14.04.2020
COMPARATIVE IMMUNOFLUORESCENT ANALYSIS OF ESTROGEN RECEPTOR BETA EXPRESSION IN OVARIAN AND BREAST CANCER CELL LINES
T.A. Bogush1*, A.A. Basharina1, O.S. Burova1, E.A. Bogush1'2, V.Yu. Kirsanov2, A.M. Scherbakov1, V.A. Syuvatkin1, O.M. Ryabinina1, M.A. Baryshnikova1, V.S. Kosorukov1
(1FSBI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» of the Ministry of Health of the Russian Federation; 2FSAEI HE I.M. Sechenov First MSMUMOH Russia (Sechenovskiy University); *e-mail: tatbogush@mail.ru)
Comparative quantitative evaluation of estrogen receptors beta (ERp) expression was performed by immunofluorescence method using flow cytometry in ovarian cancer cell lines COLO-704, OVCAR-3, EFO-21 and SK-OV-3 as well as breast cancer cell line MCF-7. High level of ERp expression (88%-91%) was revealed in all cell cultures investigated, and significant differences were observed in marker expression intensity between ovarian cancer cell cultures (in OVCAR-3, EFO-21 and SK-OV-3 are higher compared with COLO-704 cells in 1,6; 2,3 and 3,5 times, respectively). Moreover, the intensity of ERp expression was significantly higher in SK-OV-3, EFO-21 and OVCAR-3 than in MCF-7 cells: in 2,7; 1,4 and 1,9 times, respectively. The authors suggest that in contrast to breast cancer patients, ERp and not ERa can be the main target for antiestrogens in ovarian cancer patients. The revealed differences in ERp expression in a number of widely used
ovarian cancer cell cultures let us recommend them for further fundamental researches of ERp to study the biological effects of antiestrogens.
Key words: estrogen receptors beta, flow cytometry, COLO-704, OVCAR-3, EFO-21, SK-OV-3, MCF-7.
Сведения об авторах: Богуш Татьяна Анатольевна - руководитель группы молекулярных маркёров опухолей лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, докт. биол. наук, профессор (tatbogush@mail.ru); Башарина Анна Александровна - мл. науч. сотр. группы молекулярных маркёров опухолей лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (basharinaa@inbox.ru); Бурова Ольга Семёновна - ст. науч. сотр. лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. биол. наук (labmedchem@mail.ru); Богуш Елена Александровна - ст. науч. сотр. отделения хирургического № 2 ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, ассистент кафедры онкологии лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, канд. мед. наук (labmedchem@mail.ru); Кирсанов Владислав Юрьевич - доцент кафедры онкологии лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, канд. мед. наук (labmedchem@ mail.ru); Щербаков Александр Михайлович - зав. лабораторией онкопротеомики ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. биол. наук (labmedchem@mail.ru); Сюваткин Вячеслав Александрович - лаборант-исследователь группы молекулярных маркёров опухолей лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (labmedchem@mail.ru); Рябинина Ольга Михайловна - науч. сотр. группы молекулярных маркёров опухолей лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. биол. наук (labmedchem@mail.ru); Барышникова Мария Анатольевна - зав. лабораторией экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. фарм. наук (labmedchem@mail.ru); Косоруков Вячеслав Станиславович - зав. лабораторией трансгенных препаратов ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. биол. наук (labmedchem@mail.ru).
